GBZ T 240.10-2011 化学品毒理学评价程序和试验方法 第10部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验.pdf

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1、ICS 13. 100 C 52 HZ 中华人民共和国国家职业卫生标准GBZ/T 240. 10-20门化学品毒理学评价程序和试验方法第10部分:体外哺乳动物细胞基因突变试验Procedures and tests for toxicological evaluations of chemicals一Part 10: In vitro mammalian cell forward gene mutation test 2011-08-19发布2012-03-01实施数码防伪 中华人民共和国卫生部发布剧昌根据中华人民共和国职业病防治法制定本部分。GBZ/T 240(化学品毒理学评价程序和试验方法

2、现分为以下四十四部分z一一第1部分:总则;一一第2部分z急性经口毒性试验;一一第3部分:急性经皮毒性试验;一一第4部分:急性吸人毒性试验;一一第5部分:急性眼剌激性/腐蚀性试验;一一第6部分:急性皮肤剌激性/腐蚀性试验;一一第7部分:皮肤致敏试验;一一第8部分:鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验;一一第9部分:体外哺乳动物细胞染色体畸变试验;一一第10部分:体外哺乳动物细胞基因突变试验;一一第11部分:体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验;一一第12部分:体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验;一一第13部分:哺乳动物精原细胞/初级精母细胞染色体畸变试验;第14部分:啃齿类动物显性致死试验;一一第15部分

3、:亚急性经口毒性试验;第16部分:亚急性经皮毒性试验;第17部分:亚急性吸入毒性试验;-一一第18部分:亚慢性经口毒性试验;一一第19部分:亚慢性经皮毒性试验;一一一第20部分:亚慢性吸人毒性试验;一一第21部分:致畸试验;一一第22部分:两代繁殖毒性试验;一一第23部分:迟发性神经毒性试验;一第24部分:慢性经口毒性试验;一一第25部分:慢性经皮毒性试验;一一第26部分:慢性吸入毒性试验;一一第27部分:致癌试验;一一第28部分:慢性毒性/致癌性联合试验;一一第29部分:毒物代谢动力学试验;一一第30部分z皮肤变态反应试验-局部淋巴结法;一一第31部分z大肠杆菌回复突变试验;一一第32部分z

4、酵母菌基因突变试验;一一第33部分:果蝇伴性隐性致死试验;一一第34部分z枯草杆菌基因重组试验;一一第35部分z体外哺乳动物细胞程序外DNA合成(UDS)试验;一一第36部分:体内哺乳动物外周血细胞微核试验;GBZ/T 240. 10-2011 I GBZ/T 240.10-2011 E 一一第37部分:体外哺乳动物细胞姊妹染色单体交换试验;-第38部分:体内哺乳动物骨髓细胞姊妹染色体交换试验;一一第39部分:精子畸形试验;一-第40部分:繁殖/生长发育毒性筛选试验;第41部分:亚急性毒性合并繁殖/发育毒性筛选试验;一一第42部分:一代繁殖试验;一一第43部分:神经毒性筛选组合试验;第44部分

5、:免疫毒性试验。本部分为GBZ/T240的第10部分。本部分由卫生部职业卫生标准专业委员会提出。本部分由中华人民共和国卫生部批准。本部分起草单位:广西职业病防治研究所、中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所。本部分主要起草人:陈晓琴、孙金秀、常兵、许建宁、林铮。1 范围化学晶毒理学评价程序和试验方法第10部分:体外哺乳动物细胞基因突变试验GBZ/T 240.10-2011 GBZ/T 240的本部分规定了体外哺乳动物细胞基因突变试验的目的、试验概述、试验方法、数据处理与结果评价、评价报告和结果解释。本部分适用于检测化学品引起的体外哺乳动物细胞基因突变。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应

6、用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GBZ/T 224 职业卫生名词术语GBZ/T 240.1 化学品毒理学评价程序和试验方法第1部分:总则3 术语和定义GBZ/T 240.1界定的术语和定义适用于本文件。3. 1 突变频率mutant frequency 所观察到的突变细胞集落数与存活细胞数之比值。4 试验目的通过检测受试化学品诱发体外培养的哺乳动物细胞基因突变(包括碱基对置换、移码突变和缺失等)的能力，从而评价受试化学品的致突变性及其强度。5 试验概述在加入或不加入肝微粒体酶的条件下，使细胞

7、暴露于受试样品一定时间，然后将细胞传代培养，突变细胞在含有6-琉基鸟瞟岭(6-thioguanine , 6-TG)或三氟胸昔(trifl uorothymidine , TFT)的选择性培养液中能继续分裂并形成集落。根据突变集落数可计算突变频率，从而评价受试样品的致突变性。6 试验方法6. 1 受试样晶配制选定受试样品的合适溶剂，首选元菌双蒸水作为溶剂，如果不溶于水的或水溶性低的化学品，首选GBZ/T 240.10-2011 二甲基亚酬。固体受试样品需溶解或悬浮于溶剂中，用前稀释至适合浓度;液体受试样品可以直接加人试验系统/或用前稀释至适合浓度。受试样品一般应在使用前新鲜配制。6.2 剂量水

8、平至少应设置4个可供分析的剂量。对有细胞毒性的受试样品，高剂量组的细胞存活率可为10%20%，低剂量组的细胞存活率应80%。元细胞毒性的受试样品，高剂量应达到5L/mL，5mg/mL或0.01 mol/Lo应在预试验中确定细胞毒性和溶解度，测定细胞毒性可使用指示细胞完整性和生长情况的指标，如相对集落形成率或相对细胞生长率等，应在S9系统存在或不存在的条件下测定细胞毒性。6.3 对照6.3. 1 阳性对照6.3. 1. 1 不需S9代谢活化的阳性对照物甲磺酸乙醋(ethylmethanesulphonate, CAS号62-50-0); 一一甲磺酸甲醋(methylmethanesulphona

9、te, CAS号66-27-3); 一一乙基亚硝基服(ethylnitrosourea , CAS号7:59-73-9)等。6.3. 1. 2 需要S9代谢活化的阳性对照物一3-甲基胆草(3-methylcholanthrene，CAS号56-19-5); 一-一环磷酷肢(cyclophosphamide，CAS号50-18-0); 一-N-亚硝基脏(N-nitroso-di m ethy lamine , CAS号62-75-9); 一一7，12-二甲基苯;医(7，12-demethylbenzanthracene，CAS号57-97-6); 苯井()茵(benzo(a) pyre肘，CAS

10、号50-32-8)等。6.3.2 阴性对照6.3.2.1 溶剂对照溶剂应为非致突变物，不与受试样品发生化学反应，不影响细胞存活和马活性。首选溶剂是水或水溶性溶剂，亦可使用二甲基亚枫(DMSO)，但浓度不应大于0.5%。6.3.2.2 空白对照如果没有文献资料或历史资料证实所用榕剂元致突变作用时应设空白对照。6.4 细胞株用于本试验的细胞株对化学致突变物应具有明确的敏感性，高度的繁殖能力以及稳定的自发突变率。应检测细胞是否被支原体感染，若己被感染则不能使用。HPRT位点突变分析常使用中国仓鼠肺细胞株(V79)和中国仓鼠卵巢细胞株(CHO)，TK位点突变分析常用小鼠淋巴细胞株(L5178Y)和人类

11、淋巴细胞细胞株(TK6，WTK1等)。6.5 试剂配制6.5. 1 完全培养渣应根据试验所用系统和细胞类型来选择适宜的培养基。对于L5178Y或TK6细胞，常用PRMI1640培养基加入10%马血清和适量抗菌素(青霉素100IU/mL、链霉素100g/mL)。对于V79或CHO细胞，常用MEMCEagle)培养基加入10%胎牛血清和适量抗菌素。6.5.2 血清处理GBZ/T 240. 10-2011 将过滤除菌后的小牛血清或马血清放入56.C水浴中，保温30min以灭活补体，然后分装，保存于一20.C备用。6.5.3 代谢活化系统肝微粒体酶CS9混合液)。6.5.4 无钙镜的磷酸盐缓冲液(无钙

12、镶P圃，pH为7.27.4)成分磷酸二氢饵CKHzP04)磷酸氢二铀CNazHP04 12HzO) 氧化饵CKCl)氧化铀CNaCl)双蒸水(压力蒸气灭菌)6.5.5 膜蛋白酶.EDTA溶液0.20 g 2.89 g 0.20 g 8.00 g 1000 mL 分别用元钙镜PBS配制膜蛋白酶与EDTA铀盐榕液，膜蛋白酶溶液浓度为0.05%，EDTA铀盐溶液浓度为0.02%，两溶液按1: 1 1昆合，存放于一20.C冰箱备用。6.5.6 姬姆萨染渡取姬姆萨染料3.8g，置玛瑶乳钵中，加少量甲醇研磨。逐渐加甲醇至375mL.待完全溶解后，再加125 mL甘袖，放入37.C温箱中保温48h.保温期间

13、振摇数次，使充分溶解。取出过滤.2周后使用，作为姬姆萨染液原液。使用时，取1份姬姆萨染液原液，与9份1/15mol/L磷酸盐缓冲液CpH6.8)混合。6.5.7 选择剂6-琉基鸟瞟岭C6-TG)建议使用最终浓度为5g/mL;三氟胸昔CTFT)建议使用最终浓度为3g/mL。6.6 试验步骤6.6.1 HPRT位点突变分析CV79)6. 6. 1. 1 细胞准备将5X 105个细胞接种于含完全培养液的直径为100mm的平皿中，除未处理对照组外，每组3个平皿。于37.CCOz培养箱中培养24h. 6.6. 1. 2 接触受试样晶吸去上述供试培养皿中的培养液，用无钙镜PBS洗2次。将含有细胞的培养皿分

14、为两大组，一组加S9混合液，另一组不加S9混合液。加S9混合液组，在培养皿中加入2mLSg混合液，对不加S9混合液组，则用2mL元血清培养液代替，再加不同剂量受试样品的供试液，最后不含血清的培养液补足至10 mL.并将培养皿置COz培养箱中培养3h6h。处理结束后，吸去培养皿中液体部分，用元钙镜PBS洗涤细胞2次，再加入完全培养液10mL.在COz培养箱中培养19h22 h。阳性和阴性对照组也分为加与不加S9混合液两个组，操作方法同上。3 GBZ/T 240.10-2011 6.6. 1.3 表达将培养物用膜蛋白酶-EDTA消化，待细胞脱落后，加入完全培养液，终止消化。?昆匀、计数并进行表达和

15、细胞毒性测定。表达时，以5X105个细胞接种于直径为100mm的平皿中。培养6d8 d后，分传一次，仍接种5X105个细胞，培养3d后再进行突变体的选择及集落形成效率(CFE)的测定。6.6. 1. 4 细胞毒性测定将上述消化计数后的细胞，每个平皿接种200个，每组5个平皿，于37.C CO2培养箱内培养7d. 取出样本，固定并进行姬姆萨染色后，计数各平皿的细胞集落数。以相对CFE值表示细胞的毒性。6.6. 1. 5 突变体的选择及集落形成率的测定表达结束后，消化细胞，分别接种，每组5个平皿，每个平皿接种2X 105个细胞。待细胞贴壁后加入6-TG，终浓度为5g/mL。放入CO2培养箱培养7d

16、10 d。固定后进行姬姆萨染色，计数平皿内集落数，并计算其突变频率(MF)。6.6.2 TK位点突变分析6.6.2. 1 取生长良好的细胞，调整密度为5X 105 /mL，按1%体积加入受试样品，37.C震摇处理3h。离心，弃上清液，用PBS或不含血清的培养基洗涤细胞2遍，重新悬细胞于含10%马血清的PRMI1640培养液中，并调整细胞密度2X105/mL。6.6.2.2 PEo (0天的平摄接种效率)测定取适量细胞悬液，作梯度稀释至8个细胞/mL，接种96孔板(每孔加0.2mL，即平均1.6个细胞/孔)，每个剂量作1块2块板，37 c , 5 % CO2 ，饱和湿度条件下培养12d，计数每块

17、平板的集落生长的孔数。6.6.2.3 表达对步骤6.6.2.1所得细胞悬液作2d表达培养，每天计数细胞密度并保持密度在106/mL以下。6. 6. 2. 4 PE2 (第2d的平板接种效率)测定第2天表达培养结束后，取适量细胞悬液，按步骤6.6.2.2作稀释梯度并接种96孔板，培养12d后计数每块平板有集落生长的孔数。6.6.2.5 TFT抗性突变频率(MF)测定第2天表达培养结束后，取适量细胞悬液，调整细胞密度为1X104/mL，加入TFT(三氟胸昔，终末浓度为3g/mL)，混匀，接种96孔板(每孔加0.2mL，即平均2000个细胞/孔)，每个剂量作2块4块板，37.C, 5% CO2，饱和

18、湿度条件下培养12d，计数有突变集落生长的孔数。7 数据处理与结果评价7.1 HPRT位点突变分析接下列公式计算有关指标绝对CFE=形成集落数/接种细胞数;相对CFE=(试验组绝对CFE/溶剂对照组绝对CFE)X100%; 一一突变频率(MF)二(突变集落数/接种细胞数)X (1/绝对CFE);一一试验结果用x2检验进行统计学处理。7.2 TK位点突变分析按下列公式计算有关指标7.2. 1 平板效率(PEo和PE2)平板效率计算见公式(1)。4 GBZ/T 240. 10一2011式中:EW 无集落生长的孔数;TW 总孔数;1.6一一每孔接种细胞。7.2.2 相对存活率相对存活率计算见公式(2

19、)。PE=一In(EW/TW)1. 6 . ( 1 ) 相对存活率(RSR，%) =Eo (处理x 100% . ( 2 ) PEo(对照)7.2.3 突变频率(MF)突变频率计算见公式(3)。式中:EW 元集落生长的孔数;TW 总孔数;一In(EW/TW)/n MF(X 106) = 1. 6 n 每孔接种细胞数(2000)。7.3 评价原则7.3.1 在下列两种情况下可判定受试样品在本试验系统中为阳性结果:受试样品引起突变频率的增加具有统计学意义、并有剂量-效应关系。受试样品在任何一个剂量条件下，引起具有统计学意义，并有可重复性的阳性反应。. ( 3 ) 7.3.2 阴性结果的判定需在相对

20、存活率(relativesurvival rate ,RSR) 20 % (即已产生明显细胞毒性)的情况下未见突变频率显著增加时方可作出。评价时应综合考虑生物学和统计学意义。8 评价报告除GBZ/T240. 1规定的一般项目外，评价报告还应包括以下内容:a) 所用溶剂及其配制、剂量选择(应说明受试样品的细胞毒性测定方法、溶解情况等hb) 细胞株名称;c) 试验条件和方法:一一阳性对照物名称和使用浓度、S9混合液的制备与配方;一一所用培养液名称、血清类别和使用浓度;一-接种时的细胞密度以及所用培养瓶的规格;一一受试样品与试验系统的接触时间;一-一表达时间;一一一结果评价方法。d) 结果:一一受试

21、样品高剂量的确定及结果，包括细胞毒性的测定、溶解情况、对pH的影响(如果有影响); 剂量组和对照组的突变频率及统计结果;5 GBZ/T 240. 10-2011 一一阳性对照组和阴性对照组(包括常用溶剂，如DMSO)在本实验室历史上突变频率范围，均值和标准差(说明样品数); 一一结论。9 结果解释阳性结果表明在本试验条件下受试样品可引起所用哺乳动物细胞的基因突变。阴性结果表明在本试验条件下受试样品不引起所用哺乳动物细胞的基因突变。6 FFONio-O叮NHN阁。华人民共和国家职业卫生标准化学品毒理学评价程序和试验方法第10部分:体外哺乳动物细胞基因突变试验GBZ/T 240.10-2011 国中等中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销 印张O.75 字数13千字2011年10月第一次印刷开本880X12301/16 2011年10月第一版祷15号:155066 2-22223 16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533定价GBZ/T 240.10-2011 打印H期:2011年11月18HF002