GB T 31795-2015 番茄黑环病毒检疫鉴定方法.pdf

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1、ICS 65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准GB/T 31795-2015 番茄黑环病毒检疫鉴定方法Detection and identification of Tomato black ring virus 2015阳07-03发布2015-11-27实施户均气中华人民共和国国家质量监督检验检瘦总局也士中国国家标准化管理委员会a叩中华人民共和国国家标准番茄黑环病毒槌瘟鉴定方法GB/T 31795-2015 锋中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平墨西街甲2号(100029)北京市西城区三里凋北街16号(100045)网址总编室1(010)68533533发行中心1(010)

2、51780238读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销 开本880X 1230 1/16 印张1.25字数29千字2015年8月第一版2015年8月第一次印刷* S号:155066 1-49526定价21.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107GB/T 31795-2015 前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本标准起草单位=中华人民共和国上海出人填检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国北

3、京出入境检验检疫局。本标准主要起草人z杨翠云、于翠、郭京泽、魏亚东、邓丛良、乔艳艳、崔学慧、胡培龙、孙娟。I GB/T 31795-2015 番茄黑环病毒检疫鉴定方法1 范围本标准规定了番茄黑环病毒的DAS-ELISA、RT-PCR、免疫磁珠RT-PCR、实时荧光RT-PCR、鉴别寄主检测和免疫电镜等检疫鉴定方法。本标准适用于植物材料，包括元性繁殖材料、种子和苗木中番茄黑环病毒的检疫鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T 1840 植物病毒免疫电

4、镜检测方法SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样3 仪器设备、设施、用具和试剂3.1 仪器设备酶标仪、PCR仪、实时荧光PCR仪、超净工作台、电子天平感量0.001g)、电泳仪、电泳槽、凝肢成像系统、电子透射显微镜、水浴锅、高速冷冻离心机、超低温冰箱(-80c)、高压灭菌锅、制冰机、微波炉、涡旋振荡器.3.2 设施植物隔离检疫圃.3.3 用具可调式微量移液器(2L、10L、100L、200L、1000L)及相应的无RNase吸头、无RNase离心管、PCR管、研钵、样品袋、标签、慑子、放大镜、磁力架等。3.4 主要试剂除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂。TBRV抗体、

5、磁珠(具有超顺磁性的聚苯乙烯珠子，直径280nm，表面标记有甲苯磺酷基)、Trizol、焦碳酸二乙醋(DEPC)、液氮、三氯甲娟、异戊酶、异丙蹲、乙蹲、AMV反转录酶、RNA酶抑制剂、TaqDNA聚合酶、DNA分子标记、澳化乙健、琼脂糖、澳酣蓝等。血清学和分子生物学检测试剂配制见附录B.4 症状观察及抽样4.1 症状观察现场检疫主要观察进境植物材料上病毒为害的症状，TBRV为害症状描述参见附录A.1 GB/T 31795-2015 4.2 抽样发现有病毒为害症状的植物材料直接送检s未发现症状的，则按SN/T2122中规定进行抽样，并送实验室检疫鉴定。5 幢幢鉴定5.1 双抗体央，t酶联免瘟眼附

6、方法(DAS-ELISA)对种苗、球茎或由种子催生长出的叶片研磨，并加入抽提缓冲液按1: 10(质量2体积的比例稀释，制备的汁液分别盛装于离心管中，离心后吸取上清液作为待测样品，并设阳性对照、阴性对照和空白对照。具体操作步骤见附录C。5.2 RT-PCR方法将种苗、种球或种子催生长出的叶片被氮研细，取0.1g用于提取植物总RNA.具体操作步骤见附录D。5.3 免瘟磁珠RT-PCR方法首先进行免疫磁珠的分离，包括:清洗磁珠、抗体包被和抗原吸附，然后RT-PCR反应。具体操作步骤见附录E。5.4 实时荧光RT-PCR方法将种苗、种球或种子催生长出的叶片液氮研细，取0.1g用于提取植物总RNA.具体

7、操作步骤见附录F.5.5 鉴别寄主测定方法在裁种于植物隔离检疫圃中的鉴别寄主植物真叶长出后用于摩擦接种，对DAS-ELISA或RT-PCR检测TBRV呈阳性的样晶，加人适量接种缓冲液研磨后接种鉴别寄主，当任意一种鉴别寄主植物出现如下描述症状时，即可判定接种成功za) 昆诺黎(Chenopdiumquinoa)或宽色藕(Chenodiumamaranticolor) :接种叶出现局部褪绿斑，然后出现系统褪绿斑驳。b) 黄瓜(Cucumissati四s)I接种叶出现局部褪绿斑或小型坏死环斑或黄斑，后出现系统环线脉，畸形。c) Prince莱豆(Phaseolusvulgaris var.Princ

8、e):接种叶出现局部褪绿、坏死或畸形。d) 矮牵牛(Petuniahybrida) :接种叶出现局部枯斑或坏死环斑，然后出现系统褪绿环斑、线纹或明脉。e) 番杏(Tetragoniaexansa) :接种叶出现细轮纹，后出现环斑。f) 黄花烟(Nicotianarustica) I接种叶产生局部褪绿、坏死斑或环斑。g) 白肋烟(N.tabacum White burley)或三生烟(N.tabacum Samsun NN):接种叶产生局部坏死环和斑点，系统斑点、环或者线条斑。h) 克利夫兰烟(N.clevelandii):接种后接种叶产生局部环斑。5.6 免擅电镜方法利用番茄黑环病毒抗血清富集

9、植物材料中的病毒，在透视电子显微镜下观察病毒粒子的形态特征，2 GB/T 31795-2015 具体操作步骤按照SN/T1840规定进行。如观察到直径为28nm的球状病毒粒子大量聚集或者有被抗体修饰的现象，即可判定免疫电镜结果阳性。6 结果判定样品经DA5-ELISA或者RT-PCR检测结果为阴性，判定该样品不携带番茄黑环病毒。样品经DA5-ELISA检测为阳性，如果RT-PCR或者免疫磁珠RT-PCR结果阳性，且序列测定结果证实与所检测的番茄黑环病毒一致p或者经实时荧光RT-PCR检测为阳性时，可判定样品携带番茄黯环病毒。样品经DA5-ELISA或者RT-PCR检测结果为阳性，经免疫电镜观察

10、到病毒颗粒或者接种鉴别寄主植物出现相应的症状时，可判定样品携带番茄黯环病毒。7 梓晶保存与记录7.1 梓晶保存经检测确定携带番茄黑环病毒的样品，应妥善保存在适合的条件下以备复核。如种子保存在干燥室温环境中F种苗、鳞球茎等样品保存在一80C冰箱中，做好登记和标记工作。7.2 记最样品来源、种类、取样人员、实验的时间、地点、方法和结果、检疫员的签字等。酶联免疫吸附测定法检测应有酶联板反应的数值，生物学测定应有鉴别寄主的症状照片，免疫电镜检测需要有电镜固片，RT-PCR和免疫磁珠RT-PCR检测应有电泳图及序列测定分析结果。实时荧光RT-PCR检测需要有荧光曲线图与Ct值。3 GB/T 31795-

11、2015 A.1 番茄黑环病毒基本信息中文名z番茄黑环病毒学名ITomato black ring virus 缩写ITBRV附录A(资料性附录番茄黑环病毒相关信息分类地位E虹豆花叶病毒科(Como臼ridae)，线虫传多面体病毒属(Nepoirus)。传播途径z由土壤腐生线虫长针线虫属(Longidorussp.)传播，线虫介体只能短距离传播。TBRV可在超过15个属的24种以上的植物中种传，通过种子和土壤随运输过程传播，被害多年生植物的繁殖材料也可以传播病毒。A.2 方法原理病毒粒子的形态特征、为害症状、血清学特性和分子生物学特征是检疫鉴定该病毒的主要依据。采用DA8-ELISA、RT-P

12、CR、免疫磁珠RT-PCR、实时荧光RT-PCR、免疫电镜和鉴别寄主反应等方法进行番茄黑环病毒的检疫鉴定。番茄黑环病毒有很多株系，所以异名较多z大豆环斑病毒Beanringspot virus;甜莱环斑病毒Beetringsot virus;芹菜黄脉病毒Celeryyellow ve切virus;离宦环斑病毒Lettuceringspot virus;马铃薯柬状病毒Potatobouquet vin门马铃薯伪奥古巴病毒Potato如何do-aucubavirus.其中，甜菜环斑病毒的核背酸序列与TBRV其他株系的核背酸序列差异较大，附录F的实时荧光RT-PCR方法不适合甜菜环斑病毒的检测。根据

13、血清学上的差异，番茄黑环病毒的栋系主要属于两个血清型z苏格兰血清型(S)和德国血清型(G). S血清型主要是离宦环斑株系和马铃薯束状株系;G血清型主要是甜菜环斑株系和马铃薯伪奥古巴株系.而芹菜黄脉株系则居于二者之间。A.3 生物学特性A.3.1 主要寄主番茄黑环病毒的寄主范围很广，可以广泛侵染单子叶、双子叶的草本和木本植物。包括其中重要的经济作物，如葡萄和其他果树、甜菜、马铃薯和蔬菜葱属、甜菜属、芸墓属、高宦属、番茄属和莱豆属的一些种以及观赏植物，它还能侵染乔木和灌木以及一些杂草品种。主要寄主包括E番茄(Ly严co呻persiconesculentum)，韭葱(Alli叩umorrum)，芹菜

14、(AHgraveolens) ，甜菜(Beta四t让ga旷risva町r.saccharifera)，高宦(Lactucasativa)，莱豆(Phaseolus vulgaris) ，马铃薯(Solanumtuberosum)，黄瓜(Cucumissativus)，朝鲜前(Cynarascolymus)，唐葛蒲(Gladiolus hybrids) ，黑莓(Rubus卢uticosus)，覆盆子(Rubusidaeus)，茄子(Solanummelongena)，葡萄(Vitisvini如a)，黑穗睛栗(Ribesnigrum)，桃子(Prunuspersica)，瑞典芜菁(Brassica

15、naus var napobrassica) ，芫菁(Brassicaraa) 水仙(NarcissusLinn.).津惠(Alliumcepa) ，甜椒(Casicuman-GB/T 31795-2015 nuum) ，草莓(Fragariaananassa) ，欧丁香(Syringavulgaris)，金连翘(Forsythiaintermedia)等。A.3.2 野生寄主野生寄主包括z西佯接骨木(Sambucusnigra)，荠莱(Capsella仇trsa-pastor)，宝盖草(Lamiumam plexicaule )等。A.3.3 曼影晌的植物部分整株、叶片、果实/英。A.3.4

16、 为害症状作物和杂草被害后很少有症状或无症状，但影响植物的生长。生长不良的植株在田间块状分布，而且逐年扩展。通常早春症状比较明显，而生长旺季的夏季不明显.TBRV为害覆盆子(Ru伽sidaeus)时，可造成不同栽培品种的红覆盆子矮化、褪绿斑驳、环斑、叶片卷曲或者果实变形易碎，产量降低。当与覆盆子环斑病毒同时出现时，病情加重，加速植物死亡。TBRV为害草莓时，依据不同的栽培晶种或年限，可导致草莓变色、斑点和环斑，后期叶片可能无症状，但在随后几年中症状会回复，并进一步矮化，最终死亡。TBRV为害甜菜和离宦引起环斑F为害马铃薯形成坏死黑斑，造成花束状病害和伪奥古巴病害E为害芹菜、接骨木和其他一些灌木

17、引起黄脉症状z为害洋藩造成叶片的黄色斑点、条纹和变形等。A.3.5 传播方式番茄黑环病毒由土壤腐生线虫长针线虫属(Longidorussp.)传播。线虫的幼虫和成虫均可传播病毒，但病毒无法在介体中增殖，蜕皮后不再带毒，也不能随卵传给后代。L.elongatus在休耕土壤中能保持侵染性达9周。线虫介体只能短距离传播。TBRV可在超过15个属的24种以上的植物中种传，并能通过花秘和胚珠发生种传，特别是一些农作物和杂草经常发生种传现象，使得病毒的传播更为广泛。许多植物种传率超过10%，甚至达到100% ，如甜菜、黄豆、高宦和番茄的种传率分别为:3%.，7%、83%、3%和20%。很多植物通过种传侵染

18、表现无症。病毒通过父本和母本传到悬钩子和草莓的种子，但是通过带有病毒的花粉进行授精并不侵染。在一些杂草种子中，TBRV的侵染延迟萌芽。病毒还可以通过种子和土壤随运输过程进行传播，被害多年生植物的繁殖材料也可以传播病毒。A.4 分布欧洲z克罗地亚、捷克、丹麦、芬兰、法国、德国、希腊、匈牙利、爱尔兰、意大利、摩尔多瓦、荷兰、挪威、波兰、葡萄牙、罗马尼亚、俄罗斯、西班牙、瑞典、英国、南斯拉夫。亚洲z中国、印度、日本、土耳其。非洲z肯尼亚、摩洛哥。美洲z巴西、加拿大、美国。大洋洲z加罗林群岛，A.5 病毒桩体形奋病毒粒子为直径约28nm的正二十面体结构(T=口，蛋白质外壳的相对分子质量为57000，由

19、60个多肤亚单位组成。5 h GB/T 31795-2015 A.6 基因组番茄黑环病毒由两条单链RNA组成，德国血清型的RNA-1为7356 nt ，RNA-2为4662nt ;苏格兰血清型的RNA-2为4618旧。某些分离物含有1375旧的卫星RNA0 RNA-1可独立于RNA-2复制，但两个基因组RNA是侵染植物所必需的.每个RNA都在3未端含有多聚腺昔酶，在5末端均含有基因组结合蛋白质。RNA-2包含编码病毒外壳蛋白的基因。6 B.1 10 XPBST罐冲撞(pH7.4) 附录B规范性附景试剂配制氟化铀(NaCD80.0 g 磷酸氢二铀(NazHPO.)11.5 g 磷酸二氢饵(KH2

20、P04)2.0 g 氯化饵(KCD2.0 g 吐温-20(Tween-20) 5 mL 加入900mL水溶解，调pH到7，4，然后补水至1L. B.2 样晶抽提缓冲撞(pH7.4) 10XPBST 亚硫酸铀(Na2S0a)聚乙烯毗咯烧酣(PVP)(MW24 000-40 000) 100 mL 1.3 g 20 g 叠氟销(NaNa)0.2 g 加入800mL水溶解，调pH到7，4.然后补水至1L , 4 c储存。B.3 包被缓冲渡(pH9.6) 碳酸铀(NazCOa)1.59 g 碳醺氢铀(NaHCOa)2. 93 g 叠氮铀(NaNa)0.2 g 加入900mL水榕解，调pH到9.6.然后

21、补水至1L.4 C储存。B.4 酶标抗体锺冲撞(pH7.4) 10XPBST缓冲液牛血清白蛋白(BSA)聚乙烯毗咯烧酣(PVP)(MW24000-40 000) 溶于800mL蒸锢水后，调pH至7.4.定容至1L. B.5 底物(pNPP)缓冲蘸(pH9.8) 100 mL 2g 20 g 氧化镜(MgClz)0.1 g 叠氮铀(NaNa)0.2 g 二乙薛胶97 mL 溶于800mL蒸锢水中，调pH至9.8，蒸锢水定容至1L, 4 C储存。GB/T 31795-2015 7 GB/T 31795-2015 B.6 反应鳝止渡氢氧化铀(NaOH)120g榕于1000mL的无菌蒸锢水中，浓度为3

22、mol/L。B.7 电i*辑冲撞TAE(50X)三起甲基氨基甲烧(Tris)冰乙酸乙二胶四乙酸二锅(EDTA，0.5mol/L) 用时加蒸馆水稀择至lXTAE.B.8 混化乙键(EB)踏溃。oJ&g/J丘，)澳化乙键灭菌去离子水B.9 缓冲撞B(O.lmol/L翻醋缓冲撞，pH9.5) 242 g 52.1 mL 100 mL 20 mg 20 mL 跚酸(H3B03)6.183 g 溶解于800mL去离子水中，以5mol/L NaOH调pH至9.5并定容至1000mL。B.l0 缓冲液c磷酸盐锺坤渡(含O.l%BSA)pH 7.4J 氧化铀(NaCD0.88 g 牛血清白蛋白(BSA)O.l

23、g 溶解于80mL 0.01 mol/L磷酸铀缓冲液中，调pH至7.4，彻底混句并定容至100mL。B.l1 缓冲渡D(0.2 mol/L Tris pH 8.5和1g/L BSA) 2.42 g Tris禧于80mL去离子水中，用1mol/L HCl调pH至8.5。然后加入0.1%BSA至100 mL. 8 GB/T 31795-2015 附录C(规范性附录双抗体夹心酶联兔瘟眼附测定(DASEL脑A)C.1 栓副C.1.1 根据检测需要将适量的孔条放于酶联板架上，包括2个阳性对照孔，2个阴性对照孔，2个空白对照孔和多个待检测样品孔。待测样品孔每个样品重复2次。C.1.2 每孔加入100L的T

24、BRV的包被抗体榕攘，封口膜包好，37C孵育2h ,., 4 h(或4C冰箱过夜。C.l.3 将酶联板孔中溶被控干，用200L的1XPBST洗涤被洗涤酶联极3次，每次3min，然后在滤纸上扣干。C.l.4 将100L待测样品榕被加入到待检测孔中，对照孔中也各加入100L相应的阴性对照、阳性对照和空白对照。封口膜包好，37C孵育2h3 h(或4C冰箱过夜)。C.1.5 洗涤，步骤同C.1.3.C. 1.6 用酶标抗体稀释缓冲液按照要求稀释酶标抗体，每孔加入100L酶栋抗体榕液，封口膜包好，37 c孵育2h4 h. C. 1.7 洗攘，步骤同C.1.3.C. 1.8 将pNPP榕于底物缓冲液中，使

25、最路浓度为1mg/mL。每孔加入100L配好的底物榕液，室温孵育0.5h-2 h。必要时每孔加入50L的3mol/L氢氧化铀溶液终止反应。C.l.9 酶标仪405nm波长下检测各孔的吸收值并记录。注s若采用商品化试剂盒，则按照试剂盒的说明进行操作。C.2 结果判定C.2.1 质量捶制要求援冲液孔和阴性对照孔的00.05值小于0.15，阴性对照孔的0015值小于0.05时，按0.05计算.阳性对照有明显的颜色反应，孔的重复性以样品00值的平行允许率控制，按照式(巳1)进行计算t001- 00 p=-._-、?a:;:X 100% . . . . . . . . . ( C.l ) 式中zP 一一

26、平行允许率g001-重复样品1的00值F002一一重复样品2的00值。当重复检测样品00值平行允许率(P)小于20%时，判定检测结果有效。C.2.2 判定原则若满足不了C.2.1的质量要求，则不能进行结果判定。在满足了C.2.1的质量要求后，则按如下原则作出判定E9 GB/T 31795-2015 样品00.削/1男性对照00.削值明显大于2，结果判定为阳性F样品OD，os/阴性对照OD，os值在阔值附近，判为可疑样品，需重做一次或者用其他方法进行验证F样品OD，os/阴性对照OD05值明显小于2，判为阴性。10 GB/T 31795-2015 D. 1 引物序列酣最D规范性附录RT-PCR方

27、法上游引物TBRV-F723:5-CCCTAGAAGTGAGCCTATG-3 下游引物TBRV-R723:5-TCAGG T AGGAGTTTCGCAG-3 扩增片段长度723坤，D.2 RNA提取D.2.1 适量待测样品掖氮研细，然后取0.1g放到新的1.5mL离心管中，加入1mL Trizol，混匀。D.2.2 加入0.2mL三氧甲饶，猛烈振荡15s.4 C 11 000 r/min离心10min，小心吸取上层无色水相到新离心管中。D.2.3 加入等体积异丙酶，混匀.-20C静置10min, 4 C 12 000 r/min离心15min，保留沉淀。D.2.4 加入1mL 75%冷乙醇，悬

28、浮沉淀，4C 8 000 r/min离心10min.干燥沉淀。D.2.5 加入30LDEPC-H20.潜解沉淀(必要时，55C-60 C水浴10min，加速溶解).存于一80c 备用。注g或者按照植物总RNA提取试剂盒说明进行操作.D.3 反转录反应体系及反应条件见表D.l，试剂加样量可根据具体情况进行适当调整。也可采用RT-PCR一步法试剂盒，操作步骤按使用说明进行。囊D.1反转录反应体系与反应条件名称储存液浓度终浓度加样量/L下游引物:to ,.mol/L 1.0 f1mol/L 1 RNA 2 HzO 8 上述混合物于70c温育5min;立即置于冰上，1min，加人下列试剂缓冲液5X 1

29、X 4 dNTP 10 mmol/L 1.0 mmol/L 2 RNA酶抑制剂40 UIL 2 UIL 1 AMV 5 UIL 。.5U/,.L 2 总体飘20 反转录反应条件:42c , 50 min;85 c ,5 min立即置于冰上，此时得到的是病毒cDNA.如果不立即进行PCR扩增，应将反转录产物置于-20c保存.11 GB/T 31795-2015 0.4 核醺扩增PCR反应体系见表D.2，每个样品设2个平行处理。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。检测时以含番茄黑环病毒材料的cDNA或含有番茄黑环病毒材料目标片断的质粒作为阳性对照，以健康植物材料的cD

30、NA作为阴性对照，以水代替模板作为空白对照。PCR反应条件194C 3 min;94 c 30 s、58c 45 8、72C 45 8，30个循环;72C 10 min延伸。表D.2PCR反应体系试剂名称终浓度IOXPCR反应缓冲液lX I MgClz 2.0 mmol/L dNTPs 0.2 mmol/L 上游引物0.16mol/L 下游引物0.16mol/L Taq DNA聚合酶1.5 U DNA模板2.5L 补HzO至25L 0.5 琼脂糖凝肢电泳检测0.5.1 制备凝肢用lXTAE配制1.5%琼脂糖凝胶，加热椿化后冷却至55c左右。0.5.2 加混化Z键将澳化乙镀(EB)加入到配制好的

31、凝胶中，EB终浓度为0.5g/mL.将凝胶倒入凝胶槽中，插上样品梳子。冷却凝固后拔掉梳子，在电泳槽内加入1XTAE，缓冲液要没过凝肢表面约1mm. 0.5.3 加样将加样缓冲掖与样品混合后加入样品孔，同时设计PCR的阴性对照和阳性对照，并加入相对分子质量标准物(Marker)。0.5.4 电泳接通电源，以3V/cm., 5 V/cm电场强度进行电泳，0.5h后观察结果。0.5.5 结果观察电掠结束后，将整个凝肢置于凝胶成像系统上观察，记录结果。0.6 结果判定如果阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照出现723bp大小的条带，样品未出现723bp大小GB/T 31795-2015 的条带，则可

32、判定样品为番茄黑环病毒阴性。如果阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照出现723bp大小的条带，样品出现723bp大小条带，可通过测序的方式进一步确认。如果PCR产物序列与番茄黑环病毒的序列同源，则可判定样品为番茄黑环病毒阳性，若序列不同摞，则可判定样晶为番茄黑环病毒阴性.13 GB/T 31795-2015 附录E(规范性附录免瘟磁珠RT-PCR方法E.1 免瘟磁珠分离E. 1. t 磁珠清洗取充分混句后的磁珠5L加人到0.2mL PCR管中，加入100L的缓冲液B后充分混匀井离心，PCR管于磁性分离架上静置约2min.至磁珠贴壁、液体部分澄清透明后吸去清液。该清洗过程重复3次，彻底清挽磁珠

33、，以备后用。E.1.2 抗体包被用包被缓冲撞稀释抗体到所需浓度，在巳清洗的磁珠中分别加人100L抗体溶液，充分混匀后置37.C孵育器中旋转悬挂16h.18 h。取出离心，放于磁性分离架上静置约2min.磁珠贴壁后吸除清攘，分别加入100L缓冲被C4.C清洗5min.重复清洗3次F再分别加入100L缓冲被O.充分混匀后37c悬挂4h.最后用缓冲液C4C清f5t5 min. 已经包被抗体的磁珠可以直接用于抗原吸附。若暂时不用，也可保存于缓冲液C中，在4.C的温度条件下可保存数月，为避免滋生细菌，可加0.02%的叠氮锅。E. 1.3 抗原眼附取带毒叶片50mg置于研钵中，加入1mL病毒提取缓冲液研磨

34、均匀.8000r/min离心5min.加入到包被有抗体的磁珠中，用枪头轻轻吹打1min.提合均匀s将此悬浊液置37.C孵育器中2h.过程中始终保持离心管的旋转振荡，避免磁珠沉淀到管底，影响吸附效果F将包被好抗原的磁珠放于磁力架上吸附2min左右，待磁珠贴壁，液体部分澄清透明，去除清液，备用。将吸附好抗原的磁珠用无RNase的水漂洗.5000 g 30 s离心沉淀磁珠。E.2 cDNA第一链的合成直接在吸附了病毒的带有磁珠的离心管中进行反转录。反转录体系总体积为20L.其中1L反向引物(20mol/L).4L5XAMV酶缓冲液.2LdNTPOO mmol/L) .10L无RNase水，稍离心混匀

35、后置于85.C孵育器中变性5min.迅速置冰上2min.3 min.然后迅速加入2LAMV反转录酶(5 U/L) .1LRNA酶抑制剂(40U/L) .42 .C反应1h. E.3 PCR反应具体操作步骤见0.4和0.5.E.4 结果判定结果判定见0.6.14 附录F规范性附录实时荧光RT-PCR方法F.1 实瞌步骤F.1.1 引物和探针设计引物序列z上游引物TBRV-FP:5-TCGTTTCTTGCAGTTTGCGTAT-3下游引物TBRV-RP:5-GTGGCAAAGAAGGGAGACTGTATT-3探针序列:TBRV-MGB-PROBE: F AM-CACAGAT ACCACATGTGG

36、A-MGB F.l.2 RNA提取及反转录操作方法见D.2和D.3.F.l.3 实时黄先PCR反应体系GB/T 31795-2015 实时荧光PCR反应体系见表F.1，每个样品设2个平行处理。并设阳性对照、阴性对照和空白对照，以含有番茄黑环病毒的cDNA为阳性对照;以健康植物材料或线虫传多面体病毒属其他病毒的cDNA作为阴性对照p以水代替DNA模板作为空白对照。每种对照各做2个平行管.囊F.1实时黄先PCR反应体系试剂名称终浓度10XPCR反应缓冲液lX MgCl, 3.0 mmol/L dNTP 0.2 mmol/L 上游寻l物0.24mol/L 下游寻l物0.24mol/L Taq DNA

37、聚合酶lU 探针0.4mol/L DNA模板2L 补HzO至25L F.l.4 实时荧光PCR反应参鲸反应条件:预变性94C 10 mio, 94 c 15 5 , 60 C 40 5，共40个循环.本反应条件适用于ABI7500型荧光PCR仪，如使用其他荧光PCR仪，可根据仪器性能进行适当调整。操作方法按照仪器的使用说明进行，反应结束后保存各项数据和图像.的FONlmhF伺H阁。GB/T 31795-2015 结果判定F.2 阔值设定阔值设定根据仪器噪音情况进行调整，或以阔值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准。F.2.1 结果判定在阳性样品和阴性样品Ct值正确的情况下，进行以下判定=一一待测样品的Ct值为40或元Ct值时，则判定结果阴性。-一待测样品的Ct值小于或等于35时，则判定结果阳性。一一待测样品的Ct值小于40且大于35时，应重新进行测试，如果重新测试的Ct值为40时，则判定结果阴性。如果重新测试的Ct值小于40且大于35时，则判定结果阳性。F.2.2 究刑必拍板L侵铮有切专臼极主川版非定价g21.00元GB/T 31795-2015