YY T 1295-2015 医疗器械生物学评价 纳米材料 细菌内毒素试验.pdf

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1、ICS 11.040.30 C 30 中华人民共和国医药行业标准YY /T 1295-2015 医疗器械生物学评价纳米材料:细菌内毒素试验Biological evaluation of medical devices一呵Nanomaterial : Endotoxin test ISO 29701: 2010 , Nanotechnologies-Endotoxin test on nanomaterial samples for in vitro systems-Limulus amebocyte lysate(LAL) test,MOD 2015皿03-02发布，币。壁3):.，/、飞/

2、 ，i竹啊俨巳响法也.-扫雪2016回01-01实施国家食品药晶监督管理总局发布次目YV/T 1295-2015 iiindnLqaqdaayphuhxu 件和和和影和附附附附附瞅川备备告性性性性性引定准制法价报料料料料料性和语前晶晶方评验啧啧啧啧啧札围范语略验试试验果试ABN言范规术缩试供供试结录录录录录如前附附附附附参I 2 8 3 4 5 6 7 9 . 6 堂试验潜在干扰的举例凝胶法终点光度法. . . . . . . . . . . . . . . 11 动态法.本标准与国际标准章条编号对照一览表和技术性差异及原因一览表. 16 7 . . . . . . . . 8 10 YY/T

3、 1295-2015 前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准修改采用ISO29701 :2010(2010版附录!1lE.8.3.3.2 堂试剂反应的最佳pH在68之间。当试验被抑制时应测量试验样品和堂试剂组成的反应棍合物的pH值.如果应调整pH.要调整试验样品的pH使反应混合物的pH在上述最佳pH范围内。注1:调整pH时，可使用无内毒素的TRIS缓冲掖，0.1mol/L的氢氧化销浴液或0.1mol/L的盐酸榕液s注2:调整pH引人的盐类可能会干扰笙试剂的反应见附录A).8.4 试验步骤细菌内毒素试验的试验方法可使用欧洲、日本或美国药典的方法.使用东方堂试剂时的试验方法见

4、中华人民共和国药典(三部门2010年版，附录XIIE. 9 结果评价9. 1 概论当评价纳米材料的锺试验检测结果时，应科学地评价，了解试验有局限性。仔细考虑纳米材料对盘YY /T 1295-2015 试验的干扰性质是非常重要的。在这些情况中，应对干扰作用的可接受限值进行讨论并对结果进行说明。9.2 试验应用指南9.2.1 如果通过供试品的稀释或其他方法不能成功地克服干扰，那么这种供试品就不能用于璧试验，9.2.2 当内毒素的污染是不可避免的时候，可以使用试剂，如多粘菌素B处理供试品以排除内毒素的影响。9.2.3 当有可能存在仕1，3葡聚糖的污染时，应使用不会与伊1，3葡聚糖反应的内毒素特异性锺

5、试剂。例如血清可能被来自酵母菌、真菌或其他细菌的伊1，3葡聚糖宿染，而普通的盘试剂不仅和内毒素发生反应还会和伊1，3葡囊糖发生反应.因此，必要时应推荐使用不含萨1，3葡聚糖的血清制备供试晶。10 试验报告10.1 试验报告应与试验步骤一致。10.2 试验报告应包括下列内容za) 试验结果sb) 试验步骤zc) 试验过的纳米材料的完整信息确认Fd) 供试品制备的步骤，供试品的贮存条件和试验室环境分级的信息pe) 堂试剂信息确认(产品名称、制造商分类或规格、生产批号或日期、灵敏度等); f) 内毒素标准品信息确认名称分类或规格、生产批号或日期、效价等)I g) 试验的有效性包括供试品的干扰试验。6

6、 YY IT 1295-2015 附录A资料性附录萤试验潜在干扰的举例A. 1 抑制作用A.l.1 盐类z醋酿铺溶被(CHaCOONa，0.3mol/L) ，破酿氢铀禧液(NaHCOa, 0.1 mol/L) ，氯化饵溶液(KCl , 50 mmol/L)，氧化饷榕液(NaCl，0.6mol/L) 0 注z可逆的g供试品稀释可消除抑制.A.1.2肝素。注s可逆的添加Na+和Ca2+消除抑制。一种无内毒素的商业用的阳离子缓冲剂，可用于消除抑制.A.1.3 金属离子:Fe2+，Fe抖，Cr3+，Al抖。注g不可避的s添加乙二胶四乙酸-销盐从而恢复其部分活性.A. 1.4 塑料(聚丙烯。A.1.5

7、利用功能性颗粒季镑。A. 1.6 粒子过撞器z纤维素醋A.1.7 蛋白酶抑制剂。A. 1.8 聚山梨蹲200注s可逆的g供试品稀释消除抑制.A.2 增强作用A.2.1 乙二腊四乙酸-4-铀盐.注1.机理还没有阐明。注2:离浓度的乙二胶四乙酸-销盐能够抑制锺试剂反应，这是由于其与试验反应所需的二价阳离子形成整合物，但是，在反应混合物中添加0.5mmol/L的乙二胶四乙酸二销盐或三销盐即可观察到无干扰抑制作用或增强作用)的盆试验.7 YV/T 1295-2015 8.1 摄述附录B(资料性附录)凝胶法本附录描述了一个利用堂试剂进行凝肢法的示例。8.2 试剂8.2.1 用于凝胶法的标示灵敏度A的盘试

8、剂。8.2.2 元内毒素的水(EF-水。8.2.3 冻干的内毒素工作标准品(CSE)。注g冻干的道试剂可以从商业途径获得.8.3 仪器8.3.1 利用无内毒素的玻璃器皿或者无内毒素的聚苯乙烯试管或器皿制备内毒素标准系列稀释液.注1:使用准备好的无内毒素的仪棍和试验室梯皿，见7.5.2.注2:通常元内毒素的制品被脑上标签为无热原.8.3.2 试管架，8.3.3 移被管、带有吸管端的自动移液器或者带有塑料针筒的重复使用移被器应无内毒素。8.3.4 不循环式水浴锅或者干式培养箱控制温度为(37士l)CJ。8.3.5 糠祸混合器。B.3.6 计时器。8.4 标准内毒素溶撞的制备8.4.1 原班的制备应

9、使用对照标准内毒素的冻干糙。玻璃瓶内含有的对照标准内毒素应该用EF-水重新溶解制成原被.由标准品所附证书上的值决定.8.4.2 系列标准液的制备系列标准液利用EF-水稀释CSE榕液进行制备。系列标准液的旅度应包含0.25 , 0.5 , 1.0 和2.0四个浓度。当原液被稀释成任何浓度时，为了降低吸量误差，稀释倍数都应该不超过10.8.5 抑制作用或增强作用对照制备(I/EC)应利用未稀释的供试品稀释CSE溶被制备I/EC.I!EC的浓度应包含0.25 ,0.5 ,1.0 和2.0四个浓度。为了避免供试品的过度稀释.CSE榕液的稀释攘的量应不超过5%(如在I/EC总量为1mL 时，CSE溶液稀

10、稀液的量应总共不起过50L)。yy月1295-2015B.6 供试晶的稀辑应该用EF-水制备一系列2倍稀释倍数的供试品(如2倍、4倍、8倍或者如果需要的话可以稀稀更多).B.7 试验过程B.7.1 曾试剂灵敏度复核B.7.1.1 厂商规定EF-水的体积(阴性对照)以及含有鳖试剂的系列标准液(0.25，0.5，1.0，2.0应该小心地被分配到用于凝胶法试验的试管中，混匀。实行平行四管的方法进行测量。B.7. 1.2 试管应放置在不循环式水裕锅或者干式培养箱中，避免震动保持在(37士1).C下(60士2)min.B工1.3为了测定培养后凝肢的完整性，每个试管应缓缓倒转180.如果倒转后凝股仍然保持

11、牢圃，结果应标记为阳性。如果没有形成牢固的凝肢，或者，倒转后形成的凝胶滑落，则结果应为阴性。B.7.1 .4 当两个阳性对照都为阳性，两个阴性对照(EF-水和最低浓度(0.25的标准液都为阴性时，试验有效。B.7.1.5 产生阳性结果的最低浓度被确定为终点浓度。在校准标准液中，四个终点浓度c的几何平均值即为盘试剂的灵敏度测定值，见式(B.1): c =antilg(于)式中zL:e一-使用的一系列稀释倍数的终点浓度的log值的总和sf 一一测量的次数。B.7. 1.6 EF-水中盘试剂的灵敏度应该在0.5.2.0的范围内。注s每批堂试剂都进行灵敏度复核是非常可取的.B.7.? 确定试验方法.(

12、 B.1 ) B.7.2.1 厂商规定的EF-水的体积，系列标准掖(0.25，0.5，1.0和2.0溶于EF-水中)，I!EC (0.25 ,0.5 ，1.0和2.0榕于供试品中以及含有鳖试剂的供试品应小心地被分配到用于凝胶法试验的试管中，棍匀。校准标准液和阴性对照一式两份进行测量，I/EC和供试品一式四份进行测量。B.7.2.2 试验应该按照B.7.1.2和B.7.1.3中所描述的进行试验。B.7.2.3 当阴性对照(EF-水和供试品是阴性的，并且肇试剂的灵敏度复核结果在0.52.0之间时，试验是有效的。注z如果供试品被内毒素类物质污染，则供试品应被稀释到一个稀释倍数，此时供试品中不含可检测

13、出的内毒素。B.7.2.4 在I/EC中的终点浓度的几何平均值应按照B.7.1.5中所描述的计算，数值应在0.52.0 之间。B.7.2.5 如果I/EC中的终点被度的几何平均值不在上述的范围之内，应在具有更大稀释倍数的供试品的条件下重复试验。应通过堂试剂的灵敏度乘以克服干扰的稀释倍数进行校正。B.7.2.6 当通过稀释供试品不能克服供试品所带来的干扰时，可以采用其他的方法来降低干扰，如过捷、中和、透析或者热处理供试晶。B.7.2.7 当通过稀择供试品或者其他上述合理的方法不能克服干扰时，凝胶法堂试验不适用于此供试品。9 VY/T 1295-2015 B.7.3 供试晶含量的测定B.7.3.1

14、 一个特定量根据厂商说明)的EF-水(阴性对照)，I/EC(如2.0榕于供试品中).校准标准液(0.25，0.5.1.0和2.0瞎于EF-水中)或者含有盘试剂的供试品(未稀释的，利用EF-水稀择2倍，稀释4倍或者稀释8倍)应该被小心的分配到用于凝胶法试验的试管中，混匀。一式两份进行测定含量.B.7.3.2 应按照B.7.1.2和B.7.1.3中所描述的进行试验。B.7.3.3 当达到下列条件时试验有效za) 两个阴性对照(EF-水)是阴性的zb) 两个I/EC是阳性的sc) 校准标准液的终点浓度的几何平均值在0.52.0之间。B.7.3.4 产生阳性结果的最高稀释倍数被定义为终点，终点浓度通过

15、终点乘以标示灵敏度或者校正的灵敏度进行计算，从而获得未稀释供试品的内毒素浓度。B.7.3.5 内毒素披度的几何平均值应被记录为供试品的终点浓度。B.7.3.6 如果供试品的稀释倍数不是阳性的，供试品的内毒素浓度应小于璧试剂的标示灵敏度()或者按正的灵敏度。B.7.3.7 如果所有的稀释倍数都是阳性的，供试品的内毒素浓度应等于或者大于最高的稀释倍数乘以堂试剂的标示灵敏度()或者校正的灵敏度。10 YV/T 1295-2015 C.1 概述附录C(资料性附录)鳝点光度法本附录描述了一个采用终点光度法的例子，该方法利用人工合成的底物，如对硝基苯腊Boc-LeuGly-Arg-户NA或者Boc-Thr

16、-Gly-Arg-p-NA。反应掘合物中户NA的数量通过在405nm波长下pNA的光密度进行测定。C.2 试剂C.2.1 应用于光度法的具有A灵敏度的冻干童试剂，C.2.2 应用于堂试剂中重新组成的缓冲剂。C.2.3 冻干的内毒素工作栋准晶(CSE) C.2.4 元内毒素的水(EF-水。C.2.5 终止液(见堂试剂厂商说明书)。注g试剂作为一种预先装好的成套的样品可通过商业途径获得.C.3 仪器C.3.1 元内毒素的玻璃管或者无内毒素的聚苯乙烯徽孔板，注1:使用准备好的无内毒素的仪器及实验室器具，见7.5.2.注2:通常无内毒隶的产品用标签标记为无热原.C.3.2 利用具有足够容量的无内毒素玻

17、璃器皿或者无内毒素的聚苯乙烯试管或器皿配制不同稀择度的标准品或者测试样品。注1:使用准备好的无内毒素的仪糖和实验室椿皿，见7.5.2.注2:通常无内毒素的产品用标签标记为无热原。C.3.3 利用试管架支撑、培养，或者支撑发生反应的试管。C.3.4 移液管、带有吸管端的自动移液器或者带有塑料针筒的重复使用移液器都应无内毒素。C.3.5 水潜锅或者干式培养箱控制温度为(37士l)C。C.3.6 糠涡混合器。C.3.7 适用于在405nm波长下测量的分光光度计和全自动定量绘图蹲标仪。C.3.8 计时器.C.4 标准曲线的绘制C.4.1 原攘的制备应使用对照标准内毒素的冻干糙。玻璃瓶内含有的对照标准内

18、毒素。应该用EF-水重新榕解制成原液。玻璃瓶内溶攘的实际旅度将取决于所附证书上的值。11 yy月1295-2015C.4.2 校准标准洁的制备校准标准液利用EF-水稀释CSE溶液进行制备。校准标准被应至少包含3个浓度，包括堂试剂的标示检测限。根据厂商规定，CSE潜液应被稀释成具有一系列稀择倍数的溶液。当原液被稀释成任何故度时，为了降低吸量误差，稀释倍数都应不超过10.C.5 制备抑制作用或增强作用对照(I/EC)应利用未稀择的供试品稀释CSE溶液制备I/EC.l/EC中的内毒素浓度有几个选择(如，2.0, 4.0 或者标准曲线的中间浓度)。通常使用标准曲线的中间浓度。为了避免供试品的显著稀释，

19、CSE溶液稀静剂的量应不超过5%(如在I/EC总量为1mL时，CSE槽液稀释剂的量应该总共不超过50L)。C.6 试验过程C.6.1 含有一种人工合成底物的冻干盘试剂应根据厂商说明书利用EF-水或者合适的缓冲液溶解制成堂试剂榕液。C.6.2 厂商规定容量的堂试剂应在反应试管或者微孔板中与规定容量的EF-水(阴性对照)，按准标准攘，IjEC或者供试品混合。C.6.3 试管或者徽孔板应放置在培养装置中，按照厂商说明书在(37土1)C下培养一段时间。C.6.4 向反应混合物中添加厂商规定容量的终止液，在405nm的波长下利用光读出器或者分光光度计读出反应混合物的光密度值。C.6.5 对于自动系统，仪

20、器和试验操作应修改成系统所规定的值。C.7 含量测定验收准则C.7.1 标准曲线应该是由OD读数相对于对照标准品的浓度绘制的曲线。C.7.2 阴性对照应该是不发生反应的如，标准曲线中阴性对照计算所得的内毒素的值应该为最低点。C.7.3 线性回归公式适用于构建标准曲线。C.7.4 标准曲线的相关系数应至少为0.980。如果标准曲线不能满足验收标准，则应该重复试验。C工5供试品的精确度变异系数，CV)应在25%之内。C.8 供试晶中肉毒素读度的计算C.8.1 应达到含量测定的验收标准。C.8.2 每个试样水平的OD值的算术平均值应与标准曲线中所读出的内毒素的浓度相符。C.8.3 每个试样水平的内毒

21、素的浓度应乘以相应的稀释倍数从而获得未稀释的供试品的内毒素浓度。C.8.4 内毒素的浓度应该是算术平均值，并且平均值应该被看作未稀释的供试晶内毒素的浓度。C.9 试验方法的验证C.9.1 l/EC中内毒素的回收率应该用观察到的供试品中内毒素的浓度除以预定值的内毒素的浓度进YY /T 1295-2015 行计算。回收率以百分数的形式表示。C.9.2 IjEC中添加的内毒素的回收率应该在预定值的50%-200%之间。如果添加的内毒素浓度的回收率不在上述的范围之内，提示供试样品干扰了内毒素含量测定。如果检测到干扰，应利用不含有显著性干扰的供试晶重复试验。稀释或者其他的方法如过撞、中和、透析或者热处理

22、供试品可能会消除干扰。通常情况下，I/EC应该利用不含干扰的供试品进行制备。13 YY/T 1295-2015 D.1 黯述附录D(资料性附录)动态法本附录描述了动态法的一个例子，动态法利用浊度法技术或者利用显色法技术，利用分光光度计或者酶标仪。D.2 试剂D.2.1 应用于浊度法或者显色法的具有灵敏度的冻干肇试剂。D.2.2 应用于鳖试剂的无内毒素水(EF-水或者重新组成的缓冲液。D.2.3 无内毒素水(EF-水。D.2.4 冻干的内毒素工作标准晶(CSE).注g试剂作为一种预先装好的成套的样晶可通过商业途径获得.D.3 仪器D.3.1 元内毒素的玻璃管或者无内毒素的聚苯乙烯微孔板，注1:使

23、用准备好的无内毒素的仪器及实验室器具，见7.5.2.注2:通常无内毒素的产品用标签标记为元热原.D.3.2 利用具有足够容量的无内毒素的玻璃器皿或者无内毒素的聚苯乙烯试管或器皿配制标准品或者供试品的稀释样品。注1:使用准备好的无内毒素的仪器和实验室器皿，见7.5.2.注2:遥常无内毒素的产品用标签标记为无热原.D.3.3 移液管、带有吸管端的自动取样器或者带有塑料针筒的重复使用移被器都应无内毒素。D.3.4 可放置在温控的分光光度计或者酶标仪上，温度保持在(37士l)C。D.4 标准曲线的绘制D.4.1 原攘的制备应使用对照标准内毒素的冻干糙。破璃瓶内含有对照标准内毒素应该用EF-水重新榕解制

24、成原液。玻璃瓶内榕液的实际浓度将取决于所附证书的值。D.4.2 枝准标准溜的制备校准标准液利用EF-水稀释CSE溶液进行制备。校准标准液应至少由3个浓度组成，包括用标签标好的灵敏度为A的堂试剂。根据厂商规定，CSE溶液应被稀择成具有一系列稀释倍数的潜液。当原液被稀释成任何浓度时，为了降低吸量误差，稀释倍数都应该不超过10.YV/T 1295-2015 0.5 制备抑制作用或增强作用对照EC)应利用未稀释的供试品稀稀CSE榕被制备I1EC.I1EC中的内毒素浓度有几个选择(如:2.0 ). , 4.0 ).或者标准曲线的中间浓度)。通常使用标准曲线的中间浓度。为了避免供试品的显著稀膊，CSE溶液

25、稀静剂的量应不超过5% GB/T 25915.1 洁净室及相关受控环绕第1部分g空气洁净度等级(GB/T25915.1-2010, 180 14644-1 , 1999 , IDT) GB/T 25915.2 洁净室及相关受控环撞第2部分g证2 明连续符合GB/T25915. 1的检测与监测技术条件(GB/T 25915.2-2010，因o14644-2:2000 ,IDT) GB/T 25915.7洁净室及相关受控环境第7部分，隔离装置洁净凤罩、手套箱、隔离器、徽环攘)(GB/T 25915.7-2010 , ISO 14644-7: 2004 , IDT) 中华人民共和国药典(三部)201

26、0年版ISO 10993-1212007 医疗器械生物学评价第12部分=样品帘j备与参照样品(Biologicalevaluation of medical devices-Part 12: Sample prep且rationand refer-ence materials) 3 删除了ISO29701 :2010中2.9tt sample 该术语过于简单，无需特殊定义适应我国的技术条件修改ISO的三个标准为GB/T中相应的三个标准，具体如下s-用等同采用国际标准的GB/T25915. 1代替7.5.1 ISO 14644-1 , 用等同采用国际标准的GB/T25915. 2代替lISO 1

27、4644-2 , 一一-用等同采用国际标准的GB/T25915. 7代替ISO 14644-7 8.4 增加了使用东方锺试剂时的试验方法见中华人民共和国药典三部门2010年版，附录:xrrE 适应我国的技术条件10.2e) 糟加了产品名称和制造商分类或规格，删除了商品名和生产编号适应我国监管需要10.20 l增加了名称分类或规格，删除了商品名和生产编号适应我国监管需要删除了ISO29701:2010第9章中NO四Forinformation 无需另外提示on the records,see 180 10993-12:2007 附录增加了附录E遵照GB/T20000.2-2009要求一17 YV

28、/T 1295-2015 参考文献1J ISO 10993-12:2007 Biological evaluation of medical devices-Part 12: Sample preparation and reference materials 2J ISO 14644-1 Cleanrooms and associated controlled environments-Part 11 Classification of air cleanliness 3J ISO 14644-2 Cleanrooms and associated controlled environmen

29、ts-Part 2: Specifications for testing and monitoring to prove continued compliance with ISO 14644-1 4J ISO 14644-7 Cleanrooms and associated controlled environments-Part 71 Separative de vices (clean air hoods.gloveboxes.isolators and mini-environments) 5J ISO/TS 80004-13 Nanotechnologies-Vocabulary

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