SN T 1195-2003 大豆中转基因成分的定性PCR.检测方法.pdf

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1、F5才己|中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1195-2003 大豆中转基因成分的定性PCR检测方法Protocol of the quaiitative polymerase chain reaction (PCR) for detecting genetically modified component in soybeans 2003-03-17发布2003-09-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局目Ui=i 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。本标准主要起草人:蒋原、祝长青、林宏。本标准系首次发布

2、的检验检疫行业标准。SN/T门95-2003I SN/T 1195-2003 1 范围大豆中转基因成分的定性PCR检测方法本标准规定了大豆中转基因成分的定性聚合酶链式反应CPCR)检测方法。本标准适用于大豆中抗草甘腾转基因大豆(roundupready soybean)中的转基因成分的检测。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682 分析实验室用水规

3、格和试验方法SN/T 1193 基因检验实验室技术要求SN/T 1194 植物及其产品转基因成分检测的抽样和制样方法SN/T 1204 植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法3 术语、定义和缩略语下列术语、定义和缩略语适用于本标准。3. 1 转基因成分genetically modified component 将物种本身不具有的、而是来源于其他物种的功能基因序列。3.2 聚合酶链式反应ploymerase chain reaction C PCR) 模板基因序列先经高温变性成为单链，在DNA聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别与模板DNA两条链上相应的

4、一段互补序列发生退火而相互结合，接着在DNA聚合酶的作用下以四种脱氧核糖核酸CdNTP)为底物，使引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和延伸这一循环，使欲扩增的基因片段以几何倍数扩增。3. 3 缩略语3. 3. 1 Lectin:植物凝集素基因，为大豆本身含有的内源基因。3. 3. 2 CaMV 35S: 35S promoter from caulif10wer mosaic virus，花椰菜花叶病毒35S启动子。3.3.3 NOS: Terminator of nopaline synthase gene from Agrobacterium tumefaciens，来源于农杆菌的腼脂碱

5、合成酶基因终止子。3. 3. 4 CP4 EPSPS: 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase gene , 5-烯醇丙酣酸莽草酸-3磷酸合成酶基因。3. 3. 5 RRS: roundup ready soybean，美国Monsanto公司的获准商品化种植的抗除草剂草甘腾的转基因大豆，转入外源基因有CaMV35S启动子，NOS终止子和CP4-EPSPS基因等。1 SN/T门95-20034 防污染措施检测过程中防止交叉污染的措施按照SN/T1193中的规定执行。5 抽样和制样5. 1 抽样按照SN/T1194中规定的方法执行。5. 2 制样称

6、取约50g大豆样品，用湿热灭菌(1210C处理30mi口)或干热灭菌(1800C处理2h)的研钵或合适的粉碎装置将样品粉碎至约0.5mm左右。6 测定方法6.1 原理根据RRS转基因大豆生物基因组中含有的外源基因序列设计出特异性引物，利用PCR方法对这段外源基因的序列片段进行扩增，根据实验结果来判定被检样品的核酸中是否含有RRS的转基因成分。6. 2 试剂和材料除另有规定外，所使用的试剂为分析纯或生化试剂。6.2.1 CTAB缓冲液:CTAB20g/L, Tris-HCl O. 1 mol/L(pH8. 0) ,EDTA O. 02 mol/L。6.2.2 Tris饱和盼。6. 2. 3 三氯

7、甲皖:异戊醇(24: 1)。6. 2. 4 异丙醇。6.2.5 70%乙薛。6.2.6 TE溶液(10mmol/L Tris ,l mmol/L EDTA,pH8. 0)。6.2.7 RNA酶溶液:5g/L。6.2.8 10XPCR反应液。6. 2. 9 氯化馍(MgC12):25 mmol/L。6.2.10 dNTP(dATP，dCTP，dGTP，dUTP)溶液:各2.5mmol/L。6.2. 11 T呵酶:5U/L。6.2.12 引物:转基因大豆的内源基因和外源基因检测时所用的引物序列见表1。表1转基因大豆的内源基因和外源基因的引物序列检测基因引物序列扩增片段长度正:5 -gcc ctc

8、tac tcc acc ccc atc c -3 118 bp Lectin 反:5 -gcc cat ctg caa gcc ttt ttg tg -3 正:5 -tgc cga agc aac caa aca tga tcc t-3 反:5 -tga tgg atc tga tag aat tga cgt t-3 438 bp CaMV35S 正:5 -gat agt ggg att gtg cgt ca-3 195 bp 反:5 -gct cct aca aat gcc atc a-3 NOS 正:5 -gaa tcc tgt tgc cgg tct tg-3 180 bp 反:5 -t

9、ta tcc tag ttt gcg cgc ta-3 正:5 -ctt ctg tgc tgt agc cac tga tgc-3 320 bp 反:5 -cca cta tcc ttc gca aga ccc ttc c-3 CP4 EPSPS 正:5 -cct tcg caa gac cct tcc tct ata -3 反:5 -atc ctg gcg ccc atg gcc tgc atg-3 513 bp 2 基因性质内源基因外源、基因外源基因外源基因SN/T 1195-2003 6.2. 13 实验用水:按GB/T6682规定执行。6.2.14 澳化乙键(EB):10 mg/mL

10、。6.2.15 DNA分子量标记物。6.2. 16 琼脂糖。6.2.17 50XTAE缓冲液:242g Tris碱，57.1mL冰乙酸，100mL O. 5 mol/L EDTA(pH8. 0)。6.2. 18 上样缓冲液。6.2. 19 RRS标样，非转基因大豆标样。6. 2. 20 1. 5 mL离心管。6.2.21 洁、芯吸头(10L，20L，100L，200L，l000L)。6.2.22 PCR反应管(200L)。6. 3 主要仪器6.3. 1 电子天平(感量为O.001g)。6. 3. 2 恒瘟孵育装置。6. 3. 3 普通离心机，低温冷冻高速离心机，微型离心机。6. 3. 4 研钵

11、及粉碎装置。6. 3. 5 低温冰箱，普通冰箱。6. 3. 6 旋涡震荡器。6. 3. 7 高压灭菌器。6. 3. 8 高温干燥箱。6. 3. 9 核酸蛋白分析仪。6.3. 10 微量移液器(0.5L，2L，10L，20L，100L，200L，l 000L)。6. 3. 11 基因扩增仪。6.3. 12 电泳仪。6.3. 13 凝胶成像分析系统。6.3. 14 实时荧光PCR仪。6.3. 15 超净工作台。6.3. 16 实验用水制备装置。6. 4 检测方法6.4. 1 样品的DNA提取6.4.1.1 CTAB方法6. 4. 1. 1. 1 分别称取100mg制备好的样品，各加入到两支1.5

12、mL离心管中，同时设立试剂提取对照。6. 4. 1. 1. 2 加入600LCTAB缓冲液，振荡均匀，650C温育30min。6.4.1.1.3 加入500L酣:三氯甲皖:异戊醇(25:24:1)，振荡均匀，12000 r/min离心15min。6. 4. 1. 1. 4 吸取上清液，放入另一新管中，加入等体积的异丙醇，12000 r/min离心10min。6.4. 1. 1.5 弃去上清液，加入7刊0%乙醇溶液洗涤，120Oo r旷/min离心1mi山n6.4. 1. 1.6 弃去上清液，干燥，用5切OLTE溶液溶解沉淀。6. 4. 1. 1. 7 加入5LRNA酶溶液，370C温育30mi

13、n。6.4.1.1.8 加入400L的CTAB海液，振荡均匀。6.4.1.1.9 加入250L的三氯甲烧=异戊醇，振荡均匀，12000 r/mi口离心15miiJ. o 6. 4. 1. 1. 10 吸取上清液，放入另一新管中，加入200L的异丙醇，12000 r/min离心10min。6.4.1.1.11 弃去上清液，干燥，用50LTE缓冲液溶解沉淀。6.4. 1.2 商品化试剂盒方法3 SN/T 1195-2003 根据不同提取原理的商品化基因组提取试剂盒，使用时按照操作说明书进行操作。选择商品化试剂盒的原则是所提取DNA质量好并且得率高。6.4. 1.3 所提取样品DNA的质量评估6.4

14、. 1.3. 1 方法1样品中提取的DNA用核酸蛋白分析仪测定，分别计算核酸的纯度和浓度，计算公式见(1)式:ODnc DNA纯度=一旦旦ODz日Onm比值在1.72. 0之间较好，符合PCR检测要求。DNA浓度根据10DZ60nm=50g/mL双链DNA或38g/mL单链DNA，估算出浓度。6.4.1.3.2 方法2. ( 1 ) 用1%的凝胶电泳进行检测，具体的操作步骤见6.4. 2. 4的凝胶电泳检测部分，根据电泳结果来检测提取的DNA。6.4. 1.3.3 方法3通过定性PCR来检测大豆样品的固有内源基因Lectin，根据检测结果来判定样品中提取的DNA是否满足PCR检测要求，PCR的

15、反应体系见表2，反应循环参数见表3，其他操作要求按照6.4.2的定性PCR检测。6.4.2 定性PCR检测6.4.2.1 PCR反应体系检测RRS中内源和外源基因采用的PCR检测反应体系见表2。反应体系中各试剂的量根据反应体系的总体积进行适当调整。每个反应体系应该设置两个平行管。表2PCR检测参考反应体系(50L体系)试剂名称加入PCR反应体系的量10XPCR反应缓冲液5L 氯化娱(25mmol/L) 4L UNG酶(1U/L) O. 4L dNTP溶液(各为2.5mmol/L) 4L 正义引物(10pmollt-l L) 1L 反义引物(10pmol/f.1L) 1L Taq酶(5U/f.1

16、L) O. 5L 模板(样品的DNA)0.5g3问水补足反应体系，使总体积为50L6.4.2.2 反应体系对照的设置进行PCR检测时反应体系必须设置阳性对照、阴性对照和空白对照。6.4.2.2. 1 阳性对照:用RRS标物提取的DNA作为模板。6.4.2.2.2 阴性对照:用非转基因大豆标物提取的DNA作为模板。6.4.2.2.3 空白对照:用配置反应体系的实验用水代替模板。6.4.2.3 RRS中内源基因和外源基因的检测RRS中内源基因和外源基因的PCR检测的参考反应条件见表3。反应条件需根据检测仪器的性能做相应调整。4 SN/T门95-2003表3RRS中内源基因和外源基因的PCR检测的参

17、考反应条件被扩增的基因变性扩增循环次数最后延伸94C ,30s Lectin 94C ,5 min 54C ,40 s 40 72C ,7 min 72C ,60 s 94C ,30 s CaMV35S 94C ,5 min 54C ,40 s 40 72C ,7 min NOS 72C ,60s 94C ,30 s CP4 EPSPS 94C ,5 min 60C ,60 s 40 72C ,7 min 72C ,60 s 6.4.2.4 凝股电泳检测PCR产物用1XTAE(或0.5XTBE)电泳缓冲液制备2%的琼脂糖凝胶(凝胶融化后凉至60C左右时加入澳化乙链，含量为O.5g/mL;或者在

18、电泳后用澳化乙键溶液进行染色。此外也可以选用其他染色剂)。按比例将10L的PCR产物与上样缓冲液均匀混合，然后分别加入对应的凝胶孔中，同时加入合适的DNA分子量标记物，选择合适的电压(3V/cm5 V /cm)进行电泳，电泳时间为20min40 min。用凝胶成像分析系统进行观察分析并记录。6. 4. 2. 5 结果分析与判定6.4.2.5. 1 根据内源基因Lectin扩增情况，来判断所提取的样品DNA的质量，必要时进行样品DNA的纯化或者重新提取，防止出现检测中产生假阴性。6.4.2.5.2 样品的内源基因Lectin扩增为阳性，样品的外掘基因CaMV35S和外源基因NOS扩增为阳性，其相

19、应的阳性对照、阴性对照和空白对照正确，可根据结果判定被检样品中含有CaMV35S和NOS转基因成分。如果外源基因CP4EPSPS的扩增结果同时也为阳性，其相应的阴性对照和空白对照均正确，可以判定此样品为RRS。6.4.2.5.3 样品的内源基因Lectin扩增为阳性，样品的外源基因CaMV35S、NOS或CP4EPSPS中仅有一个为阳性，判定被检样品的检测结果可疑，应按照SN/T1204中规定的方法进行确证实验。5 Nvcenvi-UOFF人EH哑中华人民共和国出入境检验检疫行业标准大豆中转基因成分的定性PCR检测方法SN/T 1195-2003 9唔中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷9峰开本880X 1230 1/16 印张3/4字数13千字2003年6月第一版2003年6月第一次印刷印数1-20009峰定价8.00元网址版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533 1195-2003 书号:155066.2-15180