GB T 27528-2011 口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测方法.pdf

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1、ICS 11.220 B 41 GB 中华人民共和国国家标准GB/T 27528-2011 口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测方法Real-time RT-PCR for detection of foot and mouth disease virus 2011-11-21发布数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检茂总局中国国家标准化管理委员会2012-03-01实施发布本标准的附录A、附录B为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。目IJ1=; 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。GB/T 27528-2011 本标准起草单位:中华人民共和国深圳出入境检

2、验检疫局、中国检验检疫科学研究院、北京盈九思科技发展有限公司。本标准主要起草人:秦智锋、林样梅、吴绍强、花群义、卢体康、刘建、陈书瑕、吕建强、曾少灵、詹爱军、韩雪清、孙洁、曹琛福、贾广乐、高小博、陈兵、阮周曦、梅琳、张彩虹、陶虹。I 口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测方法1 范围本标准规定了口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测方法。本标准适用于口蹄疫病毒的检测与鉴定。2 规范性引用文件G/T 27528-2011 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使

3、用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 18088 出入境动物检疫采样GB/T 18935 口蹄疫诊断技术GB 19489 实验室生物安全通用要求SN/T 1193 基因检验实验室技术要求3 缩略语下列缩略语适用于本标准。Ct值z循环阁值(cyclethreshold)。4 试剂耗材和仪器设备4. 1 试剂耗材4. 1. 1 除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T6682的要求。4. 1.2 口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR试剂:一20.C保存，见附录A。4. 1.3 引物和探针

4、序列上游引物(FMDV-F)序列为:5ACTGGGTTTTACAAACCTGTGA3。下游引物(FMDV-R)序列为:5GCGAGTCCTGCCACGGA 3。TaqMan探针(FMDV-Pb)序列为:5TCCTTTGCACGCCGTGGGAC 3，其5端和3端分别标记FAM和BHQ.4.1.4 DEPC处理水:见附录B。推荐购买商品化DEPC处理的元DNA酶和RNA酶的水。4. 1. 5 氯仿z分析纯，常温保存。4. 1. 6 异丙醇:分析纯，使用前预冷至一20.C。4. 1. 7 75%乙醇:用DEPC水和无水乙醇配制，使用前预冷至一20.C。4. 1. 8 石英砂:市售化学纯，121.C

5、，15min高压灭菌后备用。4. 1. 9 0.01 mol!L PBS , pH7. 67. 8:见附录B.4. 1. 10 阳性对照为灭活疫苗毒或组织培养灭活毒，一20.C保存备用。阴性对照样品可采用健康的猪或牛的组织材料。4.2 主要仪器设备4.2.1 荧光PCR检测仪。4.2.2 高速台式冷冻离心机:可控温至4.C，离心速度可达12000g以上。GB/T 27528-2011 4.2.3 生物安全柜。5 采样和样晶前处理5. 1 样晶采集、保存及运输按照GB/T18088和GB/T18935的要求进行。5.2 样品制备5.2. 1 样品的制备应符合GB19489规定。5.2.2 用无菌

6、的手术刀采取动物机体组织(如舌、鼻、蹄水泡皮)0.2 g 1. 0 g置研钵中，加入等量灭菌石英砂充分研磨。其他机体组织(如淋巴结、扁桃体、肌肉等)除去包膜和其他结缔组织，选取内部实质部分，置研钵中，加入石英砂充分研磨。然后按照1: 5比例加人0.01mol/L PBS(pH7. 67. 8) , 4 .C 浸泡过夜或者一20.C反复冻融2次，每次30min.然后4.C 8000g离心5min. 5.2.3 液体样品如水泡液或者食道咽部带液(o-P液)不必经过研磨或者冻融处理，直接进行下一步。6 核酸提取6. 1 核酸提取要求核酸提取应按照SN/T1193进行。6.2 传统酣氯仿法抽提核酸6.

7、2. 1 取灭菌的1.5 mL离心管，做好标识。6.2.2 每管加入600L裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各200L，再加入200L氯仿，混匀器上振荡混匀5s，于4.C12000g离心15min。6.2.3 取灭菌的1.5 mL离心管，加入一20.C预冷400L异丙醇，吸取本标准6.2各管中的上清液转移至相应的管中，避免吸出中间层，颠倒混匀。6.2.4 于4.C12000g离心15min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体;加入600L75%预冷乙醇，颠倒洗涤。6.2.5 于4.C12000g离心10min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体。6.2.6 10000g离心10s，用微

8、量加样器将其吸干，室温干燥5min10 min 6.2.7 加入15LDEPC水，搭解管底的RNA，5000g离心5s，冰上保存备用，若需长期保存应放置一70.C冰箱。6.3 核酸提取等效方法口蹄疫病毒核酸提取也可以采用等效RNA提取试剂及方法:如采用自动化核酸抽提仪和配套核酸抽提试剂进行核酸抽提。7 实时荧光RT-PCR检测7.1 反应渣的配制配制每个PCR反应混合液z实时荧光RT-PCR反应液14.5L， Taq酶O.25L，反转录酶0.25L. 将以上PCR反应试剂按使用量吸取到一个离心管中，充分混匀，然后在每个PCR管中分装15L，转移至样本处理区。7.2 加样在已分装有PCR反应混合

9、液的PCR管中分别加入已提取好的核酸10L，盖上管盖，将PCR管放入荧光PCR检测仪内，记录样本放置顺序。GB/T 27528-2011 7.3 PCR扩增检测7.3.1 反应条件设定第一步:42C30 min,95 .C 5 mino 第二步:95.C10 s , 55.C 1 min, 72.C 30 s，5个循环。第三步:95.C5 s , 60 c 30 s，40个循环，60.C时设置采集荧光。7.3.2 荧光素设定Report Dye设定为FAM, Quench Dye都设定为BHQ，Referencedye设定为None。8 结果判定8. 1 判定前的设置综合分析仪器给出的各项结果

10、，基线以仪器给出的默认值作为参考，阔值设定原则以阔值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准，具体根据仪器噪声情况进行调整，选择FAM通道进行分析。8.2 试验成立判定选用FAM通道进行分析，阳性对照样品有对数扩增曲线，而且Ct值30，阴性对照没有对数扩增曲线，而且Ct值为元，二者均成立才可判定试验成立，杏则试验无效。8.3 阳性判定Ct值30的样本为阳性，表明口蹄疫病毒核酸阳性。8.4 阴性别定Ct值显示为元的样本为阴性样本，表明口蹄疫病毒核酸阴性。8.5 可疑判定如果30Ct值40，判为可疑。此时重复扩增检测，如果重复扩增曲线为对数扩增曲线且Ct40，判为样本阳性，表明口蹄疫病毒核酸阳

11、性;否则判为样本阴性。3 GB/T 27528-2011 附录A(规范性附录)实时荧光RT-PCR反应液及裂解班组成.1 实时荧光RT-PCR反应液组成实时荧光RT-PCR反应液Clx):含50mmol/L KCl , 10 mmol/L Tris-HCl(pH8. 3) , 2.5 mmol/L MgClz , 0. 2 mmol/L dNTP mix，上、下游引物各200nmol/L，探针100nmol/L , 1 U Taq酶，100U逆转录酶，2mmol/L DTT ，5%甘油。.2 裂解班组成裂解液主要成分为异硫氨酸服和酷，为RNA提取试剂，于40C保存。4 B.1 DEPC水附录B

12、(规范性附录)溶班的配制GB/T 27528-2011 每升三蒸水中加入1mL DEPC，用力摇匀，使DEPC充分混匀在水中，37.C放置12h以上，再经121 .C15 min高压灭菌备用。B.2 0.01 mol/L PBS(pH7. 6-7. 8) 磷酸氢二铀(Na2HP04 12H20) 3.0 g 磷酸二氢饵(KH2P04)0.2g 氯化饵(KCl)0.2 g 氯化铀(NaCl)8 g 加三蒸去离子水定容至1000 mL，完全溶解后用3mol/L的NaOH调pH为7.67.8。经121 .C ,15 min高压灭菌，室温保存。5 -FON|NmhNHg 华人民共和国家标准口蹄疫病毒实

13、时荧光RT-PCR检测方法GB/T 27528-2011 国由1晤中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销争e印张O.75 字数11千字2012年1月第一次印刷开本880X12301/16 2012年1月第一版16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价晤书号:155066. 1-44036 GB/T 27528-2011 打印H期:2012年2月16HF002A