GB 15193.4-1994 鼠伤寒沙门氏菌 哺乳动物微粒体酶试验.pdf

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1、中华人民共和国国家标准鼠伤寒沙门氏菌哺乳动物微粒体酶试验Salmonella typhimurium/mammals microsomal enzyme test (Ames test) 1 主题内容与适用范围本标准规定了Ames试验的基本技术要求。本标准适用于检测环境有害物质的致突变作用。2 原理GB 15193. 4 94 鼠伤寒tJ，、门氏菌的突变型（即组氨酸缺陷型）菌株在无组氨酸的培养基上不能生长，在有组氨酸的培养基上可以正常生长。但如在无组氨酸的培养基中有致突变物存在时，贝tl沙门氏商突变型可回复突变为野生型（表现型，因而在无组氨酸培养基上也能生长，故可根据菌落形成数量，检查受试物是

2、否为致突变物。某些致突变物需要代谢活化后才能使沙门氏菌突变型产生回复突变，代谢活化系统可以用多氯联苯（PCB）诱导的大鼠肝匀浆（S-9）制备的S-9混合液。3 仪器3. 1 实验室常用设备。3. 2 低温高速离心机，低温冰箱（80）或液氮罐，洁净工作台，恒温培养箱，恒温水浴，蒸气压力锅，匀浆器等。4 培弊基制备及试剂的配和l培养基成分或试剂除说明外至少应是化学纯，无诱变性。避免重复高温处理，选择适当保存温度和期限，如肉汤保存于4不超过六个月，其他详见下述各培养基及榕液说明。4. 1 营养肉汤培养基牛肉膏2. 5 g 膜腺（或混合蛋白陈）氯化销5. 0 g 2. 5 g 磷酸氢二饵（K,HPO,

3、 3H,0) 1. 3 g 蒸馆水500 mL 加热溶解，调pH至7.4，分装后0.103 MPa 20 min灭菌，普通冰箱保存备用，保存期不超过半年。4.2 营养肉汤琼脂培养基g用作a.基因型鉴定的结晶紫敏感试验，抗氨苦青霉素和四环素试验，紫外线敏感性试验。b.细菌活力鉴定。琼脂粉营养肉汤培养基1. 5 g 100 mL 中华人民共和国卫生部1994-08-10批准1994-08-10实施551 GB 1 51 9 3. 4 9 4 加热融化后调pH为7.4,0. 103 MPa 20 min灭菌。4.3底层培养基所需试剂及配制方法如下g4.3. 1 磷酸盐贮备液磷酸氢销镀（NaNH4HP

4、04 4H,0) 17. 5 g 拧橡酸（C,H,O, H,0) 10. 0 g 磷酸氢二饵（K,HPO,)50. o g 硫酸续（MgSO, 7H,O) 1. o g 加蒸馆水至100mL,0.103 MPa 20 min灭菌。注1）待其他试剂完全溶解后再将硫酸镜缓慢放入其中继续溶解，否则易析出沉淀。4.3.2 40%葡萄糖溶液葡萄糖40. 0 g 加蒸饱水至100mL,O. 055 MPa 20 min灭菌。4.3.3 1.5%琼脂培养基琼脂粉蒸饱水融化后0.103 MPa 20 min灭菌。4.3.4 底层培养基元菌操作）6. 0 g 400 mL 趁热（80），在灭菌琼脂培养基中（40

5、0mL）依次加入z磷酸盐贮备液8 mL 40%葡萄糖溶液20 mL 充分混匀，待凉至80左右时倒平皿，每皿体90mm)25 mL,37培养过夜以除去水分及检查有无污染。4.4 顶层培养基的成分及制备4. 4. 1 顶层琼脂琼脂粉3. 0 g 氯化纳2. 5 g 加蒸馆水至500 mL 4. 4. 2 0. 5 mmol/L组氨酸生物素溶液（诱变试验用）D生物素（分子量244)30. 5 mg L组氨酸（分子量155)加蒸馆水至250mL。17. 4 mg 4.4.3 顶层培养基制备加热融化顶层琼脂，每100mL顶层琼脂中加10mL 10. 5 mol/L组氨酸生物素溶液。混匀，分装在100mL

6、三角瓶中，0.103 MPa 20 min灭菌。用时融化分装小试管，每管2mL, 在45水浴中保温。4.5特殊试剂和培养基的配制4. 5. 1 0. 8 %氨韦青霉素溶液（鉴定菌株用，无菌配制）称取氨苇青霉素40mg，用0.02 mol/L氢氧化纳溶液稀释至5mL，保存于冰箱。4.5.2 0.1%结晶紫溶液（鉴定菌株用称取100mg结晶紫，溶于100mL元菌水。4.5.3 L组氨酸溶液和0.5 mol/L D生物素溶液（鉴定菌株用称取L组氨酸0.4043 g和D生物素12.2 mg，分别溶于100mL蒸馆水，0.103 MP a 20 min灭菌，保存于4冰箱。4.5.4 0.8%四环素溶液用

7、于四环素抗性试验和氨节青霉素四环素平板552 GB 15193. 4 94 称取40mg四环素，用0.02 mol/L盐酸稀释至5mL，保存于4冰箱。4. 5. 5 氨苦青霉素平板（用作TA97、TA98、TAlOO菌株的主平板）和氨节青霉素四环素平板（用作TA102菌株的主平板）每1ooo mL中由以下成分组成底层培养基910 mL 磷酸盐贮备液20 mL 40%葡萄糖溶液50 mL 组氨酸水溶液（0.404 3 g/100 mL) 10 mL 0. 5 mol/L生物素6 mL 0. 8%氨节青霉素溶液3. 15 mL 0. 8%四环素溶液o. 25 mL 四环素仅在使用对四环素有抗性的T

8、A102时加入。以上成分均已分别灭菌或无菌制备。4. 5. 6组氨酸生物素平板（组氨酸需要试验用）每1000 mL中由以下成分组成z底层培养基914 mL 磷酸盐贮备液20 mL 40%葡萄糖溶液50 mL 组氨酸水溶液（0.404 3 g/100 mL) 10 mL 0. 5 mol/L生物素6 mL 以上成分均已分别灭菌。4. 5. 7 工甲基亚飘2光谱纯，0.103 MP a 20 min灭菌。4. 6 S-9辅助因子（混合液试剂）的配制4. 6. 1 0. 4 mol/L氯化镇（MgCl，）溶液z称取3.8 g，加蒸馆水稀释至100mL. 4. 6. 2 1. 65 mol/L氯化惆（

9、KC！）溶液z称取12.3 g，加蒸馆水稀释至100mL0 4. 6. 3 0. 2 mol磷酸盐缓冲液（pH7.4），每500mL由以下成分组成磷酸氢二锅（Na,HPO,)(14. 2 g/500 mL) 磷酸二氧销（NaH,PO, H,0)(13. 8 g/500 mL) 调pH至7.4,0.103 MPa 20 min灭菌或滤茵g440 mL 60 mL 4.6.4 辅酶I （氧化型溶液准确称取辅酶I，用无菌蒸馆水溶解配制成0. .025 mol/L溶液，低温保存（20以下）。4.6. 5 葡萄糖6磷酸锅盐溶液z称取葡萄糖6磷酸销盐，用无菌蒸馆水溶解配制成0.05 mol/L，低温保存（

10、ZO以下。4. 7 10%S-9混合液的配制：每10mL由以下成分组成，I脑用时配制。磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L,pH7. 4) 氯化御溶液（1.65 mol/L) 氯化缓溶液（0.4 mol/L葡萄糖6磷酸盐溶液（0.05 mol/L) 辅酶E溶液（0.025 mol/L) 肝S-9液混匀，置冰浴中待用。5 活化系统侣，9和s9混合液）的制备6.0 mL O. 2 mL 0. 2 mL 1. 0 mL 1. 6 mL 1. o mL 用哺乳动物如大鼠，经诱导剂处理，取肝组织制备匀浆，9000 g离心，上滑液为S-9组分，与辅助成分以适当比例组成s9混合液，用作试验中的代谢活化系统。5.

11、 1 大鼠肝S-9的诱导和制备553 GB 15193. 4-94 5. 1. 1 选健康雄性成年SD或Wistar大白鼠，体重150g左右，周龄约56周。将多氯联苯（Aro一clorl254或国产PCB五氯溶于玉米泊中，浓度为200mg/mL，按500mg/kg（体重）无菌操作一次腹腔注射，5d后断头处死动物，取出肝脏称重后，用新鲜冰冷的0.15 mol/L氯化饵溶液连续冲洗肝脏数次，以便除去能抑制微粒体酶活性的血红蛋自。每克肝（湿重）加0.1 mol/l，氯化梆溶液3mL，连同烧杯移入冰浴中，用消毒剪刀剪碎肝脏，在玻璃匀浆器（低于4000 r/min，往复12min），或组织匀浆器(20

12、000 r/min,l min）中制成肝匀浆。以上操作需注意无菌和局部玲环境。5. 1. 2 将制成的肝匀浆在低温（04）高速离心机上，以9000 g离心10min，吸出t清液为S-9组分，分装于无菌冷冻管或安题中，每安鼠2四L左右，最好用液氮或干冰速冻后置80低温保存。5.1.3 S9制成后，经无菌检查，蛋白含量测定（Lowry法），每毫升蛋白含量应不超过40mg为宜，因过量蛋白将会抑制国复突变率，并经间接致癌物（诱变剂）鉴定其生物活性合格后贮存于深低温或冰冻干燥，保存期不超过一年。5. 2 s 9混合液配制由s9液和辅助因子（S-9混合液试liu）组成，辅助因子按Ames(l983）配方，

13、低温（20以下）贮存。混合液l陷用时新鲜元菌配制，或滤过除菌。一般按1: 9配成10%混合液。用每皿o.5 mL S 9混合液（含2050L S-9）测定其对己知阳性致癌物（诱变剂的生物活性，确定最适用量，或者按一般用量，即每平皿o.5 mL S-9混合液（含s9 50 口。S-9活性和用量应在报告中予以说明。6 菌株及其鉴定和保存6. 1 采用四株鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株TA97、TA98、TAIOO、TA102、。TA97和TA98可检测各种移码型诱变剂；TAlOO可检测引起碱基对置换的诱变剂，TA102能检出其他测试菌株不能检出或极少检出的某些诱变剂，如甲摩、各种过氧化氢化合物和丝裂霉素

14、C等交联剂。一般用来测试受试物诱变性时，必须通过四个菌株的检测。必要时可增加TA1535,TA1537或TA104任一菌株。6. 2 菌株特性应与Ames试验标准相符见表Al）。突变型菌的某些特性易丢失或变异，遇到下列情况应鉴定菌株的基因型地在收到培养菌株后山当制备一套新的冷冻保存株或冰冻干燥菌株时；c.当每皿自发回变数不在正常范围时；d.当对标准诱变剂丧失敏感性时；e.使用主平板传代时f.投入使用前。鉴定方法如下：6. 2. 1 增菌培养：在5mL蕾养肉汤培养基中接种贮存菌培养物，于37振荡（100次min）培养10h 或静置培养16h备用。6.2.2 组氨酸缺陷型的鉴定6. 2. 2. 1

15、 加热融化底层培养基两瓶（一瓶不如组氨酸，一瓶加组氨酸，不如组氨酸者每100mL底层培养基中加0.5 mg分子D生物素。.6 mL；加组氨酸者每100mL底层培养基中加L组氨酸（每100 mL中含o.4043 g)l mL和0.5 mg分子D生物素o.6 mL，冷却至50左右，各倒两个平皿e6.2.2.2 接种：取有组氨酸和无组氨酸培养基平皿各一个，按菌株号顺序各取一白金耳菌液划线（直线）接种在培养基表面，37培养48h. 6. 2. 2.3 结果：四株菌在有组氨酸培养基平皿表面各长出一条菌膜，无组氨酸培养基平皿上除自发回变菌落外无菌膜，说明受试菌株确为组氨酸缺陷型。6.2. 3 脂多糖屏障缺

16、陷的鉴定6. 2. 3. 1 加热融化营养肉汤琼脂培养基。6. 2. 3. 2 接种：取菌液0.1 mL移入平皿迅速将营养肉汤琼脂培养基（冷却至50左右适量倒入平皿，混匀，平放凝固。将无菌滤纸片一片放入巳凝固的培养基平皿中央，用移液器在滤纸片上滴加0.1% 结晶紫溶液10严L,37培养24，每个茵做一个平皿。6.2. 3. 3 结果：阳性者在纸片周围出现一个透明的抑制带，说明存在rfa（深粗型）突变。这种变化允许某些大分子物质进入细菌体内并抑制其生长。TA97、TA98、TAlOO和TA102均有抑制带，野生型鼠伤554 寒沙门氏菌没有抑制带。6.2.4 R因子的鉴定GB 15193. 4-9

17、4 6. 2. 4. 1 加热融化营养肉汤琼脂培养基，冷却至50左右，适量倒入平皿中，平放凝固，用移液器吸0. 8%氨节青霉素10！，在凝固的培养基表面依中线涂成一条带，待氨苦青霉素溶液干后，用接种环与氨节青霉素带相交叉划线接种要鉴定的菌株，并且接种一个不具有R因子的菌株作氨节青霉素抗性的对照（一个平皿可同时鉴定几个菌株），37培养24h。6.2.4.2 结果4个菌株经过24h培养，在氨节青霉素带的周围依然生长不受抑制，即有抗氨节青霉素效应证明它们都带有R因子。6.2.5 四环素抗性的鉴定6.2.5. 1 用移液器各吸取510L o. 8%四环素溶液和0.8%氨书青霉素溶液，在营养肉汤琼脂培养

18、基平皿表面依中线涂成一条带，待四环素和氨韦青霉素液干后，用接种环与四环素和氨书青霉素带相交叉JGrj线接种TA102和一种有R因子的菌株（作四环素抗性的对照），37培养24h。6. 2. 5. 2结果，TA102菌株生长不受抑制，对照菌株有一段生长抑制区，表明TA102菌株有抗四环素效应。6.2.6 uvrB修复缺陷型的鉴定6.2.6. 1 在营养肉汤琼脂培养基平皿表面用接种环划线接种需要的菌株。6.2.6.2接种后的平皿一半用黑纸覆盖，在距15w紫外线灭菌灯33cm处照射8s,37C培养24h. 6. 2. 6. 3 结果z对紫外线敏感的三个菌株（TA97、TA98、TAlOO）仅在没有照射

19、过的A半生长，具有野生型切除修复酶的菌株TA102仍能生长。6.2. 7 自发回变率的测定6.2. 7. 1 准备底层培养基平皿8个。6.2. 7.2 融化顶层培养基8管，每管2ml，在45水浴中保温。6.2.7.3 在每管顶层培养基中，分别加入待鉴定的测试菌株的菌液0.1 mL，一式二份，轻轻摇匀，迅速将此试管的内容物倾入己固化的底层培养基平皿中，转动平皿，使顶层培养基均匀分布，平放困化，37培养48h计数菌落数。6.2. 7.4 结果：每一株的自发回变率应落在表Al所列正常范围内。6. 3 鉴定合格的菌种应保存在深低温（如80）或加入9%光谱级DMSO作为冷冻保护剂，保存在液氮条件下（19

20、6），或者冰冻干燥制成干粉，4保存。除液氮条件外，保存期一般不超过2年，主平板贮存在4，二个月后丢弃，TA102主平板保存两周应该丢弃。7受试物剂量、溶剂和特殊处理7. 1 受试物最低剂量为每平皿o.2吨，最高剂量为5mg，或溶解度允许，或饱和浓度，或对细菌产生最小毒性浓度，每种受试物在允许最高剂量下用4个（含4个）以上剂量，每剂量问隔不超过5倍，每个剂量应做三个平皿，否则应说明选定剂量的理由。7.2 溶剂可选用水、二甲基亚枫（每皿不超过o.4 mL），或其他溶剂（毒性剂量以下）。无论选用什么溶剂均应元诱变性。7. 3若遇特殊样品作非常规处理时应在报告中说明。对以下几种情况可作如下处理：7.

21、3. 1 含组氨酸样品：根据食品中测得的组氨酸含量若能诱发回变率的增高可加设组氨酸平行对照组p或将检品经XADE树脂柱过滤洗脱预处理。7. 3. 2 食品包装材料及其制品成分：根据材料或制品的组成成分，可分别采取过筛抽援、蒸发残渣等技术处理。7.3.3挥发性样品可采用真空干燥器处理等方法。7. 3. 4 天然植物材料可按植物化学方法制备粗制品或纯制品。一 GB 15193. 4-94 S方法和步骤可分为平板掺入法、预培养平板掺入法及点试法簿，分别叙述如下2a. 1 平板掺入法B. 1. 1 增蕾培养z取营养肉汤培养辈革5mL,1JU入无苦奋小三角瓶或无蔼试管中，将交平板或冷冻保存的茵株培养物接

22、种子苦苦养内混培养基内，37振荡（100次田in）培养1苟且至对数增长期，每毫升不少于1 2X 10活菌数，培养瓶可用黑纸包裹，以防光线照射细菌。8. 1. 2 底层培养基工flll1若干个。8. 1.3 融化顶层培养基分装于无商小试管，每管2mL，在45水自吁中保温。在1.4 在保辈革必I重Ji!培养基中依次放入3革试窟株新鲜士曾葱液0.l扭L，混匀；如受试物在能o.2 mL （需溶化时加10%5-9混合液o.5 mL），再渴匀，迅速倾入底层培养基在上，转动平陈俊lJ!层培养基均匀分布在底层上，平放固化，37培养48h观察结果ea. 1. 5 另做一阳性对照和空臼对照，不加测试物只加标准诱变

23、剂见附录A2.2 ,A2. 3）或溶剂，如二甲基荒草草（光谱纯或分析纯，其他方法网上。8.2预培养平板掺入法：预培养对子某些受试物巧取得较好效果。131此可根据情况确定，是否进行预培养。我加入顶层琼脂前，先进行以下预培养步骤s在试验中，将受试物（需活化时加入10%S9混合液和菌液，在37中培养20min，或在30中培养30min，然后再加2mL顶层琼脂，其他同上述平板掺入法。8-3 点试法8. 3. 1 与掺入法8.1. 1相同。8.3.2 与掺入法8.1. 2相同。8. 3. 3 与掺入法8.1. 3相同。8. 3.4 在水洛中保戳在专顶层楼养葵中被次却入测试葛糠增葱液0.1 mL（需要对主

24、n10%s g混合液。.5 mL) ,jll匀，迅速倾入底层培养葵上，转动平i区，使顶层培养基在底层上均匀分布。平放西化后耳史无商滤纸团片（直径为6mm），小心放在巳固化的顶段培养基的适当位置上，用移液器取适量受试物如10 川，点在纸片上，或将少量固体受试物结晶加311J纸片或琼脂表团，37培养48h观察结果。B. 3. 5 另做il!l姓对照相空d对蕉。将EU受试物改加标准孩突变物（鬼附录A2.I .AZ. 3）或溶剂奴工工Ejl慕豆豆哥在，其他步骤网上。9结果的判定和报告9. 1 掺入法的结果判定z以直接计数培养基上长出阁变菌落数的多少商定，如在背景生长良好条件下，受试韶交蕾落数增统一倍以

25、上部部交蕃落数等于草草大子2乘以空白对黑数，并有剂量反应关系或至少某一测试点有可重重复的并有统计学意义的阳性反应，即可认为该受试物为诱变限性，9. 2 点试法的判定z如在受试物点梓纸片周围t支出较多密集的阴变菌落与空白对照相比有明显区别者，可初步步lj定该受试物为阳性，假应该用掺入法试验来确证。9.3 结果报告z出报告时，限性结果至少应做三次测试，阴性结果至少进行二次测试，才能对受试物作出判定。受试物的诱变性要甩子板掺入试验来确证。报告中应注确实验条件和附上全部结果资料，对结果有疑义者需经统计分析，同一样品必须包括活化和非活化的结果，剂量单位为每平板微克，特殊例外。结果记录和报告格式见附录A3

26、.1和A3.2o 36 GB 15193. 4 94 附录A菌株生物学特性鉴定标准、标准诊断性诱变剂、试验记录及报告格式（补充件A1 菌株生物学特性鉴定标准、标准诊断性诱变剂、试验记录及报告格式菌株生物学特性鉴定标准结果见表Al.表Al基因型菌株组氨酸脂多糖R因于uv500. 在毛霉素和赞氮锵溶解在水中，其他所有化合物溶解在DMSO中用PCB诱导的大鼠S9(20 L/JIJ活化2-AF.梁毛霉素在点试中产生最低效应，应作平板掺入试验（见表A3）。！CR191 2 甲氯字6氯代93(2氯乙型串）氨基丙胶叮瞧.2盐酸，inh一因诱变Jill毒性寻l施的生长抑制A2. 2 诊断险诱变)ij在平板掺入

27、中的测试结果究表A3.表A3剂量每皿回变菌落数诱变剂曰“9g/l皿TA9./a TA98 TA!OO TA!02 柔毛理睡禀6.0 124 3123 47 592 叠氮销J. 5 76 3 3C O 186 JCR-191 J. 0 1640 63 185 。链黑霉素0.25 ininh inh 2230 丝裂霉萦C0 5 inh nh inh inh 2，7一二百由3草药铺0. 2 8377 8244 400 16 4稍基磷“主在撑二按20. 0 2160 1599 798 。4硝基喳琳户忡氧化物0 5 528 292 4220 287 甲基礁酸泪国普1. O(L) 174 23 2730

28、6586 敌宽松50 0 2自881198 l在3895 2乙烯氨基药JO. 0 十1742 6194 3026 261 苯并归ltt!. 0 由337 143 936 255 注2所列数锻代表is西变穗落数毡，敦白剂黛反应的续性部分，对照值已扣除，用PCB诱导的灾鼠府S-9(20 L/lJl1）活化2-AF和悲并（a）花.inh，指键黑霉素在无毒性范围（小于o.25 g）内没有检出诱变性，每0.005附在TAJOO引起的回变菌落数小于701丝裂霉素对uvrB商株是致命的。A2. 3推荐用于点试和掺入平板的标准诱变剂见表A4。表A4方法5于9TA97a TA98 TAJOO TAI02 敌克松

29、敌克松叠氮倒敌宽松点试十主氨基茹2氨基药2氨基荡敌克松敌克松叠榄销敌克松掺入+ 2氨基药2氨基药2氨基药558 . GB 15193.4 94 A3 Ames试验报告送样单位样品名称（中文）（英文）送样日期方法：（常规平板掺入、预培养、点试、其他）菌株生物学性状菌浓试样最小毒性剂量溶解度溶剂及量S-9来源蛋白含量活性用量结果表A5Ames试验点试法、掺入法结果称剂量TA97 TA98 TA!OO 名g皿-59 十59-59 +S9 一59十日9样品空白对照溶剂对照阴性对照注1）点试法结果为每皿回变菌落数，用符号表示g掺入法结果为每皿回变菌落数ex士SD）。结论TA102 一59+S9 检测单位名称：（盖章）年月日附加说明：本标准由卫生部卫生监督司提出。本标准由卫生部食品卫生监督检验所、北京医科大学、浙江医科大学负责起草本标准主要起草人戴寅、丁兰、金钟初、郭世辞。本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。5S9