GB 15193.16-2003 代谢试验.pdf

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1、JCS 07. 100 c 53 中华人民共和国国家标准代谢试Metabolic study 2003-09-24发布中华人民共和国卫生部中国国家标准化管理委员会GB 15193. 16-2003 代替GB15193. 16 1994 验2004-05-01实施发布103 GB 15193. 16-2003 104 前- 在习本标准全文强制。本标准代替GB15193. 16 1994代谢试验。本标准与GB15193. 16 1994相比主要修改如下将“实验动物“、“剂量及分组”分别单列为章题；在“范围”中增加了：生物物质、兽药、食品容器、食品工具、设备、洗涤剂、消毒剂、食品新资源及其成分等，以

2、及在这些过程中产生和或污染的已知化学物质或与己知化学物质结构基本相同的衍生物在体内的代谢转化途径及转归；原文本中的“药”改为“受试物”。自本标准实施之日起，GB15193. 16 1994同时废止。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位：中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所。本标准主要起草人朱家琦、陈君石。本标准于1994年首次发布，本次为第一次修订。GB 15193.16-2003 代谢试验1 范围本标准规定了代谢试验的基本技术要求。本标准适用于评价我国创新的化学和或生物物质（食品添加剂、食品容器与包装材料、食品工具、设备、洗涤剂、消毒剂、农药残留、兽药残留、食品新资源及其

3、成分），以及在这些过程中产生和或污染的已知化学物质或与已知化学物质结构基本相同的衍生物在体内的代谢转化途径及转归。2原理受试物在体内可发生一系列复杂的生化变化。受试物经胃肠道吸收后通过血液转运到全身各组织器官，再经过生物转化，由各种途径排出体外。因此，受试物原形物在逐渐被代谢降解，而其代谢产物不断生成。测定灌胃后不同时间内受试物原形物或其代谢物在血液、组织或排泄物中的含量，以了解该受试物在动物体内的毒代动力学特征，包括吸收、分布、消除的特点，组织蓄积及可能作用的靶器官等，根据数学模型，求出各项毒代动力学参数。同时采用分离纯化方法确定主要代谢产物的化学结构，测试其毒性并推测受试物在体内的具体代谢

4、途径。通过本实验的观察，对受试物在体内的过程可做出正确评价，为阐明该受试物的毒作用性质与程度提供科学依据。3 仪器与试剂3. 1 根据实验室条件，配备高效薄层包谱、高效液相色谱、气相色谱、气质联用及紫外光、荧光检测等仪器设备。3.2 放射性测量仪器：液体闪烁计数仪及闪烁液。3.3 实验室常用仪器与试剂。4 实验动物原则上应尽量使用与人具有相同代谢途径的动物种系。一般选用两种性别、体重为22g 28 g成年小鼠或170g 200 g大鼠。试验开始时动物体重的差异应不超过平均体重的土20%。5 剂量及分组选用低于最大未观察到有害作用剂量，需要时可用高、低两种剂量。可单次或多次给予受试物。如采用标记

5、化合物，除确定化学剂量外，放射性剂量一般小鼠为10Ci只20Ci只（0.4 MBq只o. 8 MBq只）、大鼠100Ci/kg 250 Ci/kg( 4 MBq只9MBq只）。6 操作步骤6. 1 受试物配制一般用蒸馆水作溶剂，如受试物不溶于水，可用食用油、医用淀粉、竣甲基纤维素配成乳化液或悬浮液。受试物应于灌胃前新鲜配制，除非奋资料表明以溶液（或悬浊液、乳浊液等）保存具有稳定性。6.2 给受试物途径以灌胃为主，灌胃前动物禁食16h 18 h，自由饮水。进行毒代动力学分析时，最好同时采用灌胃和静脉注射。105 GB 15193. 16-2003 6.3试验项目进行代谢试验前，需建立测定生物样品

6、中受试物含量的微量化学分析方法或标记受试物的同位素示踪方法。6. 3. 1 血浆申受试物含量或放射性水平的测定于动物灌胃后6个10个不同的时相采血，每个时相的动物数不应少于3只。结果以每毫升血浆中受试物含量或放射性强度为纵坐标，时间为横坐标，在半对数纸上作药时曲线。如以化学分析方法测定受试物含量，用已编制的药代动力学计算机程序进行曲线拟合，按房室模型求出毒代动力学方程及各项代谢动力学参数。如用同位素示踪法测定血浆总放射性水平，作代谢动力学分析时应谨慎。6.3.2 胃肠道吸收于灌胃后不同时间处死动物，取出胃肠道及其内容物（包括粪）做成匀浆，测定受试物含量或放射性水平，以灌胃后即刻处死动物的胃肠道

7、回收量为100%，分别观察不同时相的各组动物中受试物或放射性自胃肠道消失的情况。以上述不同时相回收量的百分数为纵坐标，时间为横坐标，在半对数纸上作图，求得受试物或放射性在胃肠道的消失速率。为确定受试物在胃肠道的消失速率是否能反映在体内的吸收情况，需进行离体胃肠道温孵试验，即将受试物注人离体胃肠道后结扎两端，于37Krebs液中振荡温孵1h，测定受试物的回收率，以观察受试物在胃肠道内有元受到破坏由此估计受试物在胃肠道的吸收速率。6.3.3 主要器官和组织中的分布于灌胃后取2个3个不同时相处死动物，对肝、肾、脑等器官和组织进行受试物含量或放射性测定，以找出受试物含量最高的组织和时间。6.3.4 排

8、泄6.3.4.1 尿、粪排泄：给动物灌胃受试物后放入有机玻璃代谢笼内，于3天7天内按规定时间收集尿和粪。如发现尿粪互j昆，则把标本弃去再另收集。作代谢产物结构分析时应把收尿容器放在冰浴中并注意避光。6. 3.4.2 胆汁排泄轻度乙隧麻醉下给动物施行胆道插管，待动物清醒后以受试物灌胃，收集不同时间的胆汁（不少于24h）。从不同时间收集的尿、粪、胆汁标本中的受试物含量或放射性强度，分别计算其累积排出量（占灌胃剂量的百分数）。6. 3. 5 生物转化按受试物的化学结构和文献资料，估计可能产生的代谢产物。给动物以受试物后，收集尿、胆汁等标本，或在体外代谢条件下采用肝微粒体、酶活性系统和受试物于37振荡

9、培养，以提取、纯化后进行代谢物的结构鉴定。分析子段包括薄层色谱、气相色谱、液相色i菁、质谱、红外光谱等。要有预测的代谢物纯品作标准。如采用标记化合物，样品经薄层色谱分离后用放射性薄层扫描仪或分段刮下硅胶测定放射性，由此值判定并测量受试物的量及可能的代谢产物，再作进一步分析。从代谢物的分离与鉴定，对受试物在体内的可能代谢途径做出推断。6.4 同位素实验中的注意事项同位素方法是毒物代谢实验中不可缺少的手段之，常列为首选的实验方法，它具有灵敏度高、样品和j备较简单、不易受生物材料中杂质的干扰，可以示踪观察受试物进入体内后的归宿等优点结合化学分析法如薄层色谱、液相色谱法，可把原形物和代谢物分开以初步确

10、定代谢物的可能存在形式。用放射自显影法可定位观察受试物和代谢产物在整体动物或某些组织中的分布定位。6. 4. 1 标记化合物要求6.4.1.1 标记核素2由实验目的、受试物分子结构、半衰期、经费等因素而定。常用H、C,S等。6.4.1.2 标记位置z应标记在受试物结构中具有生物活性的基团上，即定位标记。如生物活性基团不清楚，则可采用均匀标记或全标记。标记位置在化学结构上应是稳定的。按不同研究日的，可单标记、106 GB 15193. 16-2003 双标记或多标记。6.4.1.3 放射化学纯度：标记物应保证高度的放化纯度（至少90%以上），必要时用薄层色谱法进行纯化。6.4.1.4 放射性比度

11、z随受试物毒性大小而定。毒性大的受试物，要求高放射性比度的标记物。用非标记受试物稀释配制成实验所要求的化学剂量。6.4.2 放射性样晶的测量代谢试验常用的标记放射性核素大都属软自射线，测量食品主要为液体闪烁计数仪。6.4.2.1 样品制备z酸消化法。组织0.1 g、血浆。.1 mL、粪混匀液0.I mL（粪加水制成匀浆液，或粪红外灯烘干后研磨成粉，称0.I g）两份，加高氯酸。.2 ml，过氧化氢0.4 ml，和正辛醇一滴，80水浴消化45min，加蒸馆水定容至ImL，取出口.I mL，加人3mL 5 mL闪烁液进行放射性测量（胆汁、尿离心后可直接取样测量）。闪烁液配方为0.4% 0. 6 %

12、 2. 5二苯基恶略CPPO）、o.01 %0.03%1,4 双5苯基恶瞠基2苯CPOPOPJ、二甲苯（或甲苯）与乙二醇聚氧化烯异辛基酣隧（TritonX 100) （比例2 I）。有条件者可用固体闪烁晶体。6.4.2.2 样品测量法：均相测量法。样品经洋灭校正后，以每克组织或每毫升血浆中每分钟放射性衰变数（DpMl表示。6. 4.2.3 放射性测量误差z放射性测量的相对标准误差应不超过5%10%。一次测量结果的相对标准误差表示为：SE(%l 土主100式中：r 计算率，次min;t 测量时间，min, 6.4.2.4 遵守放射性卫生防护操作规程。6.5 对生物样晶中受试物分析方法的要求建立一个灵敏、特异、重现性好的测定方法。7 结果判定、jrt 7. 1 根据吸收速率、组织分布以及排泄情况，估计受试物在体内的代谢速率和蓄积性。7.2 根据主要代谢物的结构及性质，推断受试物在体内的可能代谢途径以及有无毒性代谢物的生成情况。107