GB 15193.10-2003 非程序性DNA合成试验.pdf

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1、ICS 07. 100 c 53 中华人民共和国国家标准GB 15193. 10-2003 代替GB15193. 10 1994 非程序性DNA合成试验Unscheduled DNA synthesis test 2003-09-24发布中华人民共和国卫生部中国国家标准化管理委员会2004-05-01实施发布69 GB 15193. 10-2003 前-R 本标准全文强制。本标准代替GB15193. 10 1994非程序性DNA合成试验。本标准与GB15193. 10 1994相比主要修改如下：在“范围”中增加了受试物的具体内容：食品生产、加工、保藏、运输和销售过程中所涉及的可能对健康造成危害

2、的化学、生物和物理因素，检验对象包括食品添加剂（含营养强化剂）、食品新资源及其成分、新资源食品、辐照食品、食品容器与包装材料、食品工具、设备、洗涤剂、消毒剂、农药残留、兽药残留、食品工业用微生物等g在“试剂”中，增加了“参考阳性对照物”，7,12二甲基苯并惠（7,12 dimethylbenzathracen时，2乙酸氨基药（2acetylaminofluorene) ,4硝基喳琳氧化物（4nitroquinoline oxide) ,N甲墓亚硝胶CNdimethylnitrosamine); 在“UDS的液体闪烁计数显示法”中：增加“每组（包括对照组）至少做6个培养瓶。”在“UDS的放射自显

3、影显示法”中，增加了“应同时设有阳性对照组和阴性对照组，包括加S9和不加s9两种情况气增加了“结果判定”内容。自本标准实施之日起，GB15193. 10 1994同时废止。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位浙江医科大学。本标准主要起草人：徐应年、丁辰。本标准于1994年首次发布，本次为第次修订。70 GB 15193. 10-2003 非程序性DNA合成试验1 范围本标准规定了非程序性DNA合成试验的基本技术要求。本标准适用于评价食品生产、加工、保藏、运输和销售过程中所涉及的可能对健康造成危害的化学、生物和物理因素的诱变性和或致癌性，检验对象包括食品添加剂（含营养强化剂）、

4、食品新资源及其成分、新资源食品、辐照食品、食品容器与包装材料、食品工具、设备、洗涤剂、消毒剂、农药残留、兽药残留、食品工业用微生物等。用这种短期筛选方法可以检测出些短期体外试验法所不能检出的诱变剂和或致癌剂。2 术语和定义下列术语和定义运用于本标准。2. 1 非程序性DNA合成unscheduled DNA synthesis, UDS 当DNA受损伤时，损伤修复的DNA合成主要在5期以外的其他细胞周期，称非程序性DNA合成。3 原理正常情况下，于细胞有丝分裂周期中，仅5期是DNA合成期。当DNA受损伤时，损伤修复的DNA合成主要在其他细胞周期，称程序外DNA合成，即UDS，因此发现UDS增高

5、，即表明DNA发生过损伤。在体外培养细胞中，用UDS的测量来显示DNA修复合成的主要关键在于如何鉴别很高水平的半保留DNA复制和水平较低（充其量只有半保留DNA复制的5%）的UDS这可以用同步培养将细胞阻断于Gl期并用药物（常用经基腺）抑制残留的半保留DNA复制后显示。同步培养可用缺乏必需氨基酸精氨酸的培养基（ADM）使DNA合成的始动受阻而使细胞同步于Gl期。在这些半保留DNA合成明显抑制和阻断了的细胞中，UDS即可用H胸腺暗院核苦的掺入增加显示。它可用放射自显影或液体闪烁计数法进行测量。4 试剂与器材4. 1 试剂全部试剂除注明外，均为分析纯，试验用水为双蒸水。4. 1. 1 参考阳性物对

6、照物z可用712二甲基苯并惠（7, 12 dimethylbenzathracene), 2乙酌氨基药( 2-acetylaminofluorene），硝基哇琳氧化物（4 nitroquinoline oxide ) , N甲基亚硝胶（Ndimethylnitrosamine）。4. 1. 2 细胞增殖用培养基zEagle氏最低要求培养基（MinimalEssential Medium，简称EMEM)85份，小牛血清15份，加入青霉素、链霉素贮存液1份，使青霉素、链霉素的最终浓度分别为100单位及100吨mLoEMEM培养基可选用各种商品供应之粉末培养基按生产厂商提供资料配制并除菌。4冰箱贮存

7、。4. 1. 3 同步用培养基：不含精氨酸之Eagle氏MEM培养基CADM)98份，小牛血清2份，青霉素、链霉素浓度同细胞增殖用培养基。71 GB 15193. 10-2003 4.1.4 Hanks平衡盐溶液（HBSS)贮液A:将氯化纳160g，氯化御8g，硫酸镶（MgSO生7H,0)2 g及氯化模CMgCI, 6H,Ol2 g溶于800ml，双蒸水（5060）中。另取无水氯化钙2.8 g溶于100mL双蒸水中。将上述两溶液混合后，加水至1000 ml，加入三氯甲炕2mL，保存于4冰箱中。贮液B：将磷酸氢二纳（Na2HPO, 12H20)3. 04 g（或Na2HPO, ZH20 1. 2

8、 g）、磷酸工氢梆CKH,PO, 2H,0)1. 2 g C或KH,PO,0. 95 g ）、葡萄糖20g溶解于800mL双蒸水中，加入100ml, 0. 4%盼红溶液（取盼红1g，溶于3ml, 1 mol/l，氢氧化锅中，待完全溶解后，加入双蒸水中至250 ml，），加水至1000 mL, !JO入三氯甲烧2mL，保存于4冰箱中。贮液C:l.4%碳酸氢纳以双蒸水配制。应用液的配制：取A液1份，B液1份，水18份，混合后分装于玻璃容器内；高压灭菌，4冰箱保存。用前加入1.4%碳酸氢锅，将pH调整至7.27.4。4. 1. 5 磷酸缓冲液（元钙、矮的Dulbecco氏磷酸缓冲液）（pH7.4)取

9、氯化销8.00 g、磷酸二氢佣0.20 g、氯化饵o.20 g、磷酸氢二纳CNa，日PO, 12H20)2. 89 g溶于1000 ml，双蒸水中。4. 1. 6 0. 02 %乙二胶囚乙酷二销或四纳（EDTA）溶液。取EDTA0.2g溶于元钙、续之磷酸缓冲液中，使成1000 ml,0高压灭菌后使用。4. 1. 7 抗菌素贮存液取l临床注射用青霉素G100万单位及链霉素1g之粉针，在无菌操作下溶于100mL之灭菌蒸馆水中，使青霉素及链霉素在溶液中之浓度分别为1万单位及10000 g/mL，使用时每100mL培养基中加入抗菌素贮存液lmL。4. 1. 8 大鼠肝微粒体S-9组分的制备：按GB15

10、193 . 4执行。S-9混合液可按以下方式配iliJ：将磷酸氢二纳（Na2HPO, 12日，0)86. 8 mg、磷酸二氢梆7.0 mg、氯化续CMgCl2 6H20)8. 1 mg,6磷酸葡萄糖（GPJ5.4 mg、辅酶IIc co II J 纯度90%)4mg溶于ADM中，加入lmol/l, N 2起乙基哝嚓N2乙磺酸CHEPES）溶液0.2 mL及大鼠肝s9组分0.8 mL 4 mL或20mL，并用碳酸氢纳溶液调整pH至7.2 7. 4。4. 1. 9 显影液及定影液（放射自显影用）4. 1. 9. 1 Kodak D-170显影液贮液：元水亚硫酸饷25g、澳化饵1g，水加至200mL

11、0使用时用水稀释至1000 mL，溶入Amitol(2氨基盼盐酸盐）4.5 g 4.1.9.2 KodakD-196显影液水（50C)500mL，顺次溶入米吐尔（硫酸对甲氨基苯盼）2g，无水亚硫酸锅72g，对苯二盼8.8 g，元水碳酸纳48g，漠化饵4g. jJ日水至全量1000 ml, 4.1.9.3 停显液，98%冰乙酸15mL，加水至1000 mL0 4. 1. 9. 4 Kodak F 5定影液水（50）100mL，依次溶入海波240g，无水亚硫酸纳15g,28%乙酸48ml，棚酸7.5 g，饵矶15g, 加水至1000 ml，。4. 1. 10 0. 25 mol/l，及0.5 mo

12、l/L高氯酸：70%高氯酸（售品）8.57mL，加水至100mL为lmol/L。4. 1. 11 闪烁液：称取2.5二苯基略略CPP0)5g,l,4双5苯基略略基2苯CPOPOP)300mg溶于甲苯中，便成1000 mL0 4.2 器材应用次性细胞培养用器皿及微孔滤膜，可避免繁琐的洗涤工作，并可提高实验质量。4. 2. 1 玻璃类z在自来水中将污物冲净，在肥皂或洗衣粉溶液中煮沸5min，稍冷后在热肥皂水内反复洗刷，用自来水冲洗干净。干后浸于清洁液内过夜。取出后用自来水反复冲洗12次。再用蒸馆水冲洗72 GB 15193. 10-2003 2次，于蒸馆水中浸泡24h，取出后用蒸馆水再冲洗2次，烘

13、干。所用玻瓶用纸包扎瓶口，移液管及滴管在近端管内塞入棉花栓后用纸包裹。4.2.2 橡皮类：自来水中冲洗干净后，在肥皂水内煮沸，若为新购置的，则用4%氢氧化纳煮沸10min, 再用4%盐酸煮沸10min。自来水流水冲洗2h以上。再于蒸馆水中煮沸2次，用蒸馆水冲洗后，浸泡于蒸馈水中24h，干燥后，用玻璃纸包装，置于容器内。4.2.3 6号玻璃滤器（除菌用）：新购置的滤器浸入含少量亚硝酸纳的热硫酸内24h，蒸馆水拍滤后，用氮氧化锅溶液抽滤至中性，再用双蒸水抽滤2次，烘干后配上橡皮塞后包扎。滤器使用后立即用蒸馆水抽滤一次，随后用1%亚硝酸锅硫酸溶液（硫酸溶液浓度0.5 mol/L）抽滤后，浸于该硫酸溶

14、液内（注意必须使滤板的两侧都浸于酸内）。清水冲洗后，用蒸馆水抽滤3次，干燥后，配塞包扎。4.2.4 器材的消毒z对不带橡皮塞的玻具及金属用具可用干热灭菌，温度升至140C后，保持2h ，橡皮类及带橡皮塞之玻具应用高压灭菌12030min。溶液除不耐热的应用抽滤除菌外，耐热的可用高压灭菌，一般用11510min。5 操作步骤5. 1 细胞的传代、维持和贮存用于化学致癌物在体外培养细胞中诱发UDS的实验研究的哺乳类细胞的种类很多。人类细胞的UDS反应大于啃齿类细胞。在化学致癌性检测试验中很多人使用人类细胞。这有一个可取的优点，即某一化学物质对人类危害作评价时，可减轻因种属差异而导致推论错误的风险。

15、使用最多的人类细胞为成纤维细胞，外周血淋巴细胞，单核细胞和Hela细胞等。使用人羊膜细胞Fl，株，是一种上皮细胞系，且该羊膜细胞富含有可诱导的药物代谢酶系。生长成单层的细胞，除去培养基。用Hanks平衡盐液CHBSS）洗涤后，用0.02%EDTA或0.I%膜酶溶液（于无Ca2、Mg十之磷酸盐缓冲液中）于37下处理数分钟使细胞退缩，细胞间隙增加。再用HBSS洗涤1次，加入适量培养基，反复吹吸，使细胞自玻面上脱下并分散于培养基中。取细胞悬液一滴，加于血球计数池中，计数四大格中的细胞数，计算出悬液中之细胞浓度（四大格的细胞数4X IO即为每毫升所含细胞数）。将细胞悬液生长培养基稀释至0.5 I 05

16、个ml，1105个mL，将上述细胞悬液接种于培养瓶中（30mL培养瓶可接种3mL。100ml，的培养瓶可接种10mL）。每次接种3份，长成融合单层后取其中一瓶再按以上方法传代接种3瓶。另两瓶在证明传代成功后弃去或供实验所用，这样可保证细胞在实验中延续保持。有条件可按下法将细胞贮存于液氮中。若较长时间不用，不必在实验室中维持。在需要时取出经增殖后供实验所用。将细胞增殖至所需数量后，按上法制成细胞悬液（于生长用培养基中）。细胞浓度为1105个mLI.5105个ImL，在冰浴中，逐渐加入为细胞悬液总量10%的灭菌二甲基亚枫。然后将细胞悬液分装于洁净干燥之灭菌或细胞冻存专用塑料小管中，每份Iml，封口

17、后，置于4中2h 3 h，然后移至普通冰箱之冰室内4h 5 h，再移人3020之低温冰箱内过夜。次日晨将安瓶移人生物用液氮储存器内。需用时，将安瓶或小塑料管锯（打）开，除去含有二甲基亚枫的培养基，加人适量之生长用培养基，并调整细胞浓度至10x 10个mL 15 1 o个ml，。分种于细胞培养瓶中，37培养Ih后，换培养基一次，将无活力之细胞除去，待长成融合单层后分传增殖维持于实验室中。5. 2 UDS的放射自显影显示法将细胞增殖至所需数量后，按上述方法制成单细胞悬液，细胞悬于生长用培养基CEMEM85小牛血清15）中。浓度为0.5105个mL1105个ml，将上述细胞悬液接种于置有小盖片（18

18、mm 6 mm）之培养瓶中，37C培养1天3天，使细胞在盖片上生长至适当密度。培养瓶接种数目根据检品的数目、所选剂量级别而定。每一剂量作2个3个样片，并另备4个6个样本供溶剂对照和己知致癌物的阳性对照用。细胞在增殖培养后，按以同步培养用培养基CADM补以1%小牛血清）作同步培养3天4夭。在实验前一日下午，加入溶于ADM之资基腺CHU）溶液，使HU在培养基中之终浓度73 GB 15193. 10-2003 为10mmol/L。继续在37下孵育16h，然后将上述长有细胞之盖片置于含有不同浓度之检品、HU（浓度为10mmol/L）及3日胸腺嘈睫核音（5Ci/mL 10 Ci/mL,30 Ci/mmo

19、l）之同步用培养基中。37C中孵育5h0以溶剂及己知致癌物为对照。检品及已知致癌物溶液在实验时新鲜配制。先将它们溶于适当之溶剂（蒸馆水、二甲亚矶、丙嗣等）中，配成最高测试浓度100倍的储液。再依次以溶剂按10倍稀释，作成不同浓度之检品溶液。将各种浓度的检品荒草液，加于培养基中，使溶剂的最终浓度为1%。应同时设有阳性对照组和阴性对照组，包括加S-9和不加S-9两种情况。孵育结束后，用HBSS充分洗涤，用1%拧橡酸铺溶液处理10min，随后用乙薛冰乙酸（3 1 ）固定(4）过夜，空气中干燥后，用少量中性树胶，将盖片粘固于载玻片上，长有细胞的面朝上，45C烘烤24 h 在暗室中，将适量之核4乳胶移人

20、浸渍用之玻璃器皿中，置于40之水浴中令其融化，同时取等量之蒸馆水于一量筒中也置于该水浴中加热，待乳胶融化后，将热蒸馆水倾于乳胶液中，继续在水浴中加温，并用玻璃棒轻轻搅拌，等待10min 20 min，使气泡逸出。在以上准备过程中，将准备作自显影处理之玻片置于水浴之平台上预热。准备就绪后，将玻片垂直浸渍于1 1稀释之乳胶液中约5s，徐徐提出玻片，并将破片背面之乳胶用纱布或擦镜纸拭去。将己涂有乳胶之玻片移入温度为29及JE湿度之温箱中（4h）待乳胶干泪。然后置于内置适量干燥Jlij（变色硅胶）袋之曝光盒中。曝光盒外包以黑色避光纸及塑料纸，置于4冰箱中曝光10夭。曝光结束后，将玻片移人有机玻璃制成的

21、玻片架上，在液温为19之D-170或D-196显影液中显影5min，在停显液中漂洗2min，在F5定影液中定影6min 10 min，再用水漂洗数小时。细胞可在乳胶涂片前用地衣红（2%）冰乙酸溶液或在显影后用H.E或Giemsa染液染色。将玻片脱水透明后，用盖片封固。在油渍镜下，计数各样本细胞核上之显影银粒数，同时计数相当面积之本底银粒数，并自核上之银粒数减去。每张玻片至少计数50个细胞核，计出对照样本、各种浓度检品处理的样本及阳性致癌物对照样本中银粒数核的均值及其统计量。5. 3 UD晤的液体闪烁计鼓显示法将实验用细胞悬于生长用培养基中，细胞浓度为0.510个mL，将细胞接种于液体闪烁计数瓶

22、中，每瓶1mL，并加入Mc胸腺啼皖核昔终浓度为0.01 Ci/mL(50 mCi/m mo！）。37中培养48h使细胞增殖并预标记，去培养基并用HBSS洗涤后，换以含HC胸腺噎咬核背（O.01 Ci/mL）之同步用培养基，在37中进行同步培养2天4天，同步培养结束后，于实验前日下午去培养基，用HBSS充分洗涤后，加入含有浓度为10mmol/L短基腺CHU）之同步用培养基，37中孵育16h, UDS的诱发同放射自显影显示法。细胞在含有HU及H胸腺略破核昔（5Ci/mL,30 Ci/mmol）之同步用培养基中与不同浓度之检品接触5h，孵育结束后去培养基及检品。以冷盐水洗涤2次，随后用冰冷之0. 2

23、5 mol/L过氯酸溶液处理2次，每次2min，以固定细胞并除去酸可溶性成分，再用乙醇处理10min 以除去脂溶性成分及未掺入之标记物，干后以0.5 mol/L 1 mol/L过氯酸0.5 mL于7580之恒温箱中水解40min，使掺入之标记物释出。冷却后加入乙二醇乙酷3.5 ml，及闪烁液CPPOo. 5%、POPOP 0. 03%，以甲苯为溶剂）5ml，振摇后便呈匀相以液体闪烁计数器测定各样本中之C及H的放射活性。每组（包括对熙组）至少i故6个培养瓶。标本中的H放射活性即反映UDS中H胸腺暗院核昔的掺入量；而MC的放射活性反映实验细胞的数目或其DNA量，因此H和C放射活性之比（3H/HC）

24、即为单位质量DNA或单位数目细胞中之UDS水平的反映值，若将溶剂对照的H和uC比值作为100%(1.00），可计算出各个样本中对于对照变化量，并计算各种检品测试浓度的样本中的有关统计量。5.4 受试物的代谢活性建株细胞中药物代i射活化酶系的活性一般都很低，因此对一些需经酶性代谢活化才显示其DNA74 GB 15193. 10-2003 损伤作用的化学物质，可在试验体系中加入以大鼠肝微粒体酶系及辅助因子组成的体外活化系统（S9 混合液），在检品接触时所用的培养基中，另溶入或加入氯化镇（MgCl2 6H20）、磷酸氢二锅、磷酸二氢饵、6磷酸葡萄糖（G6于）、NADP(CoII l及大鼠肝S9组分，

25、s9组分所占比例视检品的亲脂性而变；亲脂性强的可用低百分数的S-9反之，则所用S9组分在活化系中之比例可高些。并加入HEPES(10 11mol/mL），以碳酸氢纳溶液将pH调至7.27.4。6 数据处理可用“t检验”检验各检品接触与溶剂对照间差异有无显著性而做出判断。7 结果判定试验组处理的细胞HTdR掺入数随剂量增加而增加，且有统计学意义，或者最小剂量组反应阳性，与对照组比较具有统计学意义，均可判定为该试验阳性。受试物组处理的细胞3日TdR掺入数不随剂量增加而增加，任何一个剂量组与对照组元统计学上的差异，则认为受试物在该试验系统不引起UDSO判定结果时，应综合考虑生物学意义和统计学意义。75