SN T 3767.7-2014 出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法 第7部分 玉米MIR604品系.pdf

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1、哥也-r国共和境检验检使行标SN/3767.7一2014c 1=11=1 转基成分环介)检测温扩增(第7部分;Al组飞缸wgnqMIR604晶系Loop-mediated isother础alamplification detedion method for geneticaHy modified co血ponentsin food for expor一Part 7 : Maize MIR604 2014-01-13发布2014-08田01实施华人民共和国发布国家藏量监督检验棱痊总局SN/T 3767.7-2014 别吕汕疫检国检境I和验入共检出任民境宁责人入辽L . 挺华出国/刀和中海和叫肘

2、院肚时这学打人ki1J口1工/刀EF曰共华烘以民中胧唰如川讯问几山己川勾L凡又测Nn中生金#-i、jt机1队局验m盯坤mu疫地川剧发。仨检且的口讨在人配件归MN租出轧文并制境津酣咀本山叫人入江川等mL主出出附导规幸会E豆手介耐专员广共。-E及委j民刊暗暗毛系百刷品晾系阶甜涉理阳阳人，:协协脐眼肌肌-1，毛口阳哺呻叫比1，万加明1吨mL系1品可川哺AE厅荆MV剧以mMMqUA叫川日创创俨脐品山山削川阳口阳MM口阳旧日川崎叶肝刊附容阳皿脱脱院时时已m山山山川川Umm川川川mm川mmmm山肌肌mmE川Lr泣食用选米米米乙、米毛主封封叫不米米豆豆豆豆豆t:和稻草Ftt麦菜菜TU的认位局斗川通筛玉玉玉到

3、玉封封4玉玉玉玉大大大大大水水水水水水水水小础袖即G件家单疫剧川批批批批批业业业1111$1111巾mrzmmv123456789111111111122222222223部部注部部境剂。4第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第本本请本本人咱出E头局SN/T 3767.7-2014 验检疫局、中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、广州迪澳生物科技有限公司。本部分主要起草人:凌莉、刘津、易敏英、高苏娟、蔡颖、刘静字、卓锦雪、曾静、李晓虹、陈颖、郑文杰、曹际娟、冯家望、李志勇、石磊、张隽、陈源树、李婷、关丽车。H SN/T 3767.7-2014 出口食品中转基因成分环介导等温

4、扩增(LAMP)检测方法第7部分:玉米MIR604晶系1 范围SN/T 3767的本部分规定了食筛检测方法。本部分适用于玉米及其加工产本方法的定性检测低限为0.52 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是件。凡是不注日期的引用文件，GB/T 19495.2 转基因产品GB/T 19495.3 转基因产品检测GB/T 19495.7 转基因产品检测转基因植物及其产品成分检测公告-16-2010)SN/T 3767.2-2014 出口选方法3 防污染措施环介导等温扩增检测过程的防4 抽样与制样按照GB/T19495.7的规定执行。5 核酸提取纯化按照GB/T19495.3的规定执行。6 LAMP

5、检测方法6.1 原理6. 1. 1 一般原理的环介导等温扩增CLAMP)初，仅注日期的版本适用于本文文件。定性PCR方法(农业部1485号)检测方法第2部分:筛根据转基因玉米MIR604品系外源基因和玉米边界序列设计的内、外引物各一对及环状下游引物SN/T 3767.7-2014 一条，特异特性目标序列和引物碱基序列参见附录A。引物特异性识别目标序列上的六个独立区域，利用Bst酶启动循环链置换反应，在玉米MIR604品系特异目标序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎环DNA混合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应悔液中的Mg2十结合，产生副产物(焦磷酸镜)

6、形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。6.1.2 显色液显色原理SYBR Green 1是一种高灵敏的DNA荧光染料，可以嵌入方式结合到双链DNA的小沟内。当它与双链DNA结合时，荧光信号是游离状态的8001000倍。在不发生扩增反应时，SYBR染料分子的荧光信号不发生改变，颜色显现为橙色;当发生扩增反应时，随着双链DNA的增加，SYBR染料的荧光信号也随之大幅度增强，其信号强度可代表双链DNA分子的数量，同时颜色由撞色变为绿色。6.2 仪器和设备6.2.1 超纯水发生器。6.2.2 水浴锅或加热模板:63.0 oC土0.5oC和80.00C土0.5oC。6.2.3 离心管

7、:0.1mL、1.5mL。6.2.4 移液器:量程0.5L10L;量程10L100L;量程100Ll000L。6.2.5 汁fI才器。6.3 试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。6.3.1 实验用水:应符合GB/T6682中一级水的规格。6.3.2 dNTPs溶液:每利l核背酸浓度10mmol/L。6.3.3 sl DNA聚合酶(如:NEB公司或具有同等效果的DNA聚合酶):酶放度8U/Lo 6.3.4 10ThermolPol缓i中液:含200mmol/L Tris-HCL (pH值为8.8)、100mmol/L硫酸债、100 mmol/L氧化例、20mmol/L硫酸镜、l

8、%Trito日X-100。6.3.5 硫酸镜溶液:150 mmol/L。6.3.6 甜菜碱:5mol/L 6.3.7 显色液:SYBRGre巳n1荧光染料，1000。6.3.8 引物:根据转基因玉米MIR604品系外源基因和玉米边界序列设计一套特异性引物，包括外引物1，外引物2，内引物1和内引物2，下游环引物。外引物扩增片段长度:356bp 外引物1(F3，5一3):AATCTGCCTATCGAGAAGA 外引物2CB3,5-3) :CGGTTCTGTCAGTTCCAA 内引物1CFIP , 5 -3): GTGTGATCTGGCGTCCAGGAACCAGTGAATGGAGATG 内引物2C

9、BIP , 5 -3 ) : CGCACGCAA TTCAACAG AACCTT AA TTCTCCGCTCA TG 下游环引物(BLP, 5 -3): CGGGAAACGACAATCTGA 6.4 实验步骤6.4.1 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置6.4. 1. 1 阴性对照:采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板。2 SN/T 3767.7-2014 6.4.1.2 阳性对照:采用含有目标基因序列的植物DNA或质粒DNA作为模板，浓度应略高于方法检测低限。6.4 .1.3 设两个空白对照:一提取DNA日才设置的提取空白对照(以水代替样品); LAMP反应的空白对照(以DNA溶解

10、液代替DNA模板)。6.4.2 内源基因检测LAMP检测前应先进行内源基因检测，结果阳性则表明从样品中提取的DNA可以进行外源基因检测;否则应重新进行DNA提取和纯化。内源基因的检测参照本SN/T3767.2-2014的规定进行。6.4.3 玉米MIR604晶系LAMP反应体系LAMP反应体系见表1。每个样品各做2个平行管。加样时应使样品DNA溶液完全加入反应液中，不要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后，将1L显色液滴在管盖内侧，盖管盖时应小心，防止显色液混合进入反应液中。表1玉米MIR604品系LAMP反应体系组分工作液浓度力日样量/L反应体系终浓度ThermoPol缓冲液10 2.5 l

11、外引物lCF3)10mol/L 0.5 0.2 fL mol/L 外引物红卫3)10 fL mol/L 0.5 0.2 fL mol/L 内引物lCFIP)40mol/L 1.0 1.6mol/L 内寻|物2(BIP)40mol/L 1. 0 1.6mol/L 下游环引物CBLP)20mol/L 1. 0 0.8mol/L dNTPs 10 mmol/L 3.5 1. 4 mmol/L 甜菜碱5 mol/L 4 0.8 mol/L 硫酸续150 mmol/L 6 mmol/L st DNA聚合酶8 U/L l 0.32 U/L DNA模板100 ng/L 2 8口g/L水补足至25.06.4.

12、4 LAMP反应参数63.0 oC :1: 0.5 oC恒温扩增60min , 80.0 oC :I: O.5 oC 5 min使酶灭活，反应结束。6.4.5 显色反应反应结束后，将显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀，立即在黑色背景下进行颜色观察。6.5 质量控制6.5.1 基本原则:实验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合以下情况。否则，任一种对照如果出现非下述正常结果，应重做实验。6.5.2 空白对照:反应管中液体呈橙色。3 SNjT 3767.7-2014 6.5.3 阴性对照:反应管中液体呈橙色。6.5.4 阳性对照:反应管中液体呈绿色。7 结果判断和确证7.1 待检样品2个平行样反应

13、管中液体均呈橙色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品检测结果为阴性。7.2 待检样品2个平行样反应管中液体至少l管呈绿色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品转基因玉米MIR604品系初筛阳性，还应通过下列方法之一进行确证(见附录A): 一一按照农业部1485号公一一按照欧盟的方法(CRL一一可对外引物PCR扩增产8 结果表述8.2 检测结果为转基因玉米表述。4 证实验情况进行结果判断和SN/T 3767.7-2014 附录A(资料性附录)转基因玉米MIR604品系基因序列A.1 转基因玉米MIR604品系特异目标序列(来自Accessonno.DJ43765 1. 1) 556 AAT

14、CT GCCTATCGAG AAGAGAAGAA AAATTCGTCC ATGGGGCCAC 601 GGCCTCTTCTGCAGGCATTT GGCATGTGAA GGAACCCGAA CCAGTGAATG GAGATGGACG 901 TGACAGAACC G A.2 引物碱基序列及构成B3 , CGGTTCTGTCAGTT F1c FIP , GTGTG A TCTGGCG B1c BIP: CGCACGCAA TTCA BLP: CGGG AAACG A 擦擦擦擦燃燃错附燃然慨激楼滚滚毅然袭必然然然毅然翻ACGGGGGGAGCTGGCTGGCT CGAGCAGGCG GCGGAGAAT

15、T AGCCGTTT立CGTTTGGAAC5 叮俨ON-h.hh的HZ中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第7部分:玉米MIR604品系SN/T 3767.7-2014 * 中国标i住出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029)北京市西城区三里河北街16号(100045)总编室:(010)68533533网址中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷头印张0.75字数12千字2014年11月第一次印刷开本880X12301/16 2014年11月第一版印数1-1300 定价16.00元* 书号:155066 2-27434 SN/T 3767.7-2014