SN T 3767.2-2014 出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法 第2部分 筛选方法.pdf

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1、中华人民共和国出入境检验检疫行标准SN/3767.2-2014 出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第2部分:筛选方法Loop-mediated isothermal amplification detection method for genetically modified components in food for export-Part 2: Screening method 2014-01-13发布2014-08-0 1实施品咕3轨至-飞J飞台凡矿歪8飞向站、lwwcnlw315cc相E也话4回。982315中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3

2、767.2-2014 目可昌SN/T 3767(出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法共分为30部分:第1部分:通用要求和定义;第2部分:筛选方法;第3部分:玉米Bt-11品系;第4部分:玉米Bt176品系;第5部分:玉米GA21品系;第6部分:玉米MIR162品系;第7部分:玉米MIR604品系;第8部分:玉米MON810品系;第9部分:玉米MON863品系;第10部分:玉米MON88017品系;第11部分:玉米MON89034品系;第12部分:玉米T-25品系;第13部分:玉米3272品系;第14部分:玉米59122品系;第15部分:大豆A2704-12品系;第16部分:大

3、豆A5547-127品系;第17部分:大豆DP356043品系;第18部分:大豆GTS40-3-2品系;第19部分:大豆MON89788品系;第20部分:水稻Bt-63品系;第21部分:水稻KF6品系;第22部分:水稻KF8品系;第23部分:水稻KMD品系;第24部分:水稻iLLRICE62品系;第25部分:水稻M12品系;第26部分:水稻T1C-19品系;第27部分:水稻T2A-1品系;第28部分:小麦B73-6-1品系;第29部分:甜菜H7-1品系;第30部分:油菜RT-73品系。本部分为SN/T3767的第2部分。本部分按照GB/Tl.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可

4、能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位:中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验险疫SN/T 3767.2-2014 局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、中华人民共和国汕头出入境检验

5、检疫局、广州迪澳生物科技有限公司。本部分主要起草人:冯家望、王小玉、广亵凤侠、徐君怡、陈双雅、张舒亚、邵碧英、蔡颖、程阳、常彦磊。H 范围出口食品中转基因成分环介导等温扩增CLAMP)检测方法第2部分:筛选方法SN/T 3767.2-2014 SN/T 3767的本部分规定了植物源性食品中转基因成分的环介导等温扩增CLAMP)筛选检测方法。本部分适用于进出口水稻、玉米、大豆、马铃薯及小麦其加工产品的定性检测。本方法的定性检测低限为0.5%C质量分数)。2 规茹性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包

6、括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 19495.2 转基因产品检测实验室技术要求GB/T 19495.3 转基因产品检测核酸提取纯化方法GB/T 19495.7 转基因产品检测抽样和制样方法SN/T 1204 植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法3 缩略语下列缩略语适用于本文件。PLD: phospholipase D gene，磷脂酶D基因ZEIN:玉米醇溶蛋白基因Lectin:植物凝集素基因ST-LS1 :马铃薯光诱导组织特异性基因GAG56D:小麦属自享溶蛋白基因CaMV35S: 35S promoter from c

7、auliflower mosaic virus，来源于花椰菜花叶病毒的35S启动子NOS: terminator of nopalin巳synthasegene , B因脂碱合成酶基因终止子FMV35S:35S promoter from a modified figwort mosaic virusCcaulimovirus group)，来源于玄参花叶病毒35S启动子NPT rr : neomycir叶，-phosphotransf巳rasegene，新霉素3-，磷酸转移酶基因BAR: phosphinothricin acetyltransferas巳g巳nefrom Bacillusm

8、yloliquefaciens，来源于杆菌Ba-cillusmylolique faciens草丁腾乙酷转移酶基因PA T: phosphinothricin acetyltransferase gene，草丁瞬乙酷转移酶基因GOX:glyphosat巳oxidoreductasegene，草甘腾氧化还原酶基因LAMP: loop-mediat巳disothermal amplificatio口，环介导等温扩增1 SN/T 3767.2一2014Triton X-100:聚乙二醇辛基苯基酷dNTP: deoxyribonucleosid巳triphosphate，脱氧核音三磷酸4 防污染措施环

9、介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合GB/T19495.2的规定。5 抽样与制样6 核酸提取纯化7 LAMP检测方法7.1 原理7.1.1 一般原理环DNA混合物;从dNTP成乳白色沉淀，加入显色液酶的抑制剂。在设置合适产品。7. 1. 2 显色液显色原理引物各一对或者添加一条或一对结合，产生副产物(焦磷酸镜)形应?昆合体系中不应存在DNA聚合果可清楚判断样品是否为转基因SYBR Green 1是一种高灵唱理:那楼就染料，在地膨反方式结合到双链DNA的小沟内。当它与双链DNA结合时，荧光信号是游离可夫怒的8001王。在不发生扩增反应时，SYBR染料分子的荧光信号不发生改变，颜色显现为橙色;当

10、发生扩增反应时，随着双链DNA的增加，SYBR染料的荧光信号也随之大幅度增强，其信号强度可代表双链DNA分子的数量，同时颜色由橙色变为绿色。7.2 仪器和设备7.2.1 超纯水发生器。7.2.2 水浴锅或加热模板:63.0oC:!:0.5 oC和80.00C士0.5oC。7.2.3 离心管:0.1mL、1.5mL。7.2.4 移液器:量程0.5L10L;量程10L100L;量程100Ll000L。7.2.5 计时器。7.3 试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。2 7.3.1 实验用水:应符合GB/T6682中一级水的规格。7.3.2 dNTPs溶液:每种核昔酸浓度10mmol

11、/L。SN/T 3767.2-2014 7.3.3 Bst DNA聚合酶(如:NEB公司或具有问等效果的DNA聚合酶):酶浓度8U/f-lL。7.3.4 10 ThermolPol缓冲液:含200mmol/L Tris-HCl C pH值为8.8)、100mmol/L硫酸镜、100 mmol/L氧化钢、20mmol/L硫酸镜、1%Triton X-100。7.3.5 硫酸镜溶液:50mmol/L。7.3.6 甜菜碱:5mol/L。7.3.7 显色液:SYBR Green 1荧光染料，1000。7.3.8 引物:食品中转基因成分环介导等温扩增CLAMP)检测方法所用引物见表1。检测基因PLD Z

12、EIN Lectin ST-LSl GAG56D CaMV35S F3: B3: FIP , BIP: TTGCAGGAGGTGCTCTCCGGAT AACATCT ACTGTGCCAA FLP:TCTCCAAGTGGTGATGTCT BLP: ACAT ATT AATCAAGATGCCAAG F3 : CACCGTTCA丁丁CAGCCATB3: GCTGAT AT AGTGGCAGCAG FIP: CGCA TCACTTGGCAA TCGCCTGTGTCACTGGTGTCA TC BIP:TGCTGCCAACAACTAGCACAGATGGTATGGATGGCTGC F3 : CTCCTCGG

13、A TTCCA TTGC B3: GTCTTGCGAAGGAT AGTGG FIP: GGCAGAGGCATCTTCAACGAGGAAGGTGGCTCCT ACAA BlP: CACGAGGAGCATCGTGGAAACGTCAGTGGAGAT ATCACATC FLP: TTTCCTTT A TCGCAA TGA TGGC BLP: AGAAGACGTTCCAACCACG 备注水稻内源基因玉米内源基因大豆内源基因马铃薯内源基因小麦属内源基因筛选检测转基因大豆、玉米、水稻、马铃薯3 SN/T 3767.2一2014表1(续)检测基因引物序列(5一3)备7玉F3 , CTCGTTCAAACATTT

14、GGCA 133 , GCGCT AT ATTTTGTT丁TCTATCG筛选检测转基因lOS 大豆、玉米、水稻、FIP , ACATGCTT AACGTAATTCAACAGAAGATTGAATCCTGTTGCCG BIP: TGCATGACGTTATTTATGAGATGGCGTl气:n八AATGTATAATTGCGGGA马铃薯和小麦F3: AGCAGCA TTCCAGATTGG 筛选检测转基因133: CATGTGCTGGAACAGT AGTT 大豆、玉米、番茄、FMV35S FIP , AACCTTTGAGGATGGGAGTTCCAATCAACAAGGT ACGAGCC BIP: AAAGC

15、CTCAACAAGGTCAGGGTTCTTCATTGA TCTCCTGT AGC 马铃薯F3 , CTCGACGTTGTCACTGAAG 133 , TGATGCTCTTCGTCCAGA FIP: TAGCCGGATCAAGCGTATGCTCATCTCACCTTGCTCCT 筛选检测转基因lPTII 玉米、马铃薯BIP: CCATTCGACCACCAAGCGACATCCTGATCGACAAGACC FLP ,TTGCATCAGCCATGATGGATA 13LP: CGTACTCGGATGGAAGCC F3: CGACCACGCTCTTGAAGC 133 , ACCTCGTCCGTCTGCG 1

16、3AR FIP , TGTACGTCTCCCCCCGCCATTTTTGTGCCTCCAGGGACTTC 筛选检测转基因玉米和小麦BIP: AGGCGTTGCGTGCCTTCCTTTT ATCCCTGGCTCGTCGC FLP: ACTGGGCTCCACGCTCT F3 ,CGTTAACCA TTACA TTG AG ACG 133: CGCCTCCATAGACTT AAGC FIP: CAGCGT AAGCAAT ACCAGCCAGAGAGGTTGCAAGATAGAT ACC PAT 筛选检测转基因BIP:CCTGGAAGGCTAGGAACGCTTGATGCCTATGTGACACG 大豆、玉米

17、FLP , AACCTCAGCAACCAACCAA BLP , ACGATTGGACAGTTGAGAGT AC F3 ,CT AACTGG AAGGGTGCTCAC 133: GGAGCACCAGTCATACCGA FIP: CGG AAACCCA TCCACTTGG AGTTCT ACACTCGCGCTCGT A GOX 筛选检测转基因BIP , ATCCCGGATTCCCTTCCAGTGACCGTGACCGAAAGCGTAG 玉米FLP: GCGAGAGCTGGAAGCAACT BLP , TTGGTCGTGCT ACCCGT AC 7.4 检测步骤7.4 .1 阴性对照、阳性对照和空白对

18、照的设置7.4.1. 1 阴性对照:采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板。7.4. 1. 2 阳性对照:采用含有待测基因序列的植物DNA作为模板或含有目的基因序列的质粒DNA代替DNA模板。7.4.1.3 设两个空白对照:4 SN/T 3767.2一2014提取DNA时设置的提取空白对照(以水代替样品); LAMP反应的空白对照(以DNA府解液代替DNA模板)。7.4.2 LAMP反应体系LAMP反应体系见表2。每个样品各做2个平行管。加样时应使样品DNA容液完全加入反应液中，不要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后，将1L显色液滴在管盖内侧，盖管盖时应小心，防止显色液?昆合进入反应被

19、中。表2LAMP反应体系组分工作液浓度力样量/JLL反应体系终浓度ThermoPol缓冲液10 2.5 外侧上游引物CF3)10mol/L 0.5 0.2mol/L 外侧下游寻l物CB3)10mol/L 0.5 0.2mol/L 内侧上游引物CFIP)40mol/L 1. 0 1. 6 Vmo1/L 内侧下游引物CBIP)40mol/L 1. 0 1.6mol/L 环上游引物CFLP)20mol/L 1. 0 0.8 Jlmol/L 环下游引物CBLP)20mol/L 1. 0 0.8 Vmo1/L dNTPs 10 mmol/L 4 1. 6 mmol/L 甜菜碱5 mol/L D 1 mm

20、ol/L 硫酸侯150 mmol/L l 6 mmol/L Bst DlA聚合酶8 U/L l 0.32 U/L DNA模板100 ng/L 2 8 ng/Jo 7. 补足至25.07.4.3 LAMP反应参数63.0 C士0.5c恒阻扩增90min , 80.0 C士0.5C 5 min使酶灭活，反应结束。7.4.4 显色反应反应结束后，将显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀，立即在黑色背景下进行颜色观察。7.5 质量控制7.5.1 基本原则:实验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合以下情况。否则，任一种对照如果出现非下述正常结果，应重做实验。7.5.2 空白对照:反应管中液体呈橙色。7.5.

21、3 阴性对照:反应管中液体呈橙色。7.5.4 阳性对照:反应管中液体呈绿色。8 结果判断和确证8.1 待检样品2个平行样反应管1=1:1液体均呈橙色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品xx基SN/T 3767.2一-2014因阴性。8.2 待检样品2个平行样反应管中液体至少1管呈绿色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品xx基因初筛阳性，还应通过下列方法之一进行确证(见附录A): 一一按照SN/T1204进行实时荧光PCR检测;一一可对外引物PCR扩增产物进行序列测定。9 结果表述9.1 检测结果为阴性，可表述为该样品未检出xx基因。9.2 检测结果为xx基因初6 判断和表述。SN/T

22、3767.2-2014 附录A(资料性附录)基因目标序列A.1 PLDC445bp，来自Accessionno. ABOO 1920. 1) 2487GTTGTTCTTGATCTAACACGTGAGCTCATGTCAACAGTTTGTGGAGGGGATTGAGGACAC A.2 ZEINC392bp，来自1220CTACTCCACCCCCATCCACATTTGGGACAAAGAAACCGGTAGCGTTGCCAGCTTCGCCGC 1280 TTCCTTCAACTTCACCTTCTATGCCCC A.4 ST-LS1 C354bp，来自Accessionno. X04753.1) 3017CC

23、AAGTGGTGATGTCTATGTTGGAGGTATGACAATTTACTCGAACTTCCTTTTTTAACTC 3077GAACTATGTATATACACAACAACGTTAATAATTAAGTCGTACTCATTTTGAATCTACTGA 3137CTCTAGATCCTGATTCACACATGTAATATAATTGCAGGTACTACTGGCTTAGCCATATGG 3197 GCCGTGACCTTGGTTGGTATTCTTGCAGGAGGTGCTCTCCTTGTCTACAA CACAAGTGCT 3257TTGGCACAGTAGATGTTATCCTGTGTTGTACTATTTTAAG

24、TTGTATTCGAGCTCGCATCA 3317TGTAATCTTTTCAAAAATACTTCAAAATATTTCTTGGCATCTTGATTAATATGT 7 SN/T 3767.2-2014 A.5 GAG56DC270bp，来自Accessioo00. JX679682.1) 468 CAC CGTTCATTCA 481 GCCATCTCTA CAACAACAGG TGAACCCATG CAAGAATTTC CTCTTGCAGC AATGCAAACC 541 TGTGTCACTG GTGTCATCCC TCTGGTCAAT GATCTGGCCA CAAAGCGATT GCCAAGTGA

25、T 601 GCGGCAACAA TGCTGCCAAC AACTAGCACA GATTCCTCAG CAGCTCCAGTGTGCAGCCAT 661 CCATACCGTC ATACATTCCA TCATCATGCA GCAAGAACAA CAACAAGGCA TGCATATCCT 721 GCTGCCACTA TATCAGC A.6 CaMV35SC269bp，来自Accessioo00. GU734659.1) 644 CTCCTCG GATTCCATTG CCCAGCTATC TGTCACTTTA TTGTGAAGAT AGTGGAAAAG GAA 704GGTGGCTCCTACAAATG

26、CCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCT 764 GCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAA AAAGAAGAC 824GTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGAT 884 GACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGA A.7 NOSC204bp，来自Accessioo00. AM295157. 1) 3388 TCTCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCT

27、GTTGC CGGTCTTGCG 3448ATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGC 3508ATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATATACATTTAATAC 3568 GCGATAGAAAACAAAATATAGCGC A.8 FMV35SC230bp，来自Accessioo00. HM047294.1) 13435 AGCAGCATTCCAGATTGGGTTCAATCAACAAGGTACGAGCCATATCACTTTATTCAAATT 13495 GGTATCG

28、CCAAAACCAAGAAGGAACTCCCATCCTCAAAGGTTTGTAAGGAAGAATTCTCA 13555GTCCAAAGCCTCAACAAGGTCAGGGTACAGAGTCTCCAAACCATTAGCCAAAAGCTACAG 13615 GAGATCAATGAAGAATCTTCAATCAAAGTAAACTACTGTTCCAGCACATG A.9 NPT IIC248bp，来自Accessioo00. HE582394.1) 630 CTCGACGTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAG 690GATCTCCTGTCA

29、TCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATG 750CGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGC 810ATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAA 870 GAGCATCA A.10 BARC225bp，来自Accessioo00. HMO 14235. 1 ) 3443CGACCACGCTCTTGAAGCCCTGTGCCTCCAGGGACTTCAGCAGGTGGGTGTAGAGCGTGG

30、8 SN/T 3767.2-2014 3503 AGCCCAGTCCCGTCCGCTGGTGGCGGGGGGAGACGTACACGGTCGACTCGGCCGTCCAGT 3563 CGTAGGCGTTGCGTGCCTTCCAGGGGCCCGCGTAGGCGATGCCGGCGACCTCGCCGTCCA 3623 CCTCGGCGACGAGCCAGGGATAGCGCTCCCGCAGACGGACGAGGT A.11 PATC227bp，来自Accessioo00. DQ156557. 1 ) 3832 CGTTAACCATTACATTGAGACGTCTACAGTGAACTTTAGGACAGAGCCA

31、CAAACACCACA 3892 AGAGTGGATTGATGATCTAGAGAGGTTGCAAGATAGATACCCTTGGTTGGTTGCTGAGGT 3952 TGAGGGTGTTGTGGCTGGTATTGCTTACGCTGGGCCCTGGAAGGCTAGGAACGCTTACGA 1012 TTGGACAGTTGAGAGTACTGTTTACGTGTCACATAGGCATCAAAGGTTGGGCCTAGGATC 4072 CACATTGTACACACATTTGCTTAAGTCTATGGAGGCG A.12 GOXC208bp，来自Accessioo00. GU479462.1) 968 C

32、TAACTGGAAACGTGCGCATGTGCTCTATACGCACGCTCGAAAACTTCTTCCAGCCCTCG 1028 CGCCTGCGAGTTCTGAAGAACGATATTCCAAATGGATGGGGTTCCGGCCGAGCATCCCGG 1088 ATTCGCTCCCCGTGATTGGCCGGGCAACCCGGACACCCGACGTAATCTATGCTTTCGGCC 1148 ATGGTC八:rCTCGGCATGACAGGGGCGCC9 寸户ON-N.hkh的HZ中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口食品中转基因成分环介导等温扩增CLAMP)检测方法第2部分:筛选方法SN/T 3767.2-2014 * 中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029) 北京市西城区主里河北街16号(100045)总编室:(010)68533533网址中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷.x 开本880X12301/16 印张1字数18千字2014年11月第一版2014年11月第一次印刷印数1-1300 定价18.00元只书号:155066 2-27429 SN/丁3767.2-2014