SN T 3767.1-2014 出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法 第1部分 通用要求和定义.pdf

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1、、华人民共和压入境检瞌检疫行业标准SN/3767.1-2014 食品中转基因成分环介等温扩增CLAMP)检测方?第1部分;通周要求和定义Loop-mediated isothermal amplification detection method for geneticaHy 酬。difiedco血ponentsin food for export-Part 1 : General require耻entsand definitions 2014-0卜13发布2014-08-01实施命飞;1jJ码至I.J;.;,:_-VO. 、，.，坏)晴、1.，协同;Wcrl而言m电峰1000;)8315中

2、华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局SN/T 3767.1-2014 目。疫科民检疫人I验检华检验中任境检h盼责人国阔叶怕出中创如何报局射士些盯疫检共这盹检境刮才验入法却叫出检出协副且境津泪承J入天地不哗出国P句，叶. 每阳山圳且就业只U布疫咽民出hMOAQ监自HIA尸呻肌口剧知他干刮件归金民中割草文并如人口肌导起本出入华度介则。提出片检环规利会东局验分的专口F广疫检1品品瓦口茅口叮叮严.，.，。Fi旨牙和验入TZLMZrtL吼叫叮叮肌协主ZL在飞时也击叫中定口口品品241688品口口I08I品品IC品凹-4品口的容且人入辽制相配山ZU肌mmmm川mut-mm旦旦旦旦川川剧川件阳明口要方B

3、KGMMMM米米米户户户户豆豆豆豆豆稻稻稻稻稻稻稻稻麦菜菜T门年UUUL上共咄叫做抹抹MMMMM玉玉玉玉大大大大大水水水水水水水水小船袖WG件家制咽周mA川A川A川八如A川A川A川八仙A川喃喃时时时时喃喃时附时时时啪啪啪啪时附时喻户川棚材制畔时样T部部部部部部部部部012345678901234567890分分意分分人V123456789111111111122222222223部部注部部问院日第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第本本请本本刊究J研局学SN/T 3767.1-2014 共和国黑龙江出入境检验检疫局、中华人民共和同福建山入境检验检疫局、中华人民共和罔厦门:

4、1入境检验检疫局、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、中华人民共和国汕头出入境检验检疫局、仲皑农业工程学院、广州|迪澳生物科技有限公司。本部分主要起草人:李志勇、刘津、高东微、谢力、曾静、李晓虹、冯家望、陈颖、1曹际娟、郑文杰、奕凤侠、邵碧英、陈双雅、罗雁非、凌莉、蔡颖、易敏英、刘静宇、高苏娟、石高。H SN/T 3767.1-2014 出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第1部分:通用要求和定义1 范围SN/T 3767的本部分规定了食的范围、规范性引用文件、缩略语、器设备、检测步骤、结果判定和结果2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是件。凡是不注日期的引用文件，其G

5、B/T 6682 分析实验室用水GB/T 19495.1 GB/T 19495.2 GB/T 19495.3 转基因产品GB/T 19495.7 转基因产品3 术语和定义、缩略语3.1 术语和定义下列术语和定义适用于本文3. 1. 1 转基因transgene 温扩增CLAMP)初筛检测方法、核酸提取纯化、原理、试剂、仪CLAMP)检测。，仅注日期的版本适用于本文文件。将本物种不具有的、来源于其他物种的功能DNA序列，通过各种导人手段，使其在该物种中进行表达，以便使该物种获得新的品种特征。3.1.2 转基因植物品系genetically modified plant event 目的基因成功导

6、人植物基因组并能在后代中稳定遗传即获得转基因植物品系，同一基因的不同转化体视为不同的品系。品系特异性序列指外源插入片段与植物基因组的连接区序列，是转基因植物品系的鉴定依据。3. 1. 3 结构特异性检测construct specific detection 外游、插入片段中两个元件的连接区的DNA序列存在差异。结构特异性检测是以外源插入片段中两个元件的连接区域为检测对象。SN/T 3767.1-2014 3.1.4 品系特异性检测event specific detection 外游、插入片段与植物基因组的连接区序列存在差异。品系特异性检测是以外师、基因与植物基因组相连接区域为检测对象。3.

7、1.5 环介导等温扩增loop-mediated isothermal amplification 在BstDNA聚合酶作用下，以DNA为模板，以特异性引物为延伸起点，在60C 65 C恒温条件下通过链置换反应进行的DNA扩增方法，扩增产物是一系列复杂的大小不等的DNA混合物。是一种区别于PCR等变温扩增反应的新型等温核酸扩增方法。3.2 缩略i吾下列缩略i吾适用于本文件。LAMP Cl oop-mediated isothermal amplification) :环介导等温扩增Triton X-100:聚乙二醇辛基苯基酷dNTPC deoxyribonucleoside triphosph

8、ate) :脱氧核昔三磷酸4 防污染措施按照GB/T19495.2的规定执行。5 抽样和制样按照GB/T19495.7的规定执行。6 核酸提取纯化按照GB/T19495.3的规定执行。可以采用商品化的植物基因组DNA提取纯化试剂盒，所提取的DNA质量应符合GB/T19495.3的规定。7 原理7.1 一般原理根据检测样品目标核酸序列设计特异性内引物和外引物各一对或者添加一条或一对环引物，特异性识别序列上的六个独立区域，在反应缓冲液中脱氧核糖核酸兰磷酸、寡核昔酸引物在Bst聚合酶的作用下启动循环链置换反应，在特异目标序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎一环D

9、NA混合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2斗结合，产生副产物(焦磷酸镇)形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。在反应?昆合体系中不应存在DNA聚合酶的抑制剂。在设置合适对照和在检测下限的情况下，定性检测结果要清楚判断样品是否为转基因产品。7.2 显色液显色原理LAMP检测通常使用SYBRGreen I或钙黄绿素两种显色液，其显色原理分别如下:a) SYBR Gree口1:一种高灵敏的DNA荧光染料，可以嵌入方式结合到双链DNA的小沟内。2 SN/T 3767.1-2014 当它与双链DNA结合时，荧光信号是游离状态的800 1 000倍。在不发生扩增反应时

10、，SYBR染料分子的荧光信号不发生改变，颜色显现为橙色;当发生扩增反应时，随着双链DNA的增加，SYBR染料的荧光信号也随之大幅度增强，其信号强度可代表双链DNA分子的数量，同时颜色由橙色变为绿色。b) 钙黄绿素:在LAMP反应体系中加入预先泪合的钙黄绿素和锚离子，未发生反应时锚离子与钙黄绿素结合，钙黄绿素的荧光被洋灭，呈现橙色。当扩增反应发生时，扩增过程中产生的焦磷酸根离子可与锚离子结合，形成不可逆的沉淀物，将锚离子从钙黄绿素上释放下来，从而使钙黄绿素恢复荧光，同时体系中的模离子与钙黄绿素结合，进一步加强钙黄绿素的荧光，可在365口m紫外光激发下散发出约510nm的荧光，颜色也由橙色转为绿色

11、。8 试剂8.1 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。8.2 将LAMP反应液分装成小包装，每次取一个小包装进行反应，其余的小包装保存在一20oc。8.3 丰莫斗反DNA/对照。8.4 水:应符合GB/T6682中一级水的规格。8.5 dNTPs 1容液。8.6 Bst DNA聚合酶:如美国NEB公司或具有同等效果的DNA聚合酶。8.7 10 X Th巳rmolPol缓冲液:含200mmol/L Tris-HCl (pH值为8.8)、100mmol/L硫酸镜、100 mmol/L氯化押、20mmol/L硫酸镜、1% Triton X-100。8.8 硫酸镇溶液。8.9 甜菜碱。8.10

12、 显色液:SYBRGr巳en1或者钙黄绿素。8.11 引物:包括外引物1，外引物2，内引物1和内引物2，必要时包括环引物1或(和)环引物2。9 仪器设备9.1 水浴锅或加热模板:63.0 oc士0.5oc和80.0oC :!:0.5 oC。9.2 离心管:0.1mL、1.5mL。9.3 移液器:量程0.5L10L;量程10L100L;量程100L1000L。9.4 计时器。10 检测步骤10.1 一般性要求检测样品中DNA的提取和含量测定应按照GB/T19495.3中的规定执行。对样品进行DNA提取时要保证DNA的质量和浓度的稳定，以保证LAMP反应的可重复性。检测样品DNA进行LAMP检测时

13、应做平行实验。10.2 LAMP扩增反应的一般要求LAMP反应体系包括dNTPs、甜菜碱、缓冲液、Mg2+、引物、BstDNA聚合酶、模板和水。其中，Mg2+浓度、甜菜碱浓度、dNTPs浓度以及反应温度要针对每个引物和体系进行优化。Mg2+浓度一般为4mmol/L 10 mmol/L，甜菜碱浓度为O.6 mol/L 1. 2 mol/L , dNTPs浓度为1.2mmol/L 3 SN/T 3767.1-2014 1. 8 mmol/L，反应植度为60.0C 67.0 C。10.3 LAMP反应设计10.3.1 一般要求LAMP反应的特异性取决于目的片段的保守性和引物的设计，筛选出合适的目标序

14、列和引物，优化实验条件以使反应具有良好的重复性以及抗外界干扰能力。10.3.2 扩增片段的大小LAMP扩增是链置换合成反应，目标序列的长度直接影响LAMP的扩增效率，目的片段应在300 bp以内，一般在180bp200 rbp最佳王10.3.3 引物10.3.3.1 一般要求在附录A中给出引物完整的序列信息10.3.3.2 引物设计/ J ) hu 于5f端的Bl、B2，B3区6个不同1，具体包括以下部分:列F2)和位于5端的F1c1:8: (目LAMP寻|物设计是基于目标:序列3端的的位点设计的一对内引物(FIP和BIP)和一对奸、引物(F3和B白，a) ) CUEfILB3 Primer

15、F3 F3c F2c FLP F1c 3 5 F3 F2 FLPc Fl B1 BLPc B2 B3 5 3 B1c BLP B2c B3c BLP B3 B3 Primeri B2 B1c Q! 图1LAMP法引物的设计 SN/T 3767.1-2014 10.3.3.3 引物设计的原则引物设计应遵循以下原则:a) F2区段的5端到B2区段的5端之间的距离宜是120bp 180 bp: F3区段的3端到F2区段的5端之间的距离是宜obp20 bp(同理由和B3之间的距离宜是obp20 bp);F2区段的5端到F1区段的5端(形成环的部分)之间的距离宜是40bp60 bp; b) 对于GC含量

16、正常或是GC含量富集的引物Tm值为60oC65 oC，而对于AT富集的引物Tm直为55oC60 oC; c) F2、B2、F3、四、FLP、BLP的3末端以及F1c和Blc的5末端6bp的自由能改变值三三4 kCal/mol; d) 引物GC含量在40%6e) 引物自身、引物间没有结f) g) h) 10.3.3.4 引物的验证引物的验证如下:a) b) Blast等序列同源性比对，评d) 在引物特异性的实验评价列及阴性对照。10.3.3.5 对照LAMP反应需设立至少包合GB/T19495.1规定。10.4 LAMP检测方法的类型对食品中转基因成分的定性检测包括:a) 物种特异性检测方法;b

17、) 筛选检测方法;c) 结构特异性检测方法;d) 品系特异性检测方法;: EMBL, GenBank)里进行FastA或同源序列;目标序列和相近生物的基因序白试剂对照，对照的设置应符析要求采取不同的LAMP实验。e) 常见商品化转基因作物品系外源基因的主要信息参见附录A。10.5 LAMP检测阳性结果的确证本系列标准给出了各种LAMP检测方法。对LAMP检测结果为阳性的样品，应进行进一步确证实验。可根据需要选择下列方法之一:a) 实时荧光PCR检测;b) 对PCR扩增产物进行序列测定;5 SN/T 3767.1-2014 c) Southern杂交;d) 其他确证方法。11 结果判定11.1

18、检测样品DNA的两个平行检测结果保持一致的情况下可进行结果判定和表述。如果其中一个平行的检测目标片段出现扩增而另一个目标片段未出现扩增时，应重新进行检测。可通过增加反应中DNA的模板量，使两个平行检测结果一致。重新检测的结果如果仍然不一致，则按照目标片段出现扩增进行结果判断和表述。11.2 所检测目标片段未出现扩增，所有对照结果正常，结果判定为阴性;所检测目标片段出现扩增，应按照确证实验情况进行结果判断和表述。12 结果表述12.1 一般要求实验结果不能用十/-来表述。阴性结果不能用不含GMO(GMOnot pr巳se口t)来表述。12.2 阴性结果的表述检测报告应该包括下列内容该样品未检出转

19、基因xx x (物种)XX X品系。12.3 阳性结果的表述检测报告应该包括下列内容检测结果为转基因xx x (物种)x x x品系初筛阳性，应按照确证实验情况进行结果判断和表述。6 附录(资料性附录)常见转基因作物晶系相关资料A Z4吐白斗-4lINO-hA常见转基因作物品系外源基因的主要信息作物转入的外源基因序号名称品系名称研发单位特性启动子目标基因终止子小麦B73-6-1 华巾科技大学PQ ubiquitin bar uidA nos Monsanto FMV 35S cp4 epsps E93 ? ;而菜RT73CGT73) HT Company FMV 35S goxv247 E93

20、 3 油菜T45CHCN28) Bayer H丁CaMV 35S pat CaMV;j5S MS TA29 barnase nos 油菜Ms8 Bayer HT Ssu八rabar TDN八gene7 RF TA29 barstar nos 口户油菜Rf3 Bayer HT SsuAra bar T-DNA gene 7 人nti-sensetype of 番茄华番卢号华巾农业大学CaMV 35S 1- Aminocyclopropane-1-Carboxylate 6 nos C ACC) Synthase ACC合酶反义序列水稻华中农业大学7 TT51-1 IR actin 1 cry1A

21、b/cryJAc os 与国际水稻所水稻中科院遗传所Ubiquitin和IActin 8 KF6 IR cry lAc/ sck nos 与福建农科院水稻中科院遗传所9 KF8 IR Ubiquitin和ActincrylAc/ sck nos 与福建农科院;Jq(j 渥太华大学与10 KMD IR Ubquitin CrylAb nos 浙江大学核农所表A.l气】Z叫gydE|NO王表A.l(续)co 转入的外源基因特性研发单位品系名称作物名称序号终止子目标基因启动子nos Cry2A Ubquitin IR 华中农业大学T2A-1 水稻11 nos Cry1C Ubquitin IR 华中

22、农业大学T1C-19 水稻12 Xa21基因3端下游序列Xa 21 Xa21基因5端上游序列抗病中国农科院与安徽农科院M-12 水稻13 T-35S CaMV 35S poly( A) native soybean acetolactate synthase terminator 内源大豆乙航乳酸合酶终止子3 untranslated regio日ofthe KTi3 gene KTi3基因3非翻译区Solanum tuberosum Bayer Bayer A5547-127 DP一305423LLRice62 水稻大豆大豆14 15 16 proteinas巳inhibitorII (PI

23、N Il ) 马铃薯蛋白酶抑制剂HPioncer Hi Bred native soybean acetolactate synthase terminatol 内源大豆乙酌乳酸合酶终止子S-aclenosy1L-methionine synthetase(SAMS) S-)括:背甲硫氨酸合成购International Inc. DP356043 大豆17 gm-hra HT A. tumefaciens nopaline synthase( nos) 3 -untranslated reglOn 农杆菌nos3非翻译区cp4 epsps enhanced CaMV 35S chloropl

24、ast transit pepticle from Petunia hybricla 来自矮牵牛的增强型CaMV35S 叶绿体转运!汰HT Monsanto Company GTS 40-3-2 大豆18 表A.l(续)转入的外源基因启动子目标基闲终止子Iisum sativum T-E9 DNA containing 3UTR of Rubisco small subunit E9 特性研发单位品系名称作物名利序号Monsanto gene 豌豆T-E9DNA，含有核酣糖二磷酸缩化酶CRubiscol小5JI基因基因3非翻译区3 region of soybean sphas1 gene ,

25、 inclucling 35 nuclcoticles of carboxy1 terminus of bcta-conglycinin coding region 大豆sphas1基因3区)!.x.包If编jjfb伴大.RJ求蛋白竣基末端的35个核千个西安cp4 cpsps P-FMV/TSFl HT Company Monsanto Company MON89788 MON87701 大豆大豆19 20 csr1一2拟南芥乳酸合成附大亚某reglOns 内源基因5f和3三II翻译|圣HT BASF Inc. BPS-CV127-9 大豆21 Z叫吨。u77iMOBayer CropScie

26、nce (八ventisCaMV 35S polyC Al pat L丁aMV35S HT CropScienc巳CAgrEvol l A2704-12 大豆22 CaMV 35S 日Tnos IR 口ospat crylAb (丁aMV35S Syngenta Seccls , I口c.Bt-11 玉米23 之D主运吨。二iNOZ表A.l(续)序作物转入的外源基因5J 主名称品系名称研发单位特性启动子吕标基因终止子IR CaMV 35S cry1Ab CaMV 35S polyCA) Bt176 24 玉米CSYN-EV176-9. Syngenta Seeds , SM CaMV 35S

27、bar CaMV 35S polyCA) Inc. 176) SM bacterial promoter bla Zea mays ubiquitin gene IR promoter cry34Ab1 PIN II DOW AgroSciences 玉米泛素基因启动子LLC and Pioneer 25 玉米DAS-59122-7 Hi-Bred Triticum aestivum peroxidase International IR gene root-preferred promoter cry35Ab1 PIN II Inc. 小麦过氧化物酶根特异性启动子SM CaMV 35S pa

28、t CaMV 35S HT CaMV 35S bar Tr7 CaMV35S, Oct double IR Cry1Ac Potato pin II 26 玉米DBT418 Dekalb Genetics enhancers , adhI and VI IR CaMV35S pin II Potato pin II ,Tr7 SM bacterial promoter bla PQ GZein promoter amy797E CaMV 35S 27 玉米Event 3272 Syngenta Seeds , Inc. ZmUbilnt SM pml nos 玉米泛素基因内含子() ZU可my

29、-lNOT俨表A.l(续)序作物转入的外源基因品系名称研发单位特性乒J 名1奇启动子目标基因终止于HT als gm-hra PIN 11 Pioneer Hi-Bred 28 玉米Event 98140 ZmUbilnt lnternational Inc. HT gat1621 PIN 11 玉米泛素基因内含子Syngenta Seeds , rice actin 1 29 玉米GA21 HT epsps nos Inc. 水稻actin1 ZmUbilnt IR vip3Aa20 (丁aMV35S poly(八)玉米MIR162 Syngenta Seeds , 玉米泛素基因内含子30

30、Inc. ZmUbilnt SM pml 口os玉米泛素基因内含子promoter derived from the metallo-thioneinlike IR gene from Zea mays mcry3八nos Syngenta Seeds , 31 玉米MIR604 来自玉米金属硫蛋白样Inc. 基因的启动子ZmUbilnl SM pml nos 玉米泛索基因内含子CaMV35S GOXv 2iJ7十CTP2 nos IR CaMV 35S cry1Ab 口os32 玉米MON80100 Monsanto HT CaMV 35S cpsps nos s4 bacterial pr

31、omotcr lPT11 细菌启动子Monsanto enhanced CaMV 35S 33 玉米M()N810 IR cry1Ab Company 增强型的CaMV35S -H Z叫uay-NOZ表A.l(续)H 转入的外源基因特性研发单位品系名称作物名称中序号终止子目标基因启动子tahsp17 cry3Bb1 4-AS1 IR Monsanto Company MON863 玉米34 nos nu fl、p a CaMV 35S SM cp4 epsps 1 巧，-i PA S h a t nos nce actl日IHT Monsanto Company MON88017 玉米35 w

32、heat heat shock protein 17.3 小麦热休克蛋白3非翻译区3 untranslated region of nos nos nos Co MON89034 NK603 玉米玉米36 37 CaMV 35S 3 polyadenylation signal from ORF25 来自ORF25的3poly(A)Mycogen; Pioneer mays) promoter 玉米泛素基因启动子TC1507 玉米38 nos bar CaMV 35S HT CaMV 35S poly(A) cry9c CaMV 35S IR Aventis bacterial promote

33、r 细菌启动子CropScience CBH-351 玉米39 bla SM 表A.l(续)转入的外源基囚特性7iJf发单位II古系名称作物名称午予17fi一终11:.子目标某囚tlijH (、aMV35S poly(八)plt (二lMV35S 日1、Bayer CropScicnce T-25 玉米40 ()( bacterial promoter SM I己93 cp4 -cpsps FMV35S HT Monsanlo -7l 甜菜41 Sl f们的w境风险评1it，1心(TheCentcr for En 注，:-T( Hcrbicicle Tolerance)抗除草JfIJ,PQ(P

34、lant Quality)农产品1171质，SM(Selectablc marker)选拜标记:F八(Fallyacicl composilion)脂肪阪构成:R CInscct resist 1n罚rit.lt(dZsc飞lrchFounclalion grh_crop_datahae号ance)抗虫性。注2.表A.1英文信息来内同际生命科学研究vironmcntal fisk Assessment , CEfA) Z时吐OY-lNO-k?b心立ONi.hh的H军中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第1部分:通用要求和定义SN/T 3767.1-2014 中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号(00029)北京市西城区主旦河北街16号(00045)总编室，(010)68533533牛、网址WWW.spc.日创.cn中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷x 印张1.25字数24千字2014年11月第一次印刷开才880X1230 1/16 2014年11月第一版印数1-1300 卫已定价21.002、书号1550662-27428 SN/T 3767.1-2014