SN T 3730.1-2013 食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法 第1部分 貂成分检测 实时荧光PCR法.pdf

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1、中华人入检瞌嘎单草SN/3730.1-2013 重至二、协噩骂:则锢料区分:翻夺中a肾品啕hgIdenti臼cationof domestic animal ingredient in food a日dfeed一Part 1 : Detection of martes i盟gred提前-Real-timePCR method 2013-11-06发布2014-06-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检痊总局别吕SN/T 3730(食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法共分为以下8今部分:1部分:结成分检测实时荧光PCI之法;一一第2部分:狗成分栓测实时荧光PCR法;一一第3部分:狐狸成分检

2、测实时荧光PCR法;4部分:驴成分检测实时荧光PCR法;一一第5部分:马成分检测实时荧光PCR法:8部分:浩成分检测实时荧光PCR法;一一第7部分:水牛成分检测实时荧光PCR法;一一第8部分:猪成分栓溺实时荧光PCR法。本部分为SN/T3730的第1部分。本部分按照GB/丁1.1-2009给出的规黯起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T 3730.1-2013 本部分起草单位:中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、宝生物工程大连)有黑公司。本部分主要起草人:郑秋月、李品泉、子灵、张浩、赵昕、徐君怡、吴亚君。工1 莞吕食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法

3、第1部分:程成分检测实时荧光PCR法SN/T 3730的本部分规定了食品及饲料中努成分鉴定的实时荧光PCR法。SN/T 3730.1-一2013本部分适用于食品及饲料中绍成分，包括水绍(Mustla仇so川、紫绍(Mteszibellin)、自本绍与如此M兰奇均收及极二战以将被泛采毅然必然接翻翻翻(Martes melampus)、黄喉招(Mrt2 规范性言i窍文件GB/T 6682 分析实验室用水GB/丁27403实验室贯量控制3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 毒丑Martes 食肉臼融科动物，属珍贵毛DNA片段。3.2 实时荧光PCRreal time 在PCR反应体系中加

4、入荧光3.3 Ct1直cyclethreshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。4 缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA:搅氧核糖核酸(deoxyribon uleic acid) d到TP:脱氧核音酸三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphate) CTAB:十六烧基三甲基漠化饺(cetyltrithylammoni um bromide) Tris:三(经甲基)氨基甲:境tris(hydroxymethyl) aminomethaneJ EDA:乙二按四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid) Ex Taq H

5、S:高效热启动DNA聚合酶OD:无密度值(opticaldensi ty) 结、日本籍、黄敬貌等特异性个PCR扩增过程。SN/3730.1-2013 5 方法提要提取样品DNA，以DNA为模板，分别采用组成分的特异性检那引物和探针进行实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR的增幅现象，进行食品和饲料中绍成分的鉴定。6 试i剂和材料除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。所有试剂均用元D时A酶污染的容器分装。6.1 检测用引物(对序列和探针:绍成分扩增引物和探针、内参照真核生物成分引物和探针详克表10表1试验用51物和探针名称序列(5人3)目的基嚣内参照

6、5端寻j物TCTGCCCTATCAACTTTCGA丁GGTA内参照3墙在物AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT 真核生物18SrRNA基因内参照探针FA扎在-CCGTTTCCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-Eclipse 箱5端引物TAGCRAAGAGACCTTAAG 结3端引物CTRYAAGTCTTYTCACTA 紫磊、民本箱、黄敬结16s rRNA基因程探针FAlAACCAGACGAGCTACCTATGAG-Eclipse 水结5端寻i物GCTTCAATCCTCTATTTCATAA 水箱3端引物GCTTCTTCCTTGAGTCTTA 水绍线粒体结黯色素忌基因

7、本结探针FAMCCTCCT AGTCTTCA TGCCAA TCGT-Eclipse 6.2 CTAB缓冲液:55mmol/L CTAB, l 400 mmol/L NaC1, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Tris，用10%盐酸漓pH至8.0，121OC，高压灭菌20min，备用。6.3 TE缓冲液CTris-Cl、EDTA缓冲滚):10mmol/LTris-HClCpH 8.0) ,1 mmol/L EDTACpH 8.0)。6.4 蛋白酶K:20mg/Lo 6.5 ns饱和盼。6.6 三氯甲:境。6.7 异戊辞。6.8 异丙善事。6.9 70%乙薛。6.10 Ex

8、 Taq HS聚合酵。6.11 Premix Ex Taq (2 X) :Ex Taq HS聚合酶终浓度。.1U/f-LL)、dNTPC终浓度0.6mmol/L)、Mg2+C终浓度6mmol/L)。7 仪器和设备7.1 实时荧光PCR仪。2 7.2 离心机:离斗转速二三12000 r/mino 7.3 微量移液器:10L、100L、200L、1000Lo 7.4 冰箱:2oC8 oC，一20oC 0 7.5 高压灭菌器。7.6 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。7.7 pH 计。7.8 天平:感童10mg o 7.9 恒温水浴锅。7.10 11品旋振荡仪。8 检测步黯8.1 DNA摄取SN/T

9、3730. 1-2013 8. 1. 1 称取300mg己制备好的样品于2mL离心管中，加入1.5mL CTAB缓冲液和10L蛋白酶K，振荡混匀，65oC 30 min，期间每隔10min振荡混匀。8. 1. 2 2 000 r/min离心5min，吸取上清液至一新离心管中，加400L三氯申统一异戊醇(24:1)，充分混匀。8. 1. 3 12 000 r/min离斗5min，吸取上清液至一新离JL;、管中，加入0.8倍体积异丙薛，室温下沉淀1仨2ho 8.1 .4 12 000 r/min离心10min，弃上清液;70%乙薛洗涤一次，晾干:加入50LTE缓冲液，溶解DNA沉淀，于一200C保

10、存备用。8.2 DNA浓度和纬度的测定取适量DNA洛液原液加双蒸水稀释一定倍数后，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光先度计测260 nm和280nm处的吸收值。DNA的浓度按黑式(1)计算。C 三二A260X N X 50 式中:c 一一-D时A浓度，单位为微克每毫升g/mL); A2由一一-260nm处的吸光值;N一一核酸稀释倍数。. ( 1 ) 当浓度为10L/mL.-_，100L/mL，A260/A280比值在1.7，._，1. 9之间时，适宜于实时荧光PCI之扩增。8.3 实时荧光PCR栓诞8.3.1 实时荧光PCR反应体系实时荧光PCR反应体系见表2，每个样品各做两个平行管。可先将反应试养

11、j及寻i物预混成混合液形式。3 SN/T 3730.1-2013 表2实时荧光PCR反应体系试剂名称终浓度反应/L、BJX L r、M TZ OA G T Z E X m e P 1X 12.5 上下游寻I!捞(10mol/L)探针(5mol/L)DNA摸板(10g/mLlOOg/mL)是00nmol/L 200 nmol/L 2.0 补水至真核生物内参照的反应体系向上，仅以25 8.3.2 实时荧光PCR反应参数8.3.3 实验对照检验过程中分别设陷性对黑、组成分的样品提取的DNA为i男性应体系。9 Jj支量控摇以下条件有一条不满足时，实a) 空白对照:元荧光对数增讪荫性对照:元荧光对数c)

12、 捂住对照:有荧光对数d) 内参照:有荧光对数增应的Ct值30.00的Ct值30.0。10 结果判定及表述10.1 结栗判定飞嗖磋霉莘莘伊在符合第9章的情况下，被检样品进行检测时:a) 如Ct值35.0，则判定为被检样品蹈性，扩增靶标序列参克附录Aob) 如Ct值二三40.0，则判定为被检样品阴性。c) 如35.0Ct值40.0，则重复一次。如再次扩增后Ct毯扔为40.0，那判定被检样品阳性;如再次扩增后Ct值二三40.0，JJ!U*U定被检样品阴性。10.2 结果表述10.2.1 结果为自性者，表述为检出组成分。10.2.2 结果为i男性者，表述为未捡出绍成分。4 SN/T 3730.1-2

13、013 11 防污染措施检测过程中前止交叉污染的措施按照GB/27403中的规定执行。12 检出跟本部分所规定方法的最低梭出限(LOD)为0.01% (质量分数)。zd SN/T 3730.1-2013 附录A(资料性附录)貌成分的基因扩增靶析、参考序列A.1 71组成分基因扩增靶标参考序列GCTTCAATCCTCTAT丁丁CATAATCCTCCTAGTCTTCATGCCAATCGTCAGYATTATTGAAAATAATCTAT丁AAAATGAAGAGTCTT丁GTAGTATATCAATTACYTTGGTCTTGTAAACCAAAAATGGAGAACCCTATCTCCCTAAGACTCAAGG

14、AAGAAGC A.2 紫箱、日本毅、黄喉翻成分基因扩增靶标参考序列TAGCRAAGAGACCTTAAGCTAACTCCCCCGAAACCAGACGAGCTACCTATGAGCAATCCAC AGGGATAAACTCATCTATGTCGCAAAATAGTGARAAGACTTRYAG 6 的-ONl气。泛的H在中华人民共和自出入境检验检疫行业标准食品及饲料中常克畜类品种的鉴定方法第1部分:裂成分拴测实时荧光PCR法SN/T 3730.1-2013 中医标准出般社出版花京市朝陷区和平里西街串2号(100013)花京市西城区三里河北街16号(100045)总编室:(010)64275323陈桂中嚣栋准出报社秦皇岛印辅厂印剧开本880X 1230 1/16 印张0.75字数14千字2014年4月第一段2014年4月第一次印刷印数1-1600 定价16.元苦书号:155066 2一26829SN/T 3730.1-2013