GB T 21769-2008 化学品.体外3T3中性红摄取光毒性试验方法.pdf
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1、ICS 13.300;11.100 A 80 量中华人民共和国国家标准GB/T 21769-2008 化学晶体外3T3中性红摄取光毒性试验方法Chemical-In vitro 3T3 NRU phototoxicity test method 2008-05-12发布2008-09-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局也士中国国家标准化管理委员会a叩GB/T 21769-2008 前本标准等同采用经济合作与发展组织(OECD)化学品测试指南No.432 (2004年)(体外3T3中性红摄取光毒性试验6。阳性对照物的历史数据应当记录。其他光毒性化学物质,若其化学分类或潜解性已被评估过
2、,亦可用于同步阳性对照物替代CPZo5.5 试验步骤5.5. 1 第一天加100L培养基于96孔组织培养板的外围孔(空白对照),在其余孔中加入100L密度为1X10s个细胞/mL的细胞悬液(=1X104个细胞/孔)。每次试验都应制备两个板,包括相同的受试物浓度序列、溶剂对照和阳性对照。细胞培养24h直至形成半融合单层。在此培养期间细胞恢复活力、贴附和指数增长。5.5.2 第二天去除培养液,用150L孵育缓冲液轻洗两次。加100L含适当浓度受试物或溶剂(溶剂对照)的缓冲液到孔中,受试物设置8个不同浓度,在暗处孵育含受试物的细胞60min。两块培养板随机选择,其中一块用于检测细胞毒性(一Irr),
3、 llP对照板z另一块用于检测光细胞毒性(+Irr),即处理板。处理板进行+Irr暴露,以无细胞毒性的最高光线剂量(见附录B)透过96孔板盖室温下照射约50 min,在室温下将对照板(-Irr)置于暗盒内50min(=光线暴露时间)。去除试验溶液,用150L孵育用不含受试物的缓冲液小心洗两次。用培养基代替缓冲液孵育过夜(18 h22 h)。5.5.3 第三天5.5.3. 1 显微镜观察相差显微镜察细胞生长情况、形态和细胞单层的完整性,记录细胞形态和生长的变化。5.5.3.2 中性红摄取试验用150L预温的缓冲液冲洗细胞,轻轻敲打去除清洗溶液。加100L含50g/mL中性红元血清的培养基,按照5
4、.2.2孵育3ho 孵育后,吸除中性红培养基,用150L缓冲液清洗细胞。以吸干或离心方式倾倒和去除多余缓冲液,准确加150L中性红洗脱液(用水、乙醇、乙酸按49: 50 : 1的比例现配)。将96孔板置于微量滴定板摇荡器快速震荡10min,直到中性红从细胞中提取出来并形成均匀溶液。用分光光度计在540nm下以空白试剂为参照测量中性红提取物的光密度。试验数据用电子格式保存,便于随后分析。6 试验结果6. 1 试验数据的质量和数量如果受试化学物质的浓度范围内细胞活性下降到50%(lCso) ,那么无论在有光照还是在元光照下6 GB/T 21769-2008 得到的试验数据都应进行有意义的浓度-反应
5、分析。如果发现细胞毒性,不管是整个浓度范围和还是其中任何一个浓度,两者都应符合一条由试验数据拟合成的曲线。对于明显阳性和明显阴性的结果,除此主试验外,再加上一个或多个范围确定试验支撑就足够了,无需做重复试验进行确认。模棱两可的、临界范围附近的和不清楚的结果需要进一步试验进行澄清,在这种情况下,应该考虑改变试验条件。试验条件的改变可能包括浓度范围或间距、预孵育时间、照射暴露时间等。对于水不稳定性化学物缩短暴露时间或许比较合适。6.2 试验结果处理6.2. 1 为评价试验数据,可计算光剌激因子(PIF)或平均光效应(MPE) 6.2.2 为计算光细胞毒性的数值,必须通过适当的连续剂量-反应曲线(模
6、型)对离散的剂量反应值进行约算。对数据进行曲线拟合通常采用非线性的回归方法,为评估数据变异性对拟舍曲线的影响,推荐采用共益程序(或毗带程序bootstrapprocedure)进行分析。6.2.3 预测模型1:光剌激因子(PIF)参考欧盟指令EU67/548/EEC附录VB. 41体外3T3中性红摄取光毒性试验方法,计算PIF值za) 如果在有光照(+Irr)和无光照(-Irr)两种情况下都得到完整的浓度响应曲线,通过式(2)计算PIF值zICso (- Irr) PIF =( 2 ) ICso (十Irr)b) 如果一个化合物只在有光照(+Irr)时有细胞毒性,而在元光照(-Irr)时无细胞
7、毒性,即使试验结果表明其可能具有潜在光毒性,也元法计算PIF。在这种情况下,如果用受试物最高浓度(Cmu;)进行元光照一Irr)下的细胞毒性试验,则可利用Cmu;通过式(3)计算PIF值2C卢(+Irr) PIF= . . ( 3 ) ICso (一Irr)c) 如果受试物在达到允许的最高浓度值也不表现细胞毒性而使得ICso(+ Irr )和ICso(-Irr)的值无法计算,这就表明该受试物无潜在光毒性。这时,用PIF=祷1描述结果,即式(4):Cmu;(一Irr)PIF =赞1.( 4 ) C卢,(+Irr) 在利用式(3)和式(4)计算的情况下,预测受试物的潜在光毒性时应仔细考虑受试物在试
8、验中所达到的浓度回6.2.4 预测模型2:平均光效应(MPE)平均光效应(MPE)是一种基于比较完全浓度反应曲线的计算方法,它的定义是指全部具有代表性的光效应数值的加权平均数。MPE的值通过式(5)计算z.z:; W.PEa MPE=自1.z:;叫.( 5 ) 任何一个浓度(C)的光效应(PEc)是指反应效应(REc)和剂量效应CDEc)的乘积,即PEc=REcXDEc.反应效应(REc)是指无光照和有光照观察到的反应之间的差别,即REc=Rc(-Irr)-Rc (+Irr).剂量反应由式(的得出z1 C/C. -11 DEr一|一一一一一一|. . . . ( 6 ) 1 C/C. + 11
9、 其中c代表等值浓度,即撤度为C的一I反应相当于+Irr时反应的浓度,如果由于+Irr曲线中GB/T 21769-2008 的反应值整体高于或低于Rc(-Irr)而使C不能得出,则剂量效应定为1。加权因子W;由最高反应值得出,即W;=MAXR;(+Irr),R;(-Irr).格子浓度G指选择落在由试验浓度的值确定的每个浓度间隔内的相同数量的点。MPE的计算严格局限于最高浓度下的两条曲线中,至少有一条曲线的反应值仍出现至少10%的情况。如果这一最高浓度高于+Irr试验中的最高浓度,则+Irr的残余部分设定为反应值0。依据MPE的值是否大于正常选择设定的临界值(MPEc=O.15),对化学物质进行
10、光毒性分类,6.2.5 计算PIF和MPE的软件包可从OECD官方网站获得.6.3 结果解释6.3. 1 由预测模型得出的数值,如果z受试物PIF0.15,预测光毒性。但是在利用预测模型PIF的情况下z如果仅得到一个PIF,那么任何大于1的值均表明受试物具有潜在光毒性;如果仅得到一个PIF=祷1,则受试物无潜在光毒性。6.3.2 对于任何一间实验室最初建立这一检测方法,应在进行受试物光毒性检测前应先用列于表1的参考物质进行试验,试验得到的PIF值和MPE值应接近于表1中所列数值。表1参考物质的光毒性测定鼓据化学物名称和CAS编号PIF MPE 吸收峰溶剂盐酸胶硕翻Amiodarone 242
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