GB T 21758-2008 化学品.两代繁殖毒性试验方法.pdf

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1、ICS 13.300;1 1. 100 A 80 中华人民=:u工-飞、和国国家标准GB/T 21758-2008 化学品两代繁殖毒性试验方法Chemicals-Test method of two-generation reproduction toxicity study 2008-05-12发布中华人民共和国国家质量监督检验检菇总局中国国家标准化管理委员会2008-09阳01实施发布GB/T 21758-2008 古目前本标准等同采用经济合作与发展组织(OECD)化学品测试指南No.416(2001年)(两代繁殖毒性试验)(英文版。本标准作了下列编辑性修改z一一增如了范围部分;一一计最单

2、位改成我国法定计量单位;一一删除OECD的参考文献部分。本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口。本栋准负责起草单位z中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所。本标准参加起草单位z宁波出人境检验检疫局、广东出入境检验检疫局。本标准主要起草人z孙金秀、陈小青、马中春、龙再浩、林振兴、许崇辉、程树军。I 广一一GB/T 21758-2008 OECD 51盲1. 1995年6月，OECD生撞发育毒性工作绕在哥本哈根召开了讨论会议，要求对现行的OECD生殖发育毒性试验指南进行更新，制定原指南中没有的新的发育毒性试验终点。工作组建议应根据美国和德菌的提议对两代繁蕴毒性

3、试验进行修订。工作组对本指南的所有主要修订项目达成一致。2.提供关于受试样品对雌性和雄性动物生殖系统的整个生殖功能和行为作用的一般性资料=如性腺功能、动情周期、交配行为、受孕、娃振、分娩、哺乳、断乳以及子代的生长发育情况等，也可提供新生仔疾病、死亡、出生前后发育辛辛性等方面取得如步资料，为下一步的毒性试验提供参考。除研究F1子代的生长发育外，本试验亦可对F2子代以及F2子代的雌性和雄性的生殖系统整个生殖和行为生长发育进行系统评价。为进一步全面获得发育毒性和功能缺陷方面的资料，有时可能需要附如进行一些发育毒性和/或发育神经毒性试验或用其他试验指南在其他试验中研究这些终点。直叫, , GB/T 2

4、1758-2008 化学品商代繁殖毒性试验方法1 范围本标准规定了化学品商代繁殖莓住试验的范围、试验基本原则、试验方法、试验数据和报告。本标准适用于检测化学品的繁殖辛苦性。2 试验基本原则2. 1 本试验将雄、雄动物分为有一定梯度的不同剂量组。P代雄鼠要在生长期染毒受试物且至少要覆盖一个完整的精子形成周期(小鼠约56d，大鼠70d)以诱发对生精过程的有害作用。可通过测定一些精子参数(例如精子形态和精子活力布组织制品及详细的组织病理学检查来检测受试物对精子的影响。如果可从巴完成的试验期足够长(例如90d)的重复染毒试验中获得椅子生成的相关数据，本试验则不再需要评价雄性亲代(肘。但为了以后进行的评

5、价，建议保存雄性亲代(的精子样品和记录数据。为评价受试物对发情期的有害作用，P代雌鼠应从生长期开始染毒并持续几个完整的动情期再交配。峰、雄鼠在交配期继续给予受试物。亲代雌鼠(P)在娃振期也要继续染毒并持续到子代F1断乳。子代F1断乳后要继续给予受试物，并从子代民的生长期、成熟期、交配后、子代F2出生，直至F2断乳。2.2 应对所有动物进行临床观察毒性症状和病理学检查，特别注意蝶、雄动物生强系统整体抗能状态和表现及对子代生长发育的影响。3 试验方法3. 1 试验准备3. 1. 1 动物品系的选择首选大鼠。如用别的品系，则应给出适当的理由并作一些必要的改进。但不应使用儒生育率或巳知具有高发育缺陷率

6、的品系。试验开始前，应尽可能降倚试验动物间的体重变异使之不超过相同性别平均体茧的20%。3. 1.2 饲养条件试验动物房的温度应保持在220C士30C。虽然相对湿度至少在30%70%之间，但最好控制在50%60%。应采用人工照明，12h明暗交替。实验室常规饲料喂养，不限饮水。经饲料染毒时，应确保受试物在饲料中混合均匀。试验动物可单笼饲养，也可按性别少量群养。交配过程应从饲养笼取出，放人合适的笼具内进行便于确认交配情况。确定交配后，应将蝶鼠放在分娩笼或产笼里单独饲养;也可按少量一组进行群养，在分娩前1d或2d移人分娩笼单养。在分娩临近时，应向孕鼠提供合适的垫窝料。3. 1. 3 动物准备选择处于

7、年轻、健康的、没有接受过其铀试验的动物。试验前适应实验室环境至少5d。试验动物应标明种属、品系、来源、性别、体重和(或)周龄。试验之前应明确所用动物的亲属关系以避免发生同胞交配。应将动物随机分为对照组和处理组(推荐按体重进行随机分组。笼具放置位置也应尽可能避免由于安放位置不同商对试验造成影响。每个动物都要有单独唯一的标记。亲代(P)动物应在开始染毒前完成。子代凹，则在动物断乳并选择用于交配前完成。所有被选的子代F1动物，要记录和保存其窝别来源的信息。当仔鼠需要称章或进行某检查时，出生后应尽可能早地栋上唯一的记号。亲代(P)动物应从断乳后5周9周开始染毒。所有试验组动物应是尽可能相近的体重和周龄

8、。1 GB/T 21758-2008 3.2 试验程序3.2. 1 动物性别和数最染毒组和对照组应有足够数量的动物以保证分娩前约有20只孕鼠。对接触后导致不育、高剂量组毒性过大、死亡等的物质，有时不一定能获得20只孕鼠。只有足够数量孕鼠才能对生育力、受孕、母鼠的行为、哺乳，以及子代凹从胎儿至成熟期的生长发育、子代F2出生到断乳可能产生的潜在影响作出有价值的评价。因此，如果不能获得预期的怀孕动物数(比如20只)，试验结果虽然不一定就无效，应当报据具体情况进行具体分析。3.2.2 受试物制备推荐使用经口途径对试验动物毒(如经皮或吸人)。应将受试物溶解或悬帮化液(例如玉米油和其他剂里的稳定性。3.2

9、.3 剂量设计最少应设三应该引起毒性但不应控制在10%以有害作用水平(距通常选择24饲试验中，剂量组料。受试物或相否合适。对照组不组动物处理方用率降低，就有必照试验所获得的应考虑溶剂和试物的毒性特征;以3.2.4 限量试验如果通过本试验规定或通过饲料和饮水染毒所的相关化合物的数据表明更高的经口染毒剂量时，则不可使用要参考受试物的理化特性如溶解性，常常3.2.5 染毒操作胃)，需要时也可通过其他途径染其次再考虑用油溶被或乳，并测定受试物在该溶，所选的最高剂动物的死亡率的作用和无可见)。递减缓闰10倍。在喂试验资定给药设计是1000 mg/(kg d) , 于结构和(或代谢。当人类暴露资料显示需要

10、，比如吸人或经皮染毒，则常常需首选经口途径染毒饲料、饮水或灌胃法)。每周染毒7d。如果使用了其他的染毒途径，就要提供理由并进行适当的调整。整个试验过程中所有的动物必须采用相同的给样方式。如果受试物是采用灌胃法给予，就要使用胃管。每次灌胃液量应不超过1mL/100 g(如果采用的是玉米油，则最大体积为O. 4 mL/100 g) ;如果是水溶液，则最大体积可提高到2mL/100 go试验过程中，除了高浓度下会加剧作用的剌激性或腐蚀性物质浓度不能太高外，应通过调整敢度将测试体积的差异性降到最假以保证所有剂量水平的体积是假定的。如果使用的是灌胃法，哺乳期仔鼠是通过奶液间接摄取受试物，直到它们新乳后才

11、能直接给予受试物。当采用饲料或饮水给予受试物时，在泌乳期的后期，仔鼠开始自日采食，仔鼠就可以直接摄取受试物。GB/T 21758-2008 当采用饲料或饮水给予受试物时，最重要的一点是要确保受试物的添加比例不会干扰动物正常的营养和水平衡。当受试物通过饲料给予时，可用恒定法度Cmg/kg)或根据动物体主意计算出恒定剂量水平来表示接触程度;不论选择哪种，都应附上详细说明。当采用灌自法给予受试物时，应每天在同一时间染毒，并且，每周至少根据体重调整一次染毒量以使荆最维持在恒定水平。当根据体重调整灌胃剂量时，应考虑受试物在胎盘中的分布情况。3.2.6 试睡过程亲代CP)蝶、雄鼠应从5周龄9周龄时开始染毒

12、。子代F1雌、雄鼠则从断乳后开始每日染毒;需要注意的是，在通过饲料或饮水给予受远躲阔咛宇有囊瞌染毒受试物可能于已在哺乳期开始。对于亲代P和子代凹的地雄鼠，在蛮配前都要持续染毒至少10周边周交配期也应染毒。对不再需要评价生殖作用的雄鼠，应将其人荔挝死并进每解剖智慧?喝挝;CP)雌贝应继续染毒，从怀孕期直到子代F1断乳。如果已有资料者明虽摇物:有毒性、代谢诱导或更输事集信恙，就要调整相应的染毒计划。通常，应根据每只动物眼当啦腥来确定各自的剂量，但是，对娃据三分一时间的剂量调整应特别小心谨慎。亲代?和子代其全部人道处死。3.2.7 动物交3.2.7. 1 亲代每次交配2周。每天检查功，则可考虑栋识和

13、记录，3.2.7.2 子代子代F1点物进行交配以窝里选出动物进好是按体重来进未受孕的一来次交配、对生殖器官3.2.7.3 二次支配有时，首次交配时F1动物进行二次交配以能力的异性鼠进行二次交配。约一周再进行二次交醒。3.2.8 窝的大小代F1雌、雄鼠时，应将日不同窝的其他动植按随机原则从每。从实用性上讲，最口进行交配。能力的动物再进行一定前影响，建议让亲代P或子代后僻的雌鼠或雄鼠与证实具有生育的繁殖，就要在最后一窝断乳后应允许动物正常产仔，和哺育子代至断乳期。对窝的标准化，但方法没有明确的规定;标准化时，需详细描述所使用的方法。3.3 观察结果3.3. 1 临床观察必须每日进行临床观察。灌留法

14、试验时，观察时间应在染毒后预期反应高峰期。应详细记录动物的行为改变、难产或滞期分娩的表现和所有中毒体征。另外，每周至少应进行一次详细的检查，若在称童时进行则更方便。另外，每日两次周末每日一次)观察动物的发病和死亡情况。3.3.2 亲代动物的体章和食物/水的消耗量灌胃观察时，亲代动物CP和F1)应在开始染毒当天称盒，此后至少每周一次。亲代雄鼠CP和Fl)GB/T 21758 2008 应在赶振期第0天、第7天、第14天和第20天或21天称蠢，哺乳期应在测量窝重的当天和处死动物当天进行称重。应逐一报告每只成年动物的这些观察结果。在交配前期和娃振期，至少应每周测量食物的最小摄入量。如果受试物是通过饮

15、水给予的话，也至少应每周测量一次水的消耗量。3.3.3 发情周期对P和F1雌鼠发情期的长短与状态可在交配前和交配期任何时间进行阴道涂片观察结果来评价，直到得到交配成功的证据为止。如果阴道涂片中发现有民道/宫颈细蹄，要鉴别出是带膜紊乱还是或假性娃振造成的。3.3.4 精子参数试验结束时，应记录所有P和F1雄鼠擎丸和附擎的重量，取一侧器官圈定用于组织病理学检查。对于每组P和F1雄鼠中的不少于10只雄鼠，未商定的辈丸和附辜以用于测定生殖细胞抗均一化和附串尾精子的计数。收集附辜尾或输精管内的精子评价精子活力和精子形态。如果观察到与处理有关的影响，或在其他的试验中发现了受试物对精子生成有影响，每个剂量短

16、的所有雄鼠都应进行精子评价;否赌，精子计数只限于对照组和高剂量组的P与到的动物。应计数辜丸抗均一化精细胞和附辜犀精子的总数。可通过用于进行定性评价的悬浮液中的精子浓度和体积计数，或从剁碎或匀浆的剩余附辜尾组织液中回收的精子数来计算附辜尾的精子储存量。所有剂量组中被选择的雄鼠在处死后立即进行计数，除非已经进行了影像记录或数字记录，或者标本巴被冷冻用于以后的分析。应先对最高剂量组和对照组进行分析。如最高剂量组未见与处理相关的影响例如对精子计数、精子活力和精子形态的研究)，则不必分析其伪荆景组。反之，若最高剂量级发现与处理相关的影响，则其他剂量组也应作进一步的分析评价。在处死动物后应立即评价附辜(或

17、输精管)的精子活力或进行录像。精子的回收要尽量减少损伤，并用大家可接受的方法进行稀释作精子活动性分析。要主观或客观地测定进行性活动精子的百分比。如果使用了计算机辅助运动分析，精子进行性活力的产生依赖于用户所定义的平均通道速率和直线或线性指数的酶值。如果对样品进行了录像或在解剖时进行了拍照，随后只需对对照组和高剂量组P和F1动物进行分析;如果观察到了与处理有关的影响，其他低前量组也应进行评价。如果没有进行录像或拍照，解剖时应对所有剂量组的样品进行分析。应对附辜(或输精管的精子进行形态学分析。应用固定、湿式样品检查精子每个样品至少200个)，按正常或不正常分类。不正常的精子形态包括精子融合、游离头

18、、畸形头和或畸形尾。在处死每个剂量中所选雄鼠后应立即进行精子形态学分析，或进行录像或拍照，备于以后分析。涂片固定后，也可在以后进行部片。在这些情况下，应先对最高剂量组和对照组进行分析。如最高lfIJ量组没有发现与处理有关的影响例如对精子形态的影响)，则不必分析其他剂量组。反之，若最高剂量短发现与处理有关的影响，则其他剂量组也应作分析评价。如果在90d或以上的系统性毒性试验中已经对精子进行了上述所有参数的检查，在两代萦殖试验中就没必要重复测定。不过，建议保存亲代P精子的样品或数字化记录以便以后必要时可进行评价。3.3.5 子代在分娩后(泌乳当天应尽可能早地进行检查，包括幼仔的数量、性别、死产、活

19、产以及异常等。如在分娩当天发现死仔，检查有元缺路、导致其死亡的原因并加以保存。活仔鼠于出生当天(泌乳当天或生后第1天汇总活仔的数量并逐个称章，并在泌乳的第4天、第7天、第14天和第21天进行称重。商时，还要记录所观察到的母体和子代的身体或行为异常。子代的身体发育主要通过体重增加来记录。其他的体格参数例如开耳、开跟、出牙、毛发生长)可以提供补充信息，但这些信息最好与性成熟资料例如阴道开口或组皮分离时的日龄和体重一起评价。如果未单独设计相关功能(例如运动活力，感觉功能，反射功能的发育试验，特别是与性成熟有关的功能检查，就要在F1子代断乳前和(或断乳后进行这些功能的检查。应检查断乳后被选作交配的子代

20、F1动物白道开口和包皮分离的日龄。如果子代F1的性别比或性成熟时间出现改变，应在子代F2出生GB/T 21758-2008 当天测最J1I门与生蕴器阔的距离。如果动物出现了明显有害作用例如体重增加明显缓慢等)，这些组就可以不进行动能检查。如果进行功能检查，不应选择将进行交配的仔鼠。3.3.6 大体解剖试验结束时和试验期间死亡的所有亲代CP和别动物、所有外观畸形或出现临床症状的仔鼠，以及从Fl和F2子代两代中随机抽取的至少每窝蝶、雄各一只仔鼠一只/一个性别/一窝，都应肉眼观察有元结构异常和病理学改变，特别是生殖器官的形态异常或病理改变。死亡或因颜死被人道处死的仔鼠在被浸泡固定前也应检查有元缺陷和

21、(或死亡原因并保存标本。检查所有初产母鼠的子宫，观察着床位置及着床数量。3.3.7 器官称童试验结束时，应对所有的P和凹动物进行称重并测量以下器官的重量(成对的器官应分别称重): 子宫，卵巢;辜丸，附辜(附辜整体和附率居);前列腺z精囊(内含凝固腺)及其液体作为一个单位);脏、肝、肾、辉、垂体、甲状腺、肾上腺和己知的靶器官。试验结束时要对Fl和F2中被选作大体解剖检查的仔鼠进行称章并对随机抽取的每窝每性别一只动物进行脑、脾和胸腺的称重。如果可行，应结合其他重复染辛辛试验的观察结果来评价大体解剖和器官囊量的意义。3.3.8 组织病理学检查3.3.8. 1 亲代动物应将亲代P和Fl动物的以下器官和

22、组织或其代表性样本固定并保存，以便于进行组织病理学检查。一一阴道，带有子宫颈的子宫和卵巢(用合适的固定剂保存); 一一侧辜丸用布英防腐液CBouins)或类似的固定剂保存，一倒附辜，精囊，前列腺和凝国腺;一一从被选作交配的所有P和Fl动物中已经确认的靶器官。应对高剂量组和对照组被选作交配的所有P和Fl动物进行以上所列器官和组织的全面组织、病理学检查。亲代P动物的卵巢检查则作为备选。有时，为了更好阎明NOAEL，对于低剂量组和中剂量组的器官改变证明与处理有关时，该器官也应进行检查。另外，还应对低剂量组和中剂量级动物的生殖器官怀疑存在生殖能力减退(例如不能进行交配、受孕，不能生产或分娩出正常子代，

23、或动情周期、精子数量、活力或形态受到了影响)的动物进行组织病理学检查。应检查所有肉眼可见的损害如萎缩或肿瘤。应对辜丸进行详细的组织病理学检查例如用布英防腐液CBouins)固定，进行石蜡包埋并切取4m5m库的切片以鉴别出与处理有关的影响，如滞留的精细胞、缺失生殖细胞层或类型不明以及多核在细胞或生精细胞成堆进入生精管腔内。完整的附辜检查应包括头、体和尾，可通过附擎的纵切商检查。应根据白细胞浸润、细胞类型的改变程度、异常细胞类型以及精子被吞噬状态来评价附辜。可用对氨基水杨酸CPAS)和苏木精对雄性动物生植器官进行染色和检查。泌辛L后的卵巢组织病理学检查应包括初始和生长卵油以及泌乳期的黄体。组织病理

24、学检查应对原始软泡数减少进行定性。应对Fl代雌鼠进行原始卵泡的定量分析z动物数、卵巢切片的选择以及切片样本大小均应符合所用评价程序统计学要求。该项检查应包括原始卵泊的计数而这种原始卵泡常和小的生长卵泡混合在一起)，并将染毒组和对照短的进行比较。3.3.8.2 断乳动物应将所有具有外部缺陷或临床症状的仔鼠，或从未被选作交配的Fl和F2代中随机挑出的每窝每性别一只仔鼠中，大体检查所见的异常组织和靶器官，进行固定并保存以用于组织病理学检查。在对保存的组织进行全面组织病理学检查时要着重检查生殖系统的器官。5 e) 被处死的亲代动物的体重以及绝对和相对器官重30 临床症状、严重程度和持续时间(是否可逆)

25、; g) 试验过程中的死亡时间或动物是否存活到试验结束zGB/T 21758-2008 h) 按性别和剂量组分别记录的毒性反应，包括交配成功率、生育力、受孕率、活产卒、出生率、生育率和泌孚L率;报告中应有用于计算这些指数的动物数;。对生强、子代以及出生后生长等方面的毒性作用或其他作用zj) 大体解剖所见Ek) 所有组织病理学检查所见的详细描述:D 周期正常的?和到的雌性动物数以及周期长度;m) 附辜尾的精子总数，进行性活动精子的百分比，形态学上正常的精子百分比以及每种异常精子的百分比zn) 交配、交配成功的时间，包括交配前的天数50) 娃振期的长度zp) 着床数、黄体数和胎仔数;q) 活产数和

26、着床后又丢失的数量z。如果统计了发育不全的幼仔数，就应报告其中具有大体可见异常的幼仔数;s) 幼仔体格方面的数据和出生后的其他发育数据，应对评价的体格指标进行说明zt) 如果可能，则要提供幼仔和成年动物的功能检查数据z合适的结果统计学处理。4.3.6 结果讨论。4.3.7 结论，包捂对母鼠和幼仔影响的NOAEL值。4.4 试验结果的解释本试验可反映动物在整个生殖周期里多次接触某一受试样品店对繁殖功能所产生的影响。特别是试验能提供关于生殖机能参数、子代生长发育和存活的资料。试验结果解释时，应结合亚慢性试验、致畸试验、毒代动力学试验和其他试验的结果进行综合分析。常常能用于评价该化学物是否需要进行进

27、一步研究，但试验结果外推到人仍存在着一定的局限性。试验结果能提供无作用剂量水平和制定人体安全接触水平依据。OONlmhFNH阁。华人民共和国家标准化学品商代繁殖毒性试验方法GB/T 21758-2008 国中非中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张O.75 字数16千字2008年7月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2008年7月第一版* 书号:155066 1-32171 如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533