GB 4789.16-1994 食品卫生微生物学检验 常见产毒霉菌的鉴定.pdf
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1、中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验常见产毒霉菌的鉴定Microbiologl曲lexamination of food hygiene Identification of common mycotoxin producing fungi 1 主题内容与适用范围本标准规定了食品中常见的产毒霉菌的鉴定方法。本标准适用于曲霉属、青霉属、镰刀菌属及其他菌屑的产毒菌种的鉴定。2 引用标准GB 4789. 28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3设备和材料3. 1 显微镜。3.2 目镜测微计。3.3物镜测微计。3. 4 温箱。3.5冰箱。3.6 无菌接种罩。3. 7 放大镜。3.8 酒精灯。
2、3.9接种钩针。3. 10分离针。3. 11 滴瓶。3. 12 载物玻片。3. 13盖玻片,18mmX18mmo 3. 14 小刀。4培弊基和试?”4. 1 乳酸苯盼液2按GB4789. 28中3.24规定。4.2 察氏培养基z按GB4789. 28中77规定。4.3 马铃薯葡萄糖琼脂培养基z按GB4789. 28中4.79规定。4.4 马铃薯琼脂培养基g按GB4789. 28中4.80规定。4. 5 玉米粉琼脂培养基g按GB4789. 28中4.82规定。中华人民共和国卫生部199403 18批准218 GB 4789. 16-94 代替GB4789-16 84 1994 09 01实施GB
3、 4789-16-94 5操作步骤5. 1 菌落的观察z为了培养完整的巨大菌落以供观察记录,可将纯培养物点植于平板上。方法是:将平板倒转,向上接种一点或三点,每菌接种两个平板,倒置于2528C温箱中进行培养。当刚长出小商落时,取出一个平皿,以无菌操作,用小刀将菌落连同培养基切下1cmX2 cm的小块,宣菌落一侧,继续培养,于514d进行观察。此法代替小培养法,可直接观察子实体着生状态。5. 2 斜面观察将霉菌纯培养物划线接种(幽霉、青霉)或点种(链刀菌或其他菌)于斜面,培养514d.观察菌落形态,同时还可以将菌种管置显微镜下用低倍镜直接观察抱子的形态和排列。5. 3制片z取载玻片加乳酸苯盼液一
4、滴,用接种针钩取一小块霉茵培养物,置乳酸苯盼液中,用两支分离针将培养物撕开成小块,切忌涂抹,以免破坏霉菌结构。然后加盖玻片,如有气泡,可在酒精灯上加热排除。制片时最好是在接种罩内操作,以防抱子飞扬。5. 4 镜检z观察霉菌的菌丝和抱子的形态和特征、抱子的排列等,并做详细记录。5. 5 报告z根据菌落形态及镜检结果,参照以下各种霉菌的形态描述及检索表,确定菌种名称。6各种霉菌的形态特征6- 1 曲霉属(Aspergillus) 本属的产毒霉菌主要包括黄曲霉、寄生曲霉、杂色幽霉、构巢曲霉和棕曲霉。这些霉菌的代谢产物为黄曲霉毒素、杂色曲霉素和棕曲霉毒素。曲霉属的颜色多样,而且比较稳定。营养菌丝体由具
5、横隔的分校菌丝构成,无色或有明亮的颜色,一部分埋伏型,部分气生型。分生袍子梗大都无横隔,光滑、粗糙或有麻点。梗的顶端膨大形成棍棒形、椭圆形、半球形或球形的顶囊,在顶囊上生出一层或二层小梗,双层时下面一层为梗基,每个梗基上再着生两个或几个小梗。从每个小梗的顶端相继生出一串分生袍子。由顶囊、小梗以及分生抱子链构成一个头状体的结构,称为分生抱子头。分生抱子头有各种不同颜色和形状,如球形、放射形、棍棒形或直柱形等。幽霉属只少数种形成有性阶段,产生封闭式的闭囊壳。某些种产生菌核或菌核结构。少数种可产生不同形状的壳细胞。6- 1. 1 黄曲霉(A.avus)属于黄曲霉群。在察氏琼腊培养基上菌落生长较快,1
6、014d直径34或47cm,最初带黄色,然后变为黄绿色,老后颜色变暗,平坦或有放射状沟纹,反面无色或带褐色。在低倍显微镜下观察可见分生于包子头疏松放射状,继变为疏松柱状。分生抱子梗多从基质生出,长度一般小于1.mm。有些菌丝产生带褐色的菌核。制片镜检观察可见分生抱子梗极粗糙,直径1020m。顶囊烧瓶形或近球形,直径1065 m,一般多为2545m。全部顶囊着生小梗,小梗单层、双层或单、双层同时生在一个顶囊上g梗基6 10 m 4 5. 5 m,小梗6.5 10 m 3 5 m。分生袍子球形、近球形或稍作洋梨形,36m,粗糙(见图1)。黄曲霉产生黄曲霉毒素,该毒素能引起动物急性中毒死亡,如长期食
7、用含微量黄曲霉毒素的食物,能引起肝癌。219 GB 4 789- 16-94 I 2 =c工r 因1黄曲草草1 双层小梗的分生袍子头;2 单层小梗的分生抱于头$3一分生抱子梗的基部足细胞)I 4 双层小梗的细微结构;5 分生抱于6- 1. 2 寄生曲霉(A.parasiticus) 亦属于黄曲霉群,810d菌落2.54cm,平坦或带放射状沟纹,幼时带黄色,老后里暗绿色,反面奶油色至淡褐色。低倍显微镜下观察见分生于包子头疏松放射状,直径400500m,分生泡子梗长短不一,一般为2001000m,制片镜检观察,见分生抱子梗光滑或粗糙,近顶囊处宽1012m,顶囊近球形或烧瓶形或样状,直径2035m,
8、小梗单层,79mX3 4 m,排列紧密。分生袍子球形,极粗糙,具小刺,直径3.5 5. 5 m,未报道过产生菌核。寄生曲写的菌株都能产生黄曲霉毒素。6. 1. 3 杂色曲霉(A.versicolor) 属于杂色曲霉群。在察氏琼脂培养基上菌落生长局限,14d直径23cm,绒状、絮状或两者同时存在。颜色变化相当广泛,不同菌系可能局部淡绿、灰绿、浅黄甚至粉红色,反面近于无色至黄橙色或玫瑰色。有的菌落有无色至紫红色的液滴。分生抱子头疏松放射状,大小为100125m,分生抱子梗长度可达500700m,宽1216m,光滑,无色或略带黄色。顶囊半椭圆形至半球形,上半部或四分之三部位上着生小梗。小梗双层,梗基
9、5.5 8 m 3 m,小梗57.5 m 2 2. 5 m,分生袍子球形,粗糙,直径2.5 3 m或稍大。有些菌系产生球形的壳细胞(见图2)。杂色曲霉产生杂色曲霉素,该毒素引起肝和肾的损害,并能引起肝癌。. 220 GB4789-16-94 &i I I 矶。;i川m l 图2杂色曲霉I 分生泡子头;2分生抱于13壳细胞6. 1. 4 构巢幽霉(A.nidulans) 属于构巢曲霉群。菌落生长较快,!4d直径56cm,绒状,绿色,有的菌系由于产生较多的闭囊壳而显现黄褐色,反面紫红色。分生炮子头生在柱形,4080lmX25 40 /tffio分生抱子梗极短,常弯曲,一般75 100 lffi,近
10、顶囊处直径3.5 5 lffi,褐色,壁光滑。顶囊半球形,直径8lOlmo小梗双层梗基56 lffi 2 3 lffi,小梗56lffi 2 2. 5 lffi。分生袍子球形,粗糙,直径33.5 /tffio闭囊壳球形,暗紫红色,直径13550lffio子囊1f!子双凸镜形,紫红色,约5lffi 4 Im,有两个鸡冠状突起。闭囊壳外面包围着尧细胞,淡黄色,球形,壁厚,直径约25Im(见图3)。构巢曲霉产生杂色幽霉素。10 m I 。 1川2 图3构巢曲草草I 分生抱子头;2足细胞3壳细胞6 1-5 蒲曲霉(A.ochr!ceus) 属于精曲霉群。在察氏琼赌培养基上菌落生长稍局限,014cl直径
11、34cm,褐色或浅黄色,基10!:221 GB 4789-16-94 中菌丝无色或具有不同程度的黄色或紫色,反面带黄褐色或绿褐色。分生抱子头幼时球形,老后分裂成23个柱状分叉。分生子自子梗长达11.5 mm,直径1014m,带黄色,极粗糙,有明显的麻点。顶囊球形,直径3050m或更大。小梗双层,自顶囊全部表面密集着生。分生抱子球形至近球形,直径2.5 3m或更大,常略粗糙。有些菌系产生较多的菌核,初期为白色老后淡紫色,球形,g形至柱形,直径达1mm(见图4)。持曲霉产生猪曲霉毒素,该毒素是一种强的肾脏毒和肝脏毒。J m 。 2 图4插曲莓I 分生袍子头,2分生抱于梗6-2 青霉属(Penici
12、llium)本属产毒霉菌,主要包括黄绿青霉、桔青霉、圆弧青霉、展开青霉、纯绿青霉、红青霉、产紫青霉、冰岛青霉和皱裙青霉等。这些每菌的代谢产物为黄绿青霉素、枯青霉素、圆弧偶氨酸、展青霉素、红青霉素、黄天精、环氯素和皱裙青霉素。青霉属的营养菌丝体呈无色、淡色或鲜明的颜色,具横隔,或为埋伏型或部分埋伏型部分气生型。气生菌丝密毡状、松絮状或部分结成菌丝索。分生抱子梗由埋伏型或气生型茵丝生出,稍垂直于该菌丝(除个别种外,不象曲霉那样生有足细胞),单独直立或作某种程度的集合乃至密集为定的茵丝束,具横隔,光滑或粗糙。其先端生有扫帚状的分枝轮,称为帚状枝。帚状枝是由单轮或两次到多次分校系统构成,对称或不对称,
13、最后一级分枝即产生袍子的细胞,称为小梗。着生小梗的细胞叫梗基,支持梗基的细胞称为副校。小梗用断离法产生分生泡子,形成不分枝的链,分生抱子虽球形、椭圆形或短柱形,光滑或粗糙,大部分生长时呈蓝绿色,有时呈无色或呈别种淡色,但决不呈污黑色。少数种产生闭囊壳,或结构疏松柔软,较快地形成子囊和子囊于缸子,或质地坚硬如菌核状由中央向外缓慢地成熟。还有少数菌种产生菌核。6- 2. 1 黄绿青霉(P.citreoviride),异名毒青霉(P.toxicarum) 属单轮青霉组,斜卧青霉系。菌落生长局限,1012d直径23cm,表面皱裙,有的中央凸起或凹陷,淡黄灰色,仅微具绿色,表面绒状或稍现絮状,营养菌丝细
14、,带黄色。渗出液很少或没有,有时呈现拧棱黄色,略带每味。反面及培养基呈现亮黄色。分生抱子梗自紧贴于基质表面的菌丝生出,一般50100m 1. 6 2. 2 m,壁光滑。帚状枝大部为单轮,偶尔有作一、二次分枝者。分生抱子链约略平行或稍散开。小梗为紧密的一簇,812个,大多912m 2. 2 2. 8 mo分生抱子呈球形,2.2 2. 8 m,壁薄,光滑或近于光滑,成链时具明显的抱隔(见图5)。222 GB 4 7 8 9 1 6 94 黄绿青霉的代谢产物为黄绿青霉素,该毒素是一种很强的神经毒。l E-eN ,- 2 0 I oo已lOm 图5黄绿青霉I 帚状枝,z分生抱子6-2-2 桔青霉(I.
15、citrinum 属予不对称青霉组,绒状膏霉亚组,桔青霉系。菌落生长局限,1014d直径2z.5 cm,有放射状沟纹,大多数菌系为绒状,另一些则呈现絮状,艾绿色。反面黄色至橙色,培养基颜色相仿或带粉红色。渗出液呈淡黄色。低倍显微镜下分生抱子链为明确的分散柱状。分生抱子梗大多自基质生出也有自菌落中央气生菌丝生出者,一般50200m 2. 2 3 m,壁光滑,一般不分枝。帚状枝出34个轮生而略散开的梗基构成,1220m z. 2 3 m,每个梗基上簇生610个略密集而平行的小梗,B11mX 2 2. 8 mo分生抱子呈球形或近球形,直径2.23.2 m,光滑或近于光滑(见图6)0桔青霉产生桔青霉素
16、,该毒素是种强的肾脏毒。2 10 m 因6桔青霉l 帚状枝;2一分生袍子6 2.3 圆弧青霉(P.cyclo户ium)属于不对称青霉组,束状青霉亚组,圆弧青霉系。菌落生长较快,1214d直径4.55cm,略带放射状皱纹,老后或显现环纹,暗蓝绿色,在生长期有宽12mm之白色边缘,质地绒状或粉粒状,但在较幼区域为显著束状。渗出液无或较多,色淡,反面无色或初期带黄色,继变为橙褐色。帚状校不对称,紧密,常具三层分校,约5060m,上生纠缠的分生袍子链。分生抱子梗大多200400m 3 3. 5 m, 223 GB 4 7 8 9 1 6 94 典型地粗糙,但也有些菌系近于光滑。副枝1530m 2. 5
17、 3. 5 m。梗基1015mX2.53. 3 m。小梗48个轮生、710m 2. 2 2. 8 mo分生于包子大多近球形,34m,光滑或略现粗糙(见图7)。因弧青霉的代谢产物为圆弧偶氮酸,该毒素是一种神经毒。20 m 图7困弧青霉的帚状枝及分生泡子链6. 2. 4 岛青霉(P.i., L/ J飞飞J。1) ()Jll 。,图12。f1,2 产紫青霉的帚状枝和分生抱子,3红色青霉的帚状枝和分生泡于6-3 镰刀菌属(Fusarium)226 GB 4 7 8 9 1 6-94 本屑的产毒霉菌主要包括禾谷镰刀菌、串珠镰刀菌、雪腐镰刀菌、三线镰刀菌、梨泡镰刀茵、拟枝饱镰刀菌、尖抱镰刀菌、茄病镰刀菌和
18、木贼镰刀菌等。这些霉菌的代谢产物为单端抱霉烯族化合物、玉米赤霉烯闹和丁烯酸内酶等。在马铃薯葡萄糖琼脂或察氏培养基上气生菌丝发达,高o.5 1. 0 cm或较低为0.3 0. 5 cm,或更低为0.1O.2 cm p稀疏的气生菌丝,甚至完全元气生菌丝而由基质菌丝直接生出粘泡层,内含大量的分生袍子。大多数种小型分生抱子通常假头状着生,较少为链状着生,或者假头状和链状着生兼有。小型分生抱子生于分校或不分枝的分生抱子梗上,形状多样,卵形、梨形、椭圆形、t主椭圆形、纺锤形、披针形、腊肠形、柱形、锥形、逗点形、圆形等。12(3)隔,通常小型分生抱子的量较大型分生抱予为多。大型分生抱子产生在菌丝的短小爪状突
19、起上或产生在分生袍子座上,或产生在粘抱团中g大型分生泡子形态多样,镰刀形、线形、纺锤形、披针形、柱形、腊肠形、蠕虫形、鲤鱼形,弯曲、直或近于直。顶端细胞多种形态,短啄形、锥形、钩形、线形、柱形,逐渐变窄细或突然收缩。气生菌丝、子座、特抱团、菌核可呈各种颜色,基质亦可被染成各种颜色。厚垣袍子问生或顶生,单生或多个成串或成结节状,有时也生于大型分生殖子的抱室中,无色或具有各种颜色,光滑或粗糙。镰刀菌属的些种,当初次分离时,只产生菌丝体,常常还需诱发产生正常的大型分生抱予以供鉴定。因此须同时接种无糖马铃薯琼脂培养基或察氏培养基等。6- 3. 1 串珠镰刀菌(.moniltforme) 在马铃薯葡萄糖
20、琼脂培养基上气生菌丝呈棉絮状,蔓延,高0.2 0. 8 cm,有些商株平铺或局部低陷,试管壁或菌落中央有一定程度的绳状或柬状的趋势。气生菌丝的色泽随菌株及培养基而异z白色、浅粉红色、淡紫色。基质反面为较淡的黄、猪、紫红乃至蓝色,或它们之间的颜色。野生型菌株一般产抱子良好,在气生菌丝层上见有一层稍稍反光的、松散的细粉就是散落成堆的范子。某些菌株在菌落中央产生粉红色、粉红于肉桂色的粘抱团,个别菌株则为暗蓝色,粘抱回含大量的小型分生抱子及较多的大型分生袍子。小型分生于包子呈椭圆形、纺锤形、卵形、梨形、腊肠形。透明,单细胞或有12个隔,直或稍弯,37(14) mX2 4. 8 m(液体培养时较大为91
21、8mX2.56m)。小型分生抱子成串或假头状(见图13)。大型分生抱子为镰刀形、纺锤形、棍棒形、线形,直或稍弯。抱子两端窄细或粗细均一,或一端较锐,透明,壁薄,一般多为36个隔,7隔者罕见(见图13)。3隔的大小平均为36m 3 m; 5隔的大小平均为49mX 3.1 m; 6隔的大小平均为5660m 4. 5 4. 8 m。在马铃薯培养基上有些菌株可产生子座,呈黄色、褐色或紫色。有些菌株还可形成菌核。子囊阶段s藤仓赤霉。串珠镰刀菌主要寄生于禾谷类作物,如稻谷、甘廉、玉米和高粱等,其代谢产物为串珠镰刀菌素和玉米赤霉烯酬。图13串珠镰刀菌, “ 1 小型分生袍子12大型分生袍子227 GB 47
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