SN T 1941.3-2007 进出口食品中乳酸菌检验方法 第3部分 乳酸杆菌的PCR法.pdf

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1、人4酷幽瞄干丁辑如月1941.32007事L也哈匈BS:轧PC段of胎cteriain food for import Pai-t 3: l，actobacillus是附近生如odexport-一2007由08-06发布2008-03-01实施中华人民共如畸发布国家股量监督撞撞撞接总自G吕丁941(吐出11食品中乳酸的检验方法分为三个部分:一一第1部分:分离与计数方法;2部分:Petri filrn肉片以;一-第3部分:乳酸柯:闹的PCR法。半部分为SN/了HJ41的?寄3部分心;卒部分的附录人和附录巳均为规范性附录。本部分出!贯家认证认可j监督管现委员会捉出:t归1本部分起草单位:中华人民共

2、和国辽宁出入境检验检疫局。本部分主要也草人:关矶、关ii秋月、李川、胡传伟、李振，1i-.-;本部分系首次发布的出入境检验检疫行U标准。SN/T 194 1. 3- 2007 I 194 1. 3-2007 进出口食品中乳酸菌检验方法3部分:乳酸杆菌的是法1 范围的测庐J.:.2 规范性引用文件牛噎GB 19189 SN 3 230叩2002措施物和废弃物院小心4 t.i EU 缩路i吾5. 1 5. 1 1 11甘5. 1. 2 polymerase (hain reaction , PC议作为反应的引物，的1在此下q通将与巳因片j双H则DNA)于歹IJ豆补的.作为PCRSN/T 194 1

3、. 3-2007 寻i物。5.2 缩略i宫下列缩略tfi适用于ST斗111941的本部分。5. 2. 1 PCR. polymera时chainreaction( PCR，聚合酶链反应)。5.2. 2 DNA :deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸。5.2. 3 dNf P: deoxyriboucleoside triphpbate，脱氧核iL二磷酸。5. 2. 4 clA TP: deoxyadenosine triphosphate，脱氧腺仔三磷酸5.2. 5 dCTP:cleoxy巳ytidinetriphosphate，脱氧胞昔三磷酸。5. 2.6 d(n吗P:d

4、eoxyg uanosne triphosphatc，脱辄l可忏:二磷酸。5.2. 7 dTTP : deoxythymidne trphosphate，脱轼胸昔三磷酸。5.2.8 dUTP :cleoxyuridine uiphosphate，脱氧尿背三磷酸。5. 2. 9 UD: uracil DN A glycosylase，尿略院DNA-精基酶。5.2. 10 bp : bas巳pair，f&基对5.2. 11 T叫:T!阳musquatl正，水生栖热菌。5.2. 12 T ris : tris ( hydroxymetbyl) aminomethane，三(瓷月1基)氨基甲:峰。5.

5、2.13 TE: Tris-HCl、EDTA缓冲液。6 培养基辛日试剂除约有规定外，式齐IJ均为分析纯或生化试剂，实验用水为灭菌双蒸水。6.1 MRS肉汤(见第J气1:章)。6.2 MRS 中(见销人2) , 6.3 改良番茄汁J;J脂培养基(改良丁TA培养基)(见第人3章)? 6.4 改良MC培养基见第A.4意)。6.5 乳酸杆菌属检测用引物:5fwctca启吕actaaa caa agt ttc-I/，所挝取的模板DNA溶于50/J.L TE中。剩余含乳酸忏商向前1曾随液分别于有辄和厌轼条件下，36飞士飞;但摇过夜培养，以各确切;试验使JUc 8.3.3 PCR扩增(可参照相关试剂盒操作说

6、明)反应体系体积50L:10 X PCR缓冲液(Mg2+P lus) 5L、引物对(20pmol/U各O.5 !LL、dNTP(2. 5 rnmoVLJ4L、TaqDNA聚合酶(5U/L)0.25L、模板DNA /1.L，71补足至50L反应条刊.;950CfJ月二段-t1min，95C变性30日，550C火:30s , 72C延伸30日，进行:30个循环，72(延伸7min,tl 0(.保存。8.3.4 质控检骗过程中要设阳性对照、阴性对照和空白对照。分别接种乳酸杆的标准菌株日来号为CMCC8. 3. 5 PCR扩增产物电沫检验FFJ 50X TAE r苞咏援4眩(工忍.4结果及判断8.4.

7、1 PCR扩增产物电谅检验乳酸杆菌PCR扩增产物为28啕4.2 结果判断阴性别照和l空白对J!有小的特-征条带，怀疑存在乳酸杆商，常8.4.3 确证试验取8.:L2中36QC土:10C I:JJ挝躏*tt-进行葱川。8. 4. 4 结果表述PCR扩增产物电泳检验结PCR扩增产物咆和(检验结8. 5 庭弃物处理和防止污染的检验过程中的废弃物，收集检验过程中防止交叉污染的措1卖希民l茧f，j准1茶粉自号为八TCC25922到营养|去j汤中，DNA模板作1;0性对照，大肠埃希氏yjJc凝胶(世主化乙惋终j在度达到l俨将7.5 I1， PCR扩增产物分别和lr o 9 V妃m恒压，电旅20min30

8、min o 的特征条带:恃测样品出现预期大期大小的扩增条带，为阴阳=结果。板卡，按照SN/丁1941.挑lTZ中检出乳酸杆菌。A.1 MRS肉wiA.1.1 成分iI在牛肉醉月户葡萄糖nt盐80拧棱酸按乙酸lj硫磷酸氢二;二倒茶馆7).A. 1. 2 制法将各成分加入燕惚水中，加热并习最终pH7.3-二0.20A. 2 IVH是S玉京路A. 2. 1 成分蛋白陈牛肉营酵母浸膏葡萄精l吐?品80乙酸的硫酸镜硫酸镜磷酸氢二书p琼脂蒸i1有水J飞.2.2寄自附录A(规范性附录)培养基和试剂10.0民10.0 g 2.。只5. 0 g 0.1 g 0. 05 g 2. 0 g 15.0 g 1 000

9、 mL SNj1、1941.3-2007分完全溶解，121:高压灭菌15川口，将各成分圳人燕ttril水中，力日热并不断搅拌.煮阱1mi口，使琼脂完全溶解.2 0(;高压灭菌15口.11口，最5 194 1. 3-2007 pH 7.:3士O.20 A.3 改良番茄A. 3.1 成分番晶汁酵母挝i肉J主.4过5毫MCA. 4.1 成A. 4. 2 牵引HP(丸)将种成分相人中，如50 mL . 0 g 10.0 g 20.0 g 2.0 g 。只l. Og 5.0 g 15.0 g 1 000 mL 孔。到5.0 g o g 20.。20.0 g 仇。15 . 0 g 1 000 mL mL

10、100 OOOIU pH6.0 , 咛li扫雪Hv 附录路(规范性附竟是)检验过程中防止交叉污染的措施B. 1 插样和制待过程描样丰11制应清洗干净每12115 min,-.,., 20 min, 存放样品的容器应该经过清洗、高压灭菌.或为叩a次性充菌技2检验过程SN/T 1941.3-2007 限于1份样品使用。B. 2.1 PCR实验室应分为样品市1备区、前PCR王、PCR区和后PCRrx:。将模板提取、民:f反应液配制、PC汉循环扩增反PCR产物的接定等步骤分区或分空进行。实验室的运作应从洁净区到污染区押单向进行。政2.2实验过程中.应穿实验服、戴手套，手套要经常更换。各区要有专用实验服

11、，经常清洗0B. 2. 3 各民所有的试齐Ikfii才(尤其是移被器人仪器都应专用，不得带出i亥队。B. 2. 4 所有攘攘、水、耗材剧器具要121C15 min高压灭菌，避免污染。每种溶液应使用分析纯试剂和新蒸f留的双蒸水。在20C250C贮蒋的试11IJ中9可加入。025%的所有试剂配制后.应分装成仅够由次使用的B.2看5B组26B. 2. 7 B.2.8 B.2.9 前，要简短鸣心，离叶管不能YFIJJ崩开嗡以物安全柜中加入PCR反应各组分。.1实拭去除各种器具手11设备表面残留的DNAhhCG队iiMVe严时飞缸俨民i出.I!立出口食品中3部分:乳酸车子嚣的PCRSN/丁1941.:l -Z007 中华人民去Cfl rrm标准出版，让出版门外二:在河北街16号邮政编码，1000斗5问主1: :68523946 68517548 1日子字印刷l印邸厂印版880 1230 1/16巨II张O.75 2007年UJj第.Jt反2007年11月印数12000 告告书号155066公18198中