SN T 1917-2007 牛地方流行性白血病聚合酶链反应操作规程.pdf

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1、版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1917-2007 牛地方流行性白血病聚合酶链反应操作规程Protocol of polymerase chain reaction for enzootic bovine leukemia 2007-05-23发布2007-12-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检度总局版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售目。吕本标准参考了。IE(陆生动物疾病诊断i式验和疫苗标准子册上本标准的附录A和附录B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。本标准

2、主要起草人:段宏安、张睿、周毅、姚燕林、王海涛、李金华、刘小琴。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。SN/T 1917-2007 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售1 范围牛地方流行性自血病聚合酶链反应操作规程本标准规定了牛地方流行性白血病聚合酶链反应检测方法。本标准适用于牛地方流行性白血病的检测。2 规范性引用文件SN/T 1917-2007 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于

3、本标准。GB/T 6682 分析实验室用水规格和民验方法CeqvISO 3696: 1987) S:-.J /T 1193 基因检验实验室技术要求3 缩略语3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3. 7 3.8 下列缩略i吾适用于本标准。BL V Bovine Leukemia Virus 牛白血病病毒PCR Polymerase chain reaction 聚合酶链反应。BSA bovine serum albumin 牛血清白蛋白。dNTP deoxyribonucleoside triphosphate 脱氧核糖核昔三磷酸。dA TP deoxyadenosine triph

4、osphate 脱氧腺昔三磷酸。dCTP deoxycytidine triphosphate 脱氧胞昔三磷酸。dGTP deoxyguanosine triphosphate 脱氧鸟昔三磷酸。dTTP deoxythymidine triphosphate 脱氧胸昔三磷酸。版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售SN/T 1917-2007 3.9 3.10 3.11 3.12 3.13 bp base pair 碱基对。ddH20 double distilled water 双蒸水。EDTA ethylene diaminetetraacetic acid 乙二肢四乙酸。Taq酶TaqDNA

5、polymerase Taq D:lA聚合酶。TBE Tris-HCl、borate、EDTA缓冲液。3.14 3.15 3.16 Tris tris (hydroxymethyl) aminomethane 三(起甲基)氨基甲:皖。FLK fetal lamb kidney 羊胎肾细胞CPE cytopathic effect 致细胞病变效应。4 方法原理牛地方流行性白血病是由牛白血病病毒(BLV)引起的疾病，牛在任何年龄段均可感染，病毒以前病毒的形式整合于宿主细胞DNA，存在于血液淋巴细胞和肿瘤细胞中。病毒也在各种体液包括鼻液、气管液、唾液和牛奶等的细胞成分中发现。从抗凝全血样品中分离的外

6、周血淋巴细胞、血沉棕黄层或冷冻的全血以及肿瘤细胞均可用于提取病毒核酸，先用一对外侧引物扩增BLV目的基因gp51(env)的一个大片段，再用一对内侧引物以大片段为模板进行第二次扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，以确定样品是否含有BLV。5 试剂和材料5.1 双蒸水应符合GB/T6682中一级水规格。5.2 琼脂糖(电泳纯)。5.3 漠化乙链(EB)。5.4 1飞叫酶:5U/Lo -20C保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。5.5 D:lA分子量标准(DNA Marker) : 50 bp 500 bp，须在320bp360 bp之间至少有一条带。5.6 BLV阳性对照:可取BLV持续感染的

7、FLK细胞提取DNA用于PCR反应阳性对照，或由指定单位提供。5.7 PBS(pH7.2)溶液、红细胞裂解液、淋巴细胞分离液、TE缓冲液、d:lTP、引物、10X PCR反应液、电泳缓冲液和10X加样缓冲液参见附录Ao版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售6 主要仪器6.1 微量可调移液器。6.2 PCR扩增仪。6.3 元菌室、超净工作台或通风橱。6.4 消毒灭菌锅。6.5 离心机。6.6 冰箱。6. 7 纯水器或超纯水器。6.8 旋涡、混合器。6.9 电泳仪。6.10 紫外分析仪或凝胶成像系统。6.11 紫外可见分光光度计或核酸蛋白分析仪。6.12 子持式均质器。7 试验方法7.1 样品处理7.

8、 1. 1 抗凝血处理SN/T 1917-2007 取淋巴细胞分离液轻轻加到等量的抗凝血上，注意不要摇动打乱液层，2000 r/min离心20min，离心后分成多层，最上层是血浆层，中间层是分离液，最下层是红细胞，在血浆层与分离液之间是一层较致密的白色层，为淋巴细胞层，用毛细吸管插入并吸取该层放入另一离心管中，以PBS洗涤后备用，若暂时不能实验时将样品冻结保存。7.1.2 血凝块处理取出装有血凝块的采血管，将于持式均质器的均质头置入灭菌双蒸水中清洗后，浸入无水酒精中清洗，于火焰上烧灼至干，浸入灭菌PBS中冷却，置于血凝块中均质，直至无团块状物存在。血凝块均质液加入等量红细胞裂解液充分混匀，置于

9、冰上15mi口，加入冷至20C80C的灭菌双蒸水至满管，如加入红细胞裂解液后已满管，可先行离心后再加灭菌双菌水，颠倒混匀，1500 r/min离心5min，去上清液，如沉淀仍有血凝块，可用红细胞裂解液裂解直至无血凝块存在，细胞沉淀用PBS洗涤二次后备用。7.1.3 肿瘤或其他组织处理将肿瘤或其他组织加入PBS成10%的匀浆液，1000 r/mi日离心5mi口，取上清备用。7.1.4 细胞培养物处理刮取样品接种后出现CPE或可疑的细胞培养物500L，经2000 r/min离心10mi口，去上清，取沉淀备用。7. 1. 5 检测过程中防止交叉污染的措施按照S:-.J/T1193中的规定执行。7.2

10、 病毒DNA提取7.2.1 取微量离心管，每管加100L5 % chelex-100溶液，再加入7.1中处理好的样品、阳性、阴性对照各100L，细胞培养物离心后的沉淀可直接加入chelex-100溶液，旋涡泪匀，560C 600C孵育20 mi口，旋涡混合10s，980C水浴10mi口，旋涡泪合10s，置于冰上j冷令去却却P3 min口n，15 0Oo r旷/min离J心L.2 min口1取上清5L用于PCR反应O剩余部分置于40C短期或200C长期保存备用O7.2.2 可选用其他合适D:-.JA抽提方法或商品化试剂盒提取D:-.JAo7.3 套式PCR扩增7.3. 1 一次PCR反应体系在P

11、CR反应管中配制一次PCR反应体系:10XPCR缓冲液5L，d:-.JTP1L、BLV1A和BLV6A版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售SN/T 1917-2007 各1L、T叫酶o.5L、DNA提取物5L、水36.5L，总体积50L反应体系中各试剂浓度可进一步优化，使用不同PCR扩增仪，可对参数作适当调整。7.3.2 一次PCR反应条件反应在PCR扩增仪中进行，首先940C变性45s，60oC退火60s , 720C延伸90s，进行5次循环，随后940C变性45s，550C退火60s，720C延伸90s，进行30次循环，经720C延伸10min结束反应。7.3.3 二次PCR反应体系在PCR

12、反应管中配制二次PCR反应体系:10XPCR缓冲液5L，dNTP1L、BLV3和BLV5各1L，T叫酶O.5L、一次PCR扩增产物5L、水36.5L，总体积50Lo7.3.4 二次PCR反应条件反应在PCR扩增仪中进行，首先940C变性45s，580C退火60s , 720C延伸90s，进行5次循环，随后940C变性45s，550C退火60s，720C延伸90s，进行30次循环，经720C延伸10min结束反应。7.4 琼脂糖;疑胶电泳用TBE电泳缓冲液配制2%的琼脂糖(含O.5g/mL EB)平板。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液淹没胶面。将8L二次PCR扩增产物和2L电泳缓冲液混匀后加入

13、样品孔。在电泳时设立DNA分子量标准作对照。5V/cm电泳0.5ho紫外检测仪下观察电泳结果并记录。8 结果判断PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，阳性对照检测出341bp大小的条带，阴性和空白对照未出现条带。样品扩增出341bp大小的条带即可判断为阳性结果，必要时，取PCR产物扩增产物测序，与参考序列(参见附录B)同源性在95%以上，可确证为阳性结果。如果条带大小不在341bp位置或无条带即可判断为阴性结果。4 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售A.1 PBS溶液(pH7.2)附录A(资料性附录)试剂自己制SN/T 1917-2007 氯化专内(NaC1)8.5g，氧化何(KCl)O.2g，磷酸

14、氢二铀(Ja2HPOl 12H20)2. 85 g，磷酸二氢梆(KH2P01 )0.27 g，定容至1000 mL双蒸水中，调pH至7.2，灭菌备用。A.2 红细胞裂解液0.15 mol/L JH4CI-0. 01 mol/L KHCO,-O. 001 mol/L Na2-EDTAc A. 3 5 % Chelex-100溶液称取5g Chelex-100，定容至100mL蒸悟水中，移取时，边搅拌边用灭菌的1000L吸头移取，必要时，可将灭菌吸头尖部用灭菌剪刀剪掉，以移取时可吸取胶珠且不流出为宜。A.4 淋巴细胞分离液(聚蘑糖-泛影葡肢液，1. 077 :t O. 00 1) 取9%聚蔚糖(分

15、子量400000)24份与33.9%泛影葡胶10份泪匀，过滤除菌或114.3cC高压灭菌15 mi口，分装于棕色瓶中，置于4cC保存，一般可保存3个月。A.5 TE缓冲液10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA ,pH 8.0。A.6 dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)将同样浓度的dATP、dTTP、dCTP和dGTP等体积1昆匀，制备成所需浓度的dNTP，使用浓度为10 mmol/Lc A.7 引物配制成15mol/L。引物序列分别为:BLV1A:5-CrTTGT GTG CCA AGT CTC CCA GAT ACA-3 BLV6A:5-CCA A

16、CA TAT AGC ACA GTC TGG GAA GGC-3 BLV3:5-CTG TAA ATG GCT ATC CTA AGA TCT ACT GGC-3 BLV5:5-GAC AGA GGG AAC CCA GTC ACT GTT CAA CTG-3 A.8 10 X PCR缓冲液(含MgCl2) 100 mmol/L氧化饵CKCl), 160 mmol/L硫酸接口NH4)2S04 , 20 mmol/L硫酸镜CMgS04), 200 mmol/L Tris-HCl(pH8.的，1%Trito口X-100，1mg/mL BSA , 25 mmol/L氧化镜(MgC12)c A.9 电

17、泳缓冲液(5X TBE) Tris 54 g，棚酸27.5g , O. 5 mol/L EDTA(pH8. 0)20 mL，加蒸馆水至1000 mLc A.10 10 X加样缓冲液0.25%澳酣蓝，40%蔚糖。5 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售SN/T 1917-2007 附录B(资料性附录)确证试验一-PCR产物泪IJ序PCR扩增的gp51基因参考序列:CTTTCTGTGCCAAGTCTCCCAGATACACCTTGGACTCTGTAAATGGCTATCCTAAGATCTA CTGGCCCCCCCCACAAGGGCGGCGCCGGTTTGGAGCCAGGGCCATGGTCACATATGA

18、TTGC GAGCCCCGATGCCCTTATGTGGGGGCAGATCGGTTCGACTGCCCCCACTGGGACAATGCCT CCCAGGCTGATCAAGGATCCTTTTATGTCAATCATCAGATTTTATTCCTGCATCTCAAAC AATGTCATGGAATTTTCACTCTAACCTGGGAGATATGGGGATATGATCCCCTGATCACCT TTTCTTTACATAAGATCCCTGATCCCCCTCAACCCGACTTTCCCCAGTTGAACAGTGACTG GGTTCCCTCTGTCAGATCATGGGCCCTGCTTTTAAATCAAACAGCACGGGCCTTCCCAGAC TGTGCTATATGTTGG 6 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售khCON-h-问Z中华人民共和国出入境检验检疫行业标准牛地方流行性白血病聚合酶链反应操作规程SN/T 1917-2007 -兴中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷当咛开本880X 1230 1/16 印张o.75 字数12千字2007年9月第一版2007年9月第一次印刷印数1-2000 定价8.00元-兴书号:155066.2-18060 SN/T 1917-2007