GB T 5521-1989 谷物和谷物产品α-淀粉酶活性的测定 比色法.pdf

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1、GB 552189 本标准等效采用国际标准ISO 39831977谷物和谷物产品 -淀粉酶活性的测定 比色法。 1 主题内容和适用范围 本标准规定了用比色法测定谷物和谷物产品 -淀粉酶活性所用仪器、试剂、分析步骤和结果计算。 本标准适用于测定谷物和谷物产品 -淀粉酶活性，也可用于测定源于真菌或细菌的 -淀粉酶干粉的活性。 2 定义 1L溶剂从1g样品中所提取的酶，在规定条件下，每秒钟降解1.02410-5单位的 -极限糊精底物溶液，则该样品的 -淀粉酶活性等于一个单位，极限糊精是被 -淀粉酶完全降解了的淀粉产物。 3 原理 酶降解 -极限糊精底物溶液，经过不同的反应时间，将反应混合物等分加到碘

2、溶液中。随着反应时间的增加而使颜色强度降低，以测定酶活性。 4 试剂 4.1 碘（GB 67877）； 4.2 碘化钾（GB 127277）； 4.3 冰乙酸（GB 67678）； 4.4 硫酸（GB 62578）； 4.5 无水乙酸钠（GB 69481）； 4.6 氯化钙； 4.7 可溶性淀粉1）；注：1）可采用Lintner淀粉或质量相当的国产可溶性淀粉。浙江菱湖化工试剂厂产品符合要求。 4.8 浮石粉； 4.9 碘贮备液： 称取11.0g碘化钾溶于少量水中，加入5.50g结晶碘，搅拌至碘完全溶解。再定容至250mL，置于棕色瓶中，在暗处贮存，此溶液可保存一个月； 4.10 碘稀释液： 页

3、码，1/5GB 5521892006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbrR552100K.htm 称取40.0g碘化钾溶于水中，加4.00mL碘贮备液，并稀释至1L，用时现配，不可过夜； 4.11 缓冲液： 称取164g无水乙酸钠溶于水中，加入120mL冰乙酸用水定容至1L； 4.12 0.2（ m/V）氯化钙溶液； 4.13 0.05mol/L硫酸溶液； 4.14 -淀粉酶溶液： 称取10g有酶活性的黄豆粉（粗细度为通过1.5mm孔筛），加入85mL水和 15mL0.05mol/L硫酸充分搅匀，静置15min，抽滤，该滤液用于制备 -极限糊精底物溶液； 4.1

4、5 -极限糊精底物溶液： 称取5.00g（干基）可溶性淀粉于小烧杯中，加入约20mL水混匀，将其边搅拌边缓慢倒入盛有100mL沸水的500mL高型烧杯中，并用洗瓶将小烧杯中的淀粉全部转移至高型烧杯中，继续搅拌并加热，缓慢煮沸2min。加盖表面皿，在自来水中冷却至30以下，加入25mL缓冲溶液及50mL -淀粉酶液，在室温下放置20h，加入1勺浮石粉，将此溶液在10min之内缓慢煮沸，然后继续沸腾5min以上。冷却至30以下，用水定容至250mL，摇匀，过滤。滤液中加几滴甲苯，此溶液的pH值应为4.70.1,在25以下可连续使用五天。 5 仪器 5.1 恒温水浴，300.1； 5.2 恒温水浴，

5、200.1； 5.3 分光光度计或比色计； 5.4 秒表； 5.5 筛子：孔径为1.0mm、1.5mm； 5.6 pH计。 6 分析步骤 6.1 分光光度计及其空白调整： 将分光光度计连接稳压电源，预热20min，调整波长为575nm。将2.0mL氯化钙溶液加到10.0mL稀碘溶液中，然后以适量的水 V0稀释（加水量一般为2040mL， V0详见6.2），混匀后达到20，用1cm比色皿进行测试，调节仪器狭缝宽度，使吸光度为零。 6.2 底物溶液的校准： 分别吸取5.0mL -极限糊精溶液和15.0mL氯化钙溶液于一个100mL烧杯中，混匀取出2.0mL混合液至另一个100mL烧杯中，加入10.

6、0mL稀碘溶液和适量的水，混匀置于20水浴中，用1cm比色皿在波长575nm处，以6.1所用溶液为参比，测其吸光度。调整加水量，使测得的吸光度在0.550.60之间，如果测得吸光度大于0.60则增大加水量，如果测得值少于0.55则减少页码，2/5GB 5521892006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbrR552100K.htm加水量。通过反复试配，直至测定的吸光度值在0.550.60之间，记下此时的加水量 V0，并用它调整空白溶液的加水量 V0即为该 -极限糊精测试时的加水量。 6.3 -淀粉酶的提取： 称取谷物样品约5g（精确到0.05g），倒入300mL

7、锥形瓶中，加入预热到30 的氯化钙溶液1000.5mL，充分摇匀，置于30的恒温水浴中。在15、30、45min 时从水浴中取出，上下颠倒锥形瓶10次，重新置于水浴，共提取60min。取出过滤，滤液即为酶提取液。 6.4 -淀粉酶活性测定： 把酶提取液和 -极限糊精溶液置于30水浴中，10min后用快速移液管吸移5.0mL -极限糊精溶液至盛有15.0mL酶提取液的锥形瓶中，加塞后摇匀。在加液的同时，用秒表计时。吸取10.0mL稀碘溶液于各个50mL容量瓶中，加入 V0mL水， 混匀加塞后置于20水浴中，每隔5min或10min进行下列操作： 6.4.1 吸取2.0mL酶、 -极限糊精混合液到

8、一个盛有稀碘溶液和 V0mL水的容量瓶中，摇匀后置于水浴，使溶液温度达到20。 6.4.2 倒入比色皿测其吸光度。 7 结果计算 7.1 计算公式： -淀粉酶活性由下式求得： 7.2 计算举例： 含14.6水分的样品5.20g，用100mL氯化钙溶液提取。由于酶提取液与极限糊精的反应速度太快，故用氯化钙溶液稀释酶提取液，1份酶提取液加1.5份氯化钙溶液。因此f11.52.5。 极限糊精与酶提取液混合后，间隔5，10和20min后，吸光度分别为： A=（500 f/m）100/（100- h）（lg D1-lgD2）/（ t1-t2）=500 f b/m）100/（100- h）式中： A -淀

9、粉酶活性，单位；m100mL氯化钙提取的试样质量，g；h试样中水分含量，；f酶提取液的稀释倍数；t1、 t2不同的反应时间，min；D1、 D2时间 t1、 t2时的吸光度；blg D对 t的曲线的斜率的绝对值；500系数。时间，min 吸光度 D lgD+15 0.498 0.697页码，3/5GB 5521892006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbrR552100K.htm 根据5min和10min后的观察结果： 用三个观察结果作lg D对 t的曲线（见图）。 把 b=0.01391代入公式得： 7.3 结果的重复性： 同一实验室同时或连续两次测定结果之

10、差，不得超过平均值的10，如果两次测定结果符合要求，则取结果的平均值。按下表修约： 10 0.425 0.62820 0.308 0.489b（0.6970.628）/（105）0.0138min1A5002.50.01391/5.20100/（10014.2）3.9单位 页码，4/5GB 5521892006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbrR552100K.htm 活性，单位 修约成整数范围，单位 50 50500 5005000 500050000 0.1 1 10 100 注： 测定过程中应合理调整酶的浓度，使3560的 -极限糊精在1540min内降解，即最后测得的吸光度为底物校准时吸光度的4065。如果吸光度降得太快，则酶液可用0.2的氯化钙溶液再稀释。如酶的活性太低，为获得正确结果，可将反应时间延长到60min以上。在用分光光度计测定吸光度时，溶液的温度对结果有影响，必须控温在20，在6.4的操作中，从显色到测定吸光度的间隔时间一般对结果没有影响，如测定一系列样品，可在所有样品均完成显色后再一起测定吸光度。但最长间隔时间不得超过1h。页码，5/5GB 5521892006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbrR552100K.htm