SN T 2248-2009 化学品.坯胎发育毒性试验方法.pdf

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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2248-2009 化学晶胚胎发育毒性试验方法Chemicals一-Testmethod of prenatal developmental toxicity 2009-02-20发布2009-09-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局SN/T 2248-2009 目Ij1=1 本标准等同采用经济合作与发展组织(OECD)化学品测试方法No.414(2001年01月刊胚胎发育毒性(英文版)。在标准文本格式上按GB/Tl. 1-2000做了以下编辑性修改，主要差异如下:增加了范围部分;将OECD化学品测试方法No.414中有关方法的介绍

2、、目的、范围等改为本标准的引言。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出井归口。本标准负责起草单位:中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。本标准参与起草单位:中华人民共和国宁波出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本标准主要起草人:周志荣、钟邦奇、马中春、杭晨、陈健、顾政、魏洪兵。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。I SN/T 2248-2009 百|本标准主要提供受孕期染毒对受孕母体和胚胎发育影响的一般性信息，其主要是对母体效应、死亡、结构畸形或胎儿发育改变的评价。功能缺陷虽然也是发育的一个很重要的部分，但不是本标准的内容。个别情况下，本标准的试验方法在基于特定因素(如受

3、试物的理化性质或毒理性质)的基础上需做一些修改。当有足够的科学事实证明，对试验的修改会产生一个更加有意义的结果时，则这种修改是可以接受的，此时，需将相应的科学事实在试验报告中列出。H SN/T 2248-2009 化学品胚胎发育毒性试验方法1 范围本标准规定了化学品胚胎发育毒性试验的原理、试验方法和程序。本标准适用于化学品的胚胎发育毒性试验。2 术语与定义下列术语和定义适用于本标准。2.1 发育毒理学developmental toxicology 是用来研究受孕前、出生前发育、出生后直至性成熟前有害因素对发育中的个体产生有害作用的科学。发育毒性主要包括:生物体的死亡、生物体组织畸形化、发育的

4、改变及机能缺陷等。发育毒理学通常又称为畸形学。2.2 副作用advese effect 任何由染毒引起的与基线(正常水平)的偏离，主要表现生物体生存能力、生殖能力以及适应环境能力的减弱。考虑到发育毒性，在广义上副作用包括任何影响生物体正常发育(在出生前后)的外在作用。2.3 发育改变altered growth 子代器官、体重或体型的改变。2.4 异常alterationsCanomalies) 生物体在发育过程中产生的结构异常，包括畸形和变异。2.5 畸形malformations 对生物体有害的结构改变(有时可能是致命的)，而且通常很罕见。2.6 变异variation 对生物体几乎元害的

5、结构改变，这种结构改变可能是暂时的，在对照组可能会相对频繁发生。2. 7 孕体conceptus 是指从受精开始直到出生的各发育阶段，由受精卵演变过来的胎膜、胚胎或胎儿的总和。2.8 着床nidation 胚j包附着到子宫的上皮内层的过程，主要包括胚泡穿透子宫上皮，并埋入子宫内膜。2.9 胚胎embryo 生物体的早期或发展阶段，特别是受精卵在轴向分裂的发育产物，至所有主要结构的出现。1 SN/T 2248-2009 2. 10 2.11 2.12 2.13 2.14 胎仔foetus 指胚胎后期未出生的子代。胚胎毒性foetotoxicity 对胎儿的正常结构、发育、生长以及生存能力的有害作

6、用。流产abortion 未发育成熟的生物体(胚胎或死亡胎儿)从子宫内分娩出来。再暇收r囚。rption是指植入进子宫的孕体随后死亡并正被或已经被再吸收。未观察到有害作用的剂量水平no observed adverse effect level (NOAEL) 没有观察到任何毒性效应的最高剂量水平。3 原理通常情况下，将已经娃振的动物暴露于受试物下，暴露时间从着床到预定处死的前一天。处死时间应尽可能与正常分娩的时间接近，以避免由于早产导致试验数据的丢失。本标准不仅对生物体器官形成期进行观察(啃齿动物一般5d15 d，兔子一般6d18 d)，而且也能检查着床前以及经过整个娃振期直到剖宫产前一天这

7、一段时期的影响。在处死娃振动物后立即进行剖宫产，并检查子宫内容物，评价胎仔的软组织和骨髓的改变情况。4 试验准备4.1 动物的选择推荐使用最相关井常用于胚胎发育毒性试验的动物品系。啃齿类动物最好用大鼠，非啃齿类动物最好用家兔。如果使用其他品系的试验动物，要给出适当的理由。4.2 饲养条件4.2.1 啃齿动物的饲养房间温度应控制在22C士3C，家兔饲养房间温度应控制18C士3C。除动物房清洁期间外，动物房相对湿度要控制在30%70%，最好控制在50%60%。采用人工照明，应按照12h照明/l2h黑暗的顺序循环。以常规试验动物饲料喂饲，饮水不限。4.2.2 动物交配应选择在合适的笼中进行。交配的动

8、物最好单笼饲养，也可每组少数动物一起饲养。4.3 动物的准备4.3.1 应使用未进行过试验的健康动物。正式试验前要将动物至少饲养5d以适应实验室环境。试验动物应标明种、系、来源、性别、体重和/或用龄。11自近试验前，所有染毒组试验动物的体重和年龄要尽量一致。每一剂量组均应使用未生育过的成年雌性动物。应将雌性动物与来自同一品系的雄性动物进行交配，同时要避免近亲交配。4.3.2 对于啃齿类动物而言，阴道有精子或发现阴栓的当天定为娃振第0天;而对于家兔而言，一旦发生了交配或进行了人工授精，则认定为娃振第0天。应将交配的雌性动物随机分为对照组和染毒组。试验笼的放置应尽量避免由于试验笼的安放位置不同对试

9、验造成的影响。每一动物都应有唯一编号。如果雌性动物是成批进行交配，则需将每一批的雌性动物平均分配到各个组，跟同一雄性动物交配的所有雌性动物也应平均分配到各个组。同样，采用同一雄性大鼠的精子进行人工授精的孕鼠也应当平均分配到各个组。2 SN/T 2248-2009 5 试验步骤5.1 动物数量和性别试验组和对照组应有足够数量的雌性动物，以保证在尸检时约有20只娃振动物。每组不得低于16只娃振动物。娃振动物的死亡率不得高于10%。5.2 剂量准备如果使用了赋形剂或其他的添加剂以便制备制剂，则应考虑到以下因素:对受试物的吸收、分布以及滞留或排泄的影响，对受试物化学性质的影响(有可能改变其毒性特征)，

10、对动物的取食或饮水或营养状况的影响。赋形剂既不能对动物具有发育毒性，也不能影响其生殖。5.3 用量5.3.1 通常，应该从受精卵着床当天(例如交配后第5天)至剖宫产前一天对娃振动物每天给予受试物。如果预试验结果没有显示存在高潜在性的着床前吸收，则要在整个娃振期，即从交配当天至处死前一天给予受试物。众所周知，娃振期不适当的处理或应激常常会导致流产。为消除非处理因素导致的流产，应避免对娃振动物进行不恰当的处理以及来自外部因素如噪声等的应激作用。5.3.2 试验至少设三个剂量组和一个平行对照组。应将健康动物随机分为对照组和染毒组。剂量水平的设置应能反映毒性效应的不同等级。在受试物理化和生物特性允许的

11、条件下，最高剂量应引起一些发育和(或)母体毒性(如临床症状或体重下降)，但不能引起死亡或严重损伤。至少有一个中间剂量组要引起轻微的可观察到的毒性效应。最低剂量则不引起任何母体毒性或发育毒性。剂量水平的递减顺序应能反映剂量效应关系和未观察到有害作用的剂量水平(NOAEL)或接近检测限的剂量，而这一剂量可作为测试的基准植。5.3.3 递减组间距通常选择2倍4倍，如果要设置第4个剂量组，该剂量组的组距则可以很大(例如超过10倍)。在饲养试验中，剂量组的间距不能超过3倍。虽然得出母体元可观察损害作用的剂量水平(NOAEL)是目标之一，但没有对此剂量水平进行估计的试验也是可以接受的。5.3.4 剂量水平

12、的选择要考虑到现有的毒理数据以及关于受试物或相关物质的毒代动力学方面的所有信息。这些信息可用于确定染毒频次。5.3.5 应设立一个平行对照组。该组应是阴性对照组。如果使用了赋形剂，还要设立一个赋形剂对照组。每个组都要给予相同体积的受试物或赋形剂。对照组的处理方式应与染毒组一致。赋形剂对照组应使用最高剂量的赋形剂(类似于最低剂量组)。5.4 限量试验按照本试验的程序，经口给予至少1000 mg/(kg体重.d)的剂量而没有产生可观察到的毒性效应并且依据现有的数据(例如从结构和/或代谢相关的化合物中获得)推测没有毒性，则没有必要进行三个剂量水平的完整试验。从人类暴露资料推测，在有些限量试验中需要使

13、用更高的经口染毒剂量水平。对于其他的染毒途径，比如吸入或经皮染毒，常常可参考受试物的理化特性来确定可达到的最高染毒浓度(例如，经皮染毒时应不导致严重的局部毒性反应)。5.5 染毒5.5.1 受试物或赋形剂通常通过插管法经口染毒。如果使用其他染毒方式，应说明其合理性。应在每天的同一时间给予受试物。5.5.2 应根据最近的个体体重对每只动物进行染毒。但在娃振晚期要对剂量进行适当的调整。可利用现有的数据来选择相应的剂量以免造成过度的母体毒性反应。如果染毒动物出现了严重的、过度的毒性反应，则应将动物处以安乐死。如果有一些娃振动物出现了严重的毒性反应，则要终止该组试验。如果受试物是采用灌胃法给予，则要用

14、胃管或合适的插管一次给予受试物。应根据动物大小未确定一次的最大灌胃量。每次给液量不超过1mL/lOO g体重;对于水榕液，则最大体积可提高到2mL/lOO g 体重。如果采用玉米油做赋形剂，则最大体积不超过0.4mL/100 g体重。试验中，应通过调整榕液浓3 SN/T 2248-2009 度，以尽量减少所用受试物体积的差异，保证所有剂量水平的体积是相同的。5.6 观察每天至少观察一次动物，记录出现的临床症状，每次的观察时间应该相同。同时应考虑到染毒后预期效应的峰植时间。应记录动物的情况包括死亡、阙死状态、行为改变和所有明显毒性反应。5. 7 体重和食物消耗5.7.1 应在试验当天，如果交配的

15、动物是由外部饲养者所提供，则应在获得动物后3d内称重，染毒第一天，染毒期至少3d一次以及处死当天分别对动物进行称重。5.7.2 应每隔3d记录一次食物消耗量并与动物称重同时进行。5. 8 尸检5.8.1 应在分娩前一天将娃振动物处死。在处死期前出现流产或早产征兆的动物应被处死并进行彻底的肉眼观察。5.8.2 应对试验结束时或在试验过程中死亡的孕体进行肉眼观察其所有结构异常或病理改变。最好在不知道染毒组信息的前提下对剖宫产动物及其胎仔进行分析评价，以减少偏差。5.9 子宫容量的检查5.9.1 试验结束时或在动物死亡后应立即取出子宫并确定怀孕状况。看起来未娃振的子宫应进一步检查(例如啃齿类动物用硫

16、化镜，家兔则用Salewski染色或用其他可选择的合适方法)以确定未受孕状态。5.9.2 应称重包括子宫颈在内的娃振子宫。在试验过程中死亡的动物则不必进行娃振子宫称重。5.9.3 应确定娃振动物的黄体数。5.9.4 子宫内容物的检查包括胚胎数、死胎数和活胎数。应对再吸收程度进行描述以便估计孕体死亡的相对时间。5.10 胎仔检查5.10.1 记录每个月台仔的性别和体重。5.10.2 检查每个月台仔的外观变化。5.10.3 检查胎仔的骨髓和软组织变化(如变异和畸形或异常)。最好是对胎仔异常进行分类。如果进行了分类，就要对每一类别的标准进行详细的说明。应着重检查生殖道以便发现任何发育异常。5.10.

17、4 如果是啃齿类动物，应对每一窝大约一半的动物进行骨髓异常的检查。同时，可采用合适的连续切片法或仔细的大体解剖法对剩下的动物进行软组织异常的检查。5.10.5 如果是非啃齿类动物，例如家兔，就应对所有的胎仔进行软组织和骨髓异常的检查。应对这些胎仔的软组织异常进行仔细的解剖检查，包括对内部心脏结构的进一步评价，以评价这些胎仔的身体。一半的胎仔的头部应进行仔细的解剖，采用连续切片或其他同样灵敏的方法检查软组织是否出现异常(包括眼睛、脑、鼻道和舌头)。剩余的部分及其他胎仔应采用与啃齿类动物同样的方法进行骨髓异常的检查。6 数据和报告6.1 数据6.1.1 数据以表格的形式给出每只动物的数据并进行汇总

18、，表中应显示试验开始前每组和每代的动物数、试验过程中死亡或安乐死的动物数、死亡或安乐死时间、娃振动物数、出现中毒症状的动物数以及所观察到的中毒症状的描述，包括中毒开始时间、持续时间、所有毒性反应的严重程度，月台仔的类型以及所有其他各窝相关的胎仔数据。6.1.2 可采用适当的统计方法对数据结果进行数据处理分析，以每窝为单位，应采用普遍接受的统计方法。统计方法的选择是试验设计的一部分。表格中还应报告那些没有存活到规定处死日期的动物数据，这些数据应包括在相关联的组均值中。应根据个体情况来判断来源于该动物的数据的相关性，以此4 SN/T 2248-2009 为依据判断这些数据应该包括于组均植或从组均植

19、中剔除。6.2 结果评价胚胎发育毒性研究结果评价应以观察到的症状为主。评价应包括以下信息:6.2.1 母体和胎仔的试验结果，包括:评价动物染毒与发病率及其程度的相关性或不相关性;6.2.2 月台仔外观、软组织、骨髓异常等的分类标准;6.2.3 有必要的话，可以参考历史对照数据来进一步说明试验结果;6.2.4 计算所有百分率或指标时所用的动物数;6.2.5 充分的试验数据分析，应包括分析方法的相关信息以便评论家/统计学家对分析进行复评;6.2.6 如试验证明受试物元毒作用，应考虑进一步研究确定受试物的吸收和生物利用度。6.3 试验报告试验报告应包含以下内容。1) 受试物:物理性质及理化特性;识别

20、信息，包括己知的CAS号;纯度。2) 赋形剂(如果使用的话): 如果不是水，则说明选择该赋形剂的理由。3) 试验动物:使用的种类、品系;动物的数量和年龄;试验动物来源、饲养条件以及饲料等;试验开始时每只动物的体重。的试验条件:选择剂量水平的依据;详细的说明受试物的制备方法(用公式表示)，配置物的最终浓度，稳定性和均匀度;详细说明受试物的给药方法;受试物添加于饲料/饮用水的剂量(mg/(kg体重.d) ; 环境条件;具体的食物和水的重量。5) 试验结果:母体的毒性反应数据(按剂量)，至少包括下列信息:试验开始时的动物数，未死亡的动物数，娃振动物数和流产动物数，以及早产动物数;动物死亡日期;未能活

21、到预定处死期的动物数据也需报告，但这些数据不参与组间对比;观察到任何一只有反常临床症状的日期及其之后的病程;体重，体重的变化和娃振子宫的重量，包括通过体重来校正娃振子宫的重量;食物和水的消耗量;尸体检验，包括子宫重量;报告母体及其发育作用的未观察到有害作用的剂量水平(NOAEL)。的不同剂量组着床胎仔的发育，包括黄体数;着床数，存活数和存活率，死胎数和早期死胎(早期吸收)数;着床前、后流失的数量和百分比。5 SN/T 2248-2009 7) 不同剂量组活胎胎仔的发育，包括活月台数和活月台率;性别比率;1台仔体重，最好按性别或性别组合分组;月台仔外观、软组织、骨髓畸形及其他相关异常变化;分类的

22、标准;外观、软组织、骨髓异常的活胎和死胎总数及其百分比，以及各种畸形和相关异常变化的种类和发生率。的结果讨论。的结论。6.4 结果讨论胚胎发育毒性研究为了解多次口服一种物质对受孕动物的影响提供了一定的依据。研究结果的分析应与亚慢性的，生殖毒性，毒性动力学及其他研究相结合。由于本试验的重点观察一般毒性和发育毒性终点，因此，本试验的结果应考虑区别未出现一般毒性时的发育毒性以及那些只在造成母体动物毒性的剂量水平才出现的发育毒性。6 白CON-寸NNH军中华人民共和国出入境检验检疫行业标准胚胎发育毒性试验方法SN/T 2248-2009 化学晶沃中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷沃开本880X 1230 1/16 印张o.75 字数13千字2009年5月第一版2009年5月第一次印刷印数1-2000定价16.00元沃书号:155066.2-19747 SN/T 2248-2009