SN T 2246-2009 化学品.体外皮肤腐蚀.经皮电阻试验.pdf

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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准化学晶SN/T 2246-2009 体外皮肤腐蚀经皮电阻试验Chemicals-In vitro skin corrosion一Transcutaneous electrical resistance test (TER) 2009-02-20发布2009-09-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局SN/T 2246-2009 目Ij1=1 本标准等同采用经济合作与发展组织(OECD)化学品测试方法No.430(2004年04月刊体外皮肤腐蚀经皮电阻试验(英文版)。本标准在标准文本格式上按GB/Tl. 1-2000做了下列编辑性修改:增加了范围

2、部分;将OECD化学品测试方法No.430中有关方法的介绍、目的、范围等改为本标准的引言。本标准的附录A为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出井归口。本标准负责起草单位:中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。本标准参与起草单位:中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国安徽出入境检验检疫局、常州进出口工业及消费品安全检测中心。本标准主要起草人:刘君峰、张少岩、温劲松、江红星、陈小卫、陈明、王小峰。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。I SN/T 2246-2009 百|皮肤腐蚀是指皮肤在接触化学物质后产生的不可逆的皮肤组织损伤(如GHS中的定义)。本标准提供了一种元需

3、活体动物试验而对化学物质腐蚀性进行评估的试验方法。评估腐蚀性通常需要进行实验室动物试验。GB/T21604-2008考虑到试验中动物的痛苦和疼痛，在其附录中允许使用体外方法进行皮肤腐蚀性的测定，以避免动物的痛苦和疼痛。完全代替GB/T21604-2008的主要困难是缺少正式的、独立的、科学的体外试验方法。前验证研究可作为制定一种体内试验替代方法的第一步，随着这种研究的进行，已经开展了体外皮肤腐蚀性试验方法的验证试验研究。这些研究导致了本试验和人体皮肤模型试验的产生。研究表明采用大鼠的经皮电阻试验可以很好的区别己知的皮肤腐蚀性和皮肤非腐蚀性。本标准可以对腐蚀性化合物和混合物加以鉴定。如果结合其他

4、已有的信息，(如pH，结构活性关系，人类和(或)动物数据)通过证据权重分析，本标准还可以对非腐蚀性的化合物和混合物加以鉴定。本标准通常不能提供受试物皮肤剌激的信息，也不能对腐蚀性物质按照GHS规则进一步加以分类。为了全面评估皮肤在经皮一次染毒后的局部反应，建议按照GB/T21604-2008中的序贯试验策略或GHS中提供的相关方法进行试验。H 化学晶体外皮肤腐蚀经皮电阻试验1 范围本标准规定了化学晶体外皮肤腐蚀经皮电阻试验的原理、试验方法和程序。本标准适用于化学晶体外皮肤腐蚀经皮电阻试验。2 规范性引用文件SN/T 2246-2009 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注

5、日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 21604-2008 化学品急性皮肤刺激性/腐蚀性试验方法3 术语与定义下列术语和定义适用于本标准。3.1 体外皮肤腐蚀skin corrosion in vitro 皮肤接触化学物质4h后产生的不可逆的体外皮肤损伤，即表皮和真皮的可见性坏瘟。腐蚀作用的特征有溃房、出血、结捕，14d后皮肤因为发烫而变色，局部斑秃并结疤。应用组织病理学方法评价可疑的损伤。3.2 经皮电阻transcutane

6、ous electrical resistance (TER) 皮肤的电抗性，用电阻植(k)表示。运用惠斯通电桥检测皮肤的离子通过性，以评估皮肤的屏障功能是一种简单稳定的方法。4 原理4.1 将受试物涂敷到置于两层测试系统中的皮肤表面，保持24h。在该测试系统中，层与层之间的皮肤板可作为一个独立的功能层。皮肤板来自于安乐处死的鼠龄为28d30 d的大鼠。如果角质层或屏障功能遭到了破坏，则该受试物具有腐蚀性。角质层或屏障功能的破坏可通过测量得到的经皮电阻值(TER)低于规定的阔值水平而加以确认。由于大量化学物质的数据显示大多数大鼠经皮电阻值或高(一般10kD)，或低(一般3kD)，所以选择5k作

7、为临界植。4.2 一般来讲，元腐蚀性但有刺激性的物质或既元腐蚀性又元刺激性的物质不会出现TER低于该临界植。此外，其他皮肤或其他仪器可能会使该临界植发生改变，因此需要进一步验证。4.3 可在试验步骤中加入染色方法，以确认阳性结果(包括TER接近5k时)。如果角质层遭到了破坏，则会增加离子的通透性，从而可用染色方法进行验证。大鼠皮肤的TER试验可为GB/T 21604-2008中的家兔体内腐蚀性试验提供依据。应注意在皮肤腐蚀和皮肤剌激方面，家兔体内试验比人体皮肤斑贴试验更加保守。5 试验方法5.1 试验动物5.1.1 应选择大鼠作为试验动物，因为大鼠的皮肤对化学物质的敏感性在以前相同的试验中已经

8、得到1 SN/T 2246-2009 了证实。所用大鼠的鼠龄和品系(取皮肤样品时)是非常重要的，以确保在大鼠成年毛发开始生长之前，且毛囊处于休眠状态。5.1.2 试验采用鼠龄约22d的Wistar大鼠(或其他相近品种)，雌雄皆可。用剪刀仔细剪掉大鼠背部和侧腹部毛发，然后小心擦拭动物，同时把暴露的部位涂抹抗生素榕液(如含有链霉素、青霉素、氯霉素，配成有效浓度以抑制细菌生长)，3d4 d后用抗生素榕液再清洗动物一遍。如剪毛后角质层已经恢复正常，在第2次清洗后3d内，动物可用于试验。5.2 皮肤板的制备5.2.1 在大鼠的鼠龄为28d30 d时，将其处死。分离每只动物的背侧部皮肤，小心剥去皮下多余的

9、脂肪，制成直径约20mm的皮肤板。皮肤板在使用之前可贮藏起来，因为阳性对照和阴性对照的数据与从新鲜皮肤获得的试验数据相同。5.2.2 每个皮肤板放在聚四氟乙烯CPTFE)管的一端，保证外皮的表面与管相接触。在管底放一个合适大小的。形橡胶环以固定皮肤，除去多余的皮肤。管子和0形环的尺寸见图2，用凡士林小心的将0形环与PTFE管的末端密封。管子用支架固定并放在装有硫酸镜CMgS04)榕液的接收器腔内(如图1所示)。皮肤板必须浸没在MgS04榕液中。一只大鼠的皮肤可以制成(lO15)块皮肤板。2 1 弹簧线夹;2-PTFE管;3 弹性因形针;4 接收器腔;5 硫酸楼(154mmol); 6 橡胶叨形

10、环;7 硫酸楼(154mmol); 8 内电极(粗的h9 弹簧线夹;10 外电极(细的); 11 皮肤板的上皮;12 皮肤板的真皮。3 5 6 、 8 /9 10 11 图1鼠皮肤TER测试器具O.5mm 1mm / 弹簧线夹SN/T 2246-2009 4串一一一16mm一一-10mm 95mm 1mm -司81 mm 75mm 78mm 1mm 3mm 图2聚四氟乙烯(PTFE)管尺寸5.2.3 试验开始前，取每只动物的两块皮肤板进行质量控制试验。试验用皮肤板的电阻植必须大于10 k。如果电阻植小于10k，则由该只动物的皮肤制成的所有皮肤板都不能用于试验。5.3 受试物和对照物的染毒5.3

11、.1 试验时需同时有阳性对照和阴性对照以确保试验模型的可行性。所有的皮肤板应来自于同一只动物。建议用的阳性对照物和阴性对照物分别是10mol/L盐酸和蒸榴水。5.3.2 将150L受试物均匀地涂敷到PTFE管里的外皮表面。如果受试物是固体，则应把足够多的受试物均匀的铺到皮肤板上，以保证整个外皮的表面都被覆盖。向固体的表面加150L去离子水井轻摇管子。为了使受试物与皮肤充分接触，可将固体受试物加热到30C融化或软化，或者碾成粒状/粉状。5.3.3 每个染毒组和对照组要用3块皮肤板。受试物在20C23 C情况下染毒24h后，用30C水冲洗染毒部位。5.4 TER检测5.4.1 TER采用低压交流惠

12、斯通电桥来测量皮肤的阻抗性。一般交流电桥的工作电压是1V3 V , 弯型或呈直角型交流电的频率为50Hz 1 000 Hz，测量范围至少是o.1 k30 k。确认试验中所用的电桥在频率100Hz或1kHz时的感应系数、电容和电阻，应分别是2000 H、2000 fJ.F和2M。在TER腐蚀性评估试验中，测量结果以100Hz频率时的电阻以及一系列数直未表示。3 SN/T 2246-2009 5.4.2 在测量电阻之前，在表皮上涂敷足够多的70%乙醇，以减小表皮的表面张力。保持几秒后，将管中的乙醇除出，向管中表皮加3mL MgS04恪液(154mmol)使皮肤组织水合。皮肤板的每一面放一个电桥电极

13、以测量皮肤板的电阻(图1)。电极的直径和低于鲤鱼皮夹的电极长度见图2，PTFE管顶部附在内部电极上的鲤鱼皮夹是为了保证测量电阻时浸没在MgS04榕液中电极的长度不变。外部的电极固定在接收器腔的底部。PTFE管上的弹性回形针和底部的距离是保持不变的，因为这个距离能影响电阻的测量植。因此，内部电极和皮肤板之间的距离也应保持不变并且要尽量短。5.4.3 如果测量所得的电阻植大于20k，可能是由于有受试物残留在皮肤板上造成的。此时可以尝试进一步除去残留的受试物，例如可以用一带有子套的持指封住PTFE管，摇动约10s，弃去管内MgS04恪液井换上新的MgS04恪液再次测量电阻。5.4.4 试验设备的性能

14、以及试验程序可能会影响TER结果。5k的腐蚀阔直是依据本标准的试验方法，用特定的仪器得出的试验结果。如果试验条件改变或使用不同的仪器，则可以选择不同的阔植，因此有必要从用于验证试验的化学物质中或从与受试物类似的物质中，选择一系列的参照物质进行试验，以对试验方法和电阻阔植进行校正。一些推荐的合适化学物质参见表A.1。5.5 染色方法一些非腐蚀性的物质可以使电阻植降低到低于5k的临界植，因为这些物质可以让离子通过角质层，例如一些有机物和含有表面活性成分的化学物质(包括清洁剂、乳化剂和其他表面活性剂)能去除皮肤上的脂类物质，而使皮肤的离子通透性增加。因此如果TER植小于或在5k左右，皮肤又没有明显的

15、损伤，则需要用染料(硫丹明B)渗透的方法，以确定电阻植的减小是否是因为渗透性增加或皮肤腐蚀。如果是后者，则说明角质层受到破坏，染料(硫丹明B)将迅速渗透皮肤，将其下面的组织染色。这种染色方法对很多化学物质是稳定且不受后续的萃取试验影响。5.6 硫丹明B的染色及去除5.6.1 评估TER后，将管内MgS04榕液弃去，仔细检查皮肤是否有明显损伤。如果元明显损伤，则将150L10% (质量/体积)的硫丹明B染料水搭液涂敷到每块皮肤板的表皮并保持2h , 2 h后用温度至少为室温的自来水冲洗表皮10S，以除去多余和未结合的染料。5.6.2 从PTFE管中小心取出皮肤板，放入含有8mL去离子水的小瓶中(

16、如20mL的闪烁瓶儿轻轻振摇小瓶5mi日以洗去多余的未结合的染料。重复上述清洗步骤后，将皮肤板放入5mL含30%十二皖基磺(硫)酸铀(SDS)的水榕液中，60C培养过夜。5.6.3 培养后，取出皮肤板并将其弃去，将剩余的搭液在21C离心8min(相对离心力为每克175)。取1mL悬液用30%SDS稀释到原体积的5倍，测量搭液在565日m的光密度(OD)。5. 7 染料含量的计算通过OD植计算得每块皮肤板的硫丹明B染料的含量(565nm处硫丹明B的摩尔消光系数为8. 7X104，分子量为580)。用适当的标准曲线算出每块皮肤板的染料含量和平均含量。6 结果的解释6.1 如果阳性对照和阴性对照的电

17、阻直在表1要求的范围内，则可认为试验的结果是可信的。表1电阻抗范围对照组受试物电阻范围/k阳性10 mol/L盐酸o. 51 阴性蒸馆水1025 6.2 如果阳性对照和阴性对照的染料与皮肤板的结合量在表2要求的范围内，则可认为试验的结果是可信的。4 SN/T 2246-2009 表2染料量范围对照组阳性阴性受试物染料量范围/Cg/每板)110 mol/L盐酸40100 蒸馆水1535 6.3 符合以下任何一种情况，可认为受试物对皮肤是没有腐蚀性的。a) 受试物的TER的平均植大于5k。b) 如果受试物的平均TER植小于或等于5k，则必须满足:皮肤板没有明显损伤;每个皮肤板的平均染料结合量小于阳

18、性对照的染料结合量(见6.2)。c) 符合以下任何一种情况，可认为受试物对皮肤是有腐蚀性的。受试物的TER平均植小于或等于5k，且皮肤板有明显的损伤;受试物的TER平均植小于或等于5k，皮肤板没有明显损伤，但每个皮肤板的平均染料结合量大于或等于阳性对照的染料结合量(见6.2)。7 数据报告7.1 数据试验数据包括染毒组、阳性对照以及阴性对照的电阻植(k)和平均染料结合量(g/板)。将以上数据绘成表格(单个试验数据和平均植)，包括重复试验中的单个和平均数据。7.2 试验报告试验报告应包括以下内容。1) 受试物和对照物化学名称(如IUPAC或CAS名称)和CAS号;化学物质或制剂组分的含量(质量分

19、数)、纯度和物理性质;理化性质(如物理状态、pH、稳定性以及水恪性); 稳定性(如知道)。2) 试验动物品种和性别;用作给体的试验动物的鼠龄;动物的来源及饲养情况;皮肤准备的细节。3) 试验条件的结果试验仪器的标准曲线;染料结合试验的标准曲线;测量TER电阻试验的详细步骤;染料结合试验的详细步骤;对试验程序做任何修改的描述;所用的评估标准。每只动物和每个皮肤样板的TER植和染料结合量的数据表格;观察到的任何症状。5) 结果讨论。6) 结论。5 SN/T 2246-2009 A.l 推荐的化学物质见表A.l。1，2二氨基丙烧丙烯酸2叔丁基盼氢氧化饵(10%)硫酸(10%)辛酸4氨基1，2，4三瞠

20、丁子香盼苯乙基1臭四氯乙烯异十八(烧)酸4-(甲硫基)苯甲醒附录A(资料性附录)推荐的化学物质表A.l推荐的化学物质CS No. 78-90-0 CS No. 79-10-7 CS No. 88-18-6 CS No. 1310-58-3 CS No. 7664-93-9 CS No. 124-07-02 CS No. 5847-13-4 CS No. 97-53-0 CS No. 103-63-9 CS No. 127-18-4 CS No. 30399-9084-9 CS No. 3446-89-7 严重腐蚀严重腐蚀腐蚀腐蚀腐蚀腐蚀元腐蚀元腐蚀元腐蚀元腐蚀元腐蚀元腐蚀A.2 表A.l中所列

21、的大部分化合物来源于为了ECVAM国际一致性研究而设计的化合物列表。化合物的选择是基于以下标准:a) 相同数目的腐蚀性物质和非腐蚀性物质;b) 涵盖大多数化学品种类，并且商业可获得的化学物质;c) 包含了严重腐蚀性和轻微腐蚀性的化合物，以保证对腐蚀能力加以区别;d) 所选的化合物除了具有腐蚀性外，可以在实验室里正常使用，没有其他危害。6 白CON-寸NNH军中华人民共和国出入境检验检疫行业标准体外皮肤腐蚀经皮电阻试验SN/T 2246-2009 化学晶兴中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷兴印张o.75 字数14千字2009年5月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2009年5月第一版印数1-2000定价16.00元兴书号:155066.2-19745 SN/T 2246-2009