SN T 1673-2005 对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒聚合酶链反应操作规程.pdf
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1、中华人民共和国出入境检验检藏行业标准SN/T 1673-2005 对虾传染性皮下和造血器官坏死病聚合酶链反应操作规程Protocol of polymerase chain reaction (PCR) for infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus of shrimp 2005-09-30发布中华人民共和国国家质量监督检验检茂总局2006-05-01实施060509000067 目。嚣本标准的附录A为规商性附录,附录B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国深圳出入境检验
2、检疫局。本标准主要起草人:刘盔、史秀杰、何俊强、高隆英、杨锦舜、江育林。本标准为首次发布的出入境检验检疫行业标准。SN/T 1673-2005 I 1 范围对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒聚合酶链反应操作规程SN/T 1673一2005本标准规定了用聚合酶链反应技术检测对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒(lHHNV)的方法。本标准适用于对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的检测及鉴定。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新
3、版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。GB/丁6682-1992分析实验室用水规格和试验方法CeqvISO 3696 :1 987) 3 试剂和材料3.1 水:符合GB/T6682-1992中级水的规格。3.2 Taq酶:SU/L, -20C保存.不要反复冻融或握度剧烈变化。3.3 dNTP:含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmoL/L。3.4 引物:法度为40mol!L。其序列如下:77012F:5-ATC GGT GCA CTA CTC GGA-3 77353R: 5 -TCG TAC TGG CTG TTC ATC-3 3.5 元水乙醇:分析纯.使用前预冷到
4、20C。3.6 矿物油:要求无DNAgi母和RNA酶,用于无热盖的PCR扩增仪。3. 7 标准分子量:推荐使用pUC19DNA/M1 CHII ) ,各片段大小依次为501bp、404bp、331bp、242 bp、190bp、147bpo 4 器材和设备4.1 PCR扩增仪。4.2 电泳仪。4.3 微量移液器及吸头。4.4 紫外观察灯或凝胶成象仪。4.5 恒温培养箱。4.6 普通冰箱和超低温冰箱。4. 7 离心机和离心管。4.8 制冰机。5 取样和制样5.1 取样5. 1. 1 取活或濒死的对虾组织作为样品.死亡2h后不可采用。处理前要将样品放在冰上。如果2h SN/T 1673-2005
5、以后才能处理.应将样品保存在95%乙醇中.乙醇体积是样品体积的10倍以上.放置在室瘟下可保存1个月。5. 1. 2 仔虾或稚虾,取整只虾或虾头作样品。取虾头时,用灭菌剪刀和慑子去除眼睛、头胸甲、所有的胸部附器和头部以后的腰部。5. 1.3 成虾,取附肢或血淋巴作为样品。5. 1. 3. 1 取附股时,用灭菌剪刀剪去头部和腹部两侧的附肢,如触角、顿足、步足和游泳足,用小剪刀剪碎。5. 1. 3. 2 取血淋巴时,先用1mL针管吸取500L10%的拧穰酸盐溶液(见第A.1章),然后在针管前插上一个26号的针头。抓住对虾,使腹部朝上。将针头水平地插入第和第二对游泳足之间,并直插到最后对胸部附器的凹陷
6、处。缓慢吸取血淋巴。血淋巴样品需保存在-70C。5.2 制样15C条件下,在1.5 mL Eppendorf管中首先加入25mg100 mg组织或200L血淋巴拧攘酸盐混合液,加入150LCTAB洛液(见第A.2章),用匀浆器将样品匀浆成糊状。再加CTAB帘液到900Lt昆匀后置于25C作用2h, 6 IHHNV核酸的鉴定6. 1 核酸抽提首先加800L抽提液1(见第A.3章),充分?昆合至少30S: 12 000 r/min离心5min,取上层水相;再加700L抽提液2(见第A.4章),充分?昆合30S: 12 000 r/min离心5min,取上层水相;然后加入1.5倍体积的一20C元水乙
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