GB 15193.14-2003 致畸试验.pdf

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1、res 07. 100 c 53 中华人民共和国国家标准致畸试Teratogenicity study 2003-09-24发布中华人民共和国卫生部中国国家标准化管理委员会GB 15193.14-2003 代替GB15193. 14 1994 验2004-05-01实施发布89 GB 15193. 14-2003 前言本标准全文强制。本标准代替GB15193. 14 1994致畸试验。本标准与GB15193. 14 1994相比主要修改如下：一在“范围”中增加了受试物的具体内容z食品生产、加工、保藏、运输和销售过程中所涉及的可能对健康造成危害的化学、生物和物理因素，检验的对象包括食品添加剂（含

2、营养强化剂）、食品新资源及其成分、新资源食品、辐照食品、食品容器与包装材料、食品工具、设备、洗涤剂、消毒剂、农药残留、兽药残留、食品工业用微生物等；一在试剂中，增加了剥皮用的染色液茜素红溶液；一在“实验动物”中z去掉了有关小鼠和兔的内容g在“剂量及分组”中：增加了各剂量组设计的原则要求和急性毒性试验给予受试物最大剂量（最大使用浓度和最大灌胃容量）元死亡而求不出LO，时的剂量设计方法；一在“操作步骤”中孕鼠处死和检查中去掉有关小鼠和兔的内容；胎鼠骨标本的制备与检查增加剥皮后的制备方法；增加了“致畸试验应检查的内容和应记录内容气个表格。自本标准实施之日起，GB15193. 14 1994同时废止。

3、本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位：浙江医科大学、中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准主要起草人z黄幸绎、李悠慧、耿桂英。本标准于1994年首次发布，本次为第一次修订。90 GB 15193.14一2003致畸试验1 范围本标准规定了预测环境有害物质对人体产生胚胎毒性及致畸性试验方法。本标准适用于评价食品生产、加工、保藏、运输和销售过程中所涉及的可能对健康造成危害的化学、生物和物理因素的致畸作用，检验的对象包括食品添加剂（含营养强化剂）、食品新资源及其成分、新资源食品、辐照食品、食品容器与包装材料、食品工具、设备、洗涤剂、消毒剂、农药残留、兽药残留、食品工业用微生物

4、等。2 原理母体在孕期受到可通过胎盘屏障的某种有害物质作用，影响胚胎的器官分化与发育，导致结构和机能的缺陷，出现胎仔畸形。因此，在受孕动物的胚抬着床后，并己开始进入细胞及器官分化期时投与受试物，可检出该物质对胎仔的致畸作用。3 仪器与试剂3. 1 仪器与器材实验室常用设备、生物显微镜及体视显微镜、游标卡尺（百分尺）。3.2试剂实验用水为蒸馆水。3. 2. 1 甲腔、冰乙酸、2.4,6三硝基盼、氢氧化仰、甘油、水合氯醒、茜素红。3.2.2 茜素红贮备液菌素红饱和液，50%乙酸饱和液5.0 mL，甘油10.0mL,1%水合氯醒60.0 mL 混合，放入棕色瓶中。3.2.3 茜素红应用液2取贮备液3

5、mL 5 mL，用lg/100 mL 2 g/100 mL氮氧化饵液稀释至1 000 mL，存于棕色瓶中。3. 2. 4 茜素红溶液茜素红0.I g，氢氧化饵10g，蒸缩水1000 mL。剥皮用染色液）3.2.5 透明液A：甘油200ml，、氢氧化梆10g，蒸馆水790mL混合。3.2.6 透明液B：甘油与蒸馆水等量混合。3.2. 7 固定液（Bouins液），2,4,6三硝基盼（苦味酸饱和液）75份、甲醒20份、冰乙酸5份。4 实验动物常用试验动物为大鼠。选用健康、性成熟（90天100天）大鼠，雌性未交配过的大鼠80只90只，雄性减半。5 JllJ量及分组至少设3个试验组。高剂量原则上应使部

6、分孕鼠（和或胎鼠）出现毒性作用，如体重减轻等，低剂量组不应引起明显的毒性作用，各剂量组可采用1/4、1/16、1/64LDso，急性毒性试验给予动物受试物最大剂量（最大使用浓度和最大灌胃容量元死亡时以30天喂养试验的最大未观察到有害作用剂量为高剂量组，以下设2个剂量组，另设阴性对照组。对某种新的动物初次试验可设阳性对照组。每组至少12只孕鼠。常用阳性对照物有敌枯双（0.5 mg/kg体重1.0 mg/kg体重、五氯盼销（30mg/kg 体重）、阿斯匹林（250mg/kg体重300mg/kg体重）及维生素AC7 500 g/kg体重13000 g/kg体91 GB 15193. 14-2003

7、重）等。6 操作步骤6. 1 “受孕动物”的检查和给受试物时间性成熟雌、雄大鼠按1: 1 （或2: 1）同笼后，每日早晨观察阴栓（或阴道涂片），查出阴栓（或精子），认为该鼠己交配，当日作为“受孕”零天。如果5天内未交配，应更换雄鼠。检出的“孕鼠”随机分到各组，并称重和编号，在受孕的第7天16天，每天经口给予受试物（按0.5 mL/100 g体重1. o mL/100 g体重计。受孕的0、7、12、16、20天称体重，并计算给受试物的量。动物交配期室温在2025为宜，环境安静，必要时增加麦芽和蛋糕等营养物质。6.2 孕鼠处死和检查于大鼠虹振第20天直接断头处死。剖腹取出子宫称重，记录并检查吸收胎

8、、早死胎、晚死胎及活胎数。6. 3 活胎鼠检查逐记录胎仔性别、体重、体长，检查胎鼠外观有无异常。胎鼠体表检查项目见表I, 表1致畸试验自由鼠体表检查项目头部躯干部四肢元脑症胸骨裂多肢脑膨出胸部裂无肢头盖裂脊椎裂短肢脑和、水脊椎侧弯半肢小头症脊椎后弯多指颜面裂脐茄无指小眼症尿道下裂并指跟球突出无应门短指无耳症短尾、卷尾缺指小耳症无尾耳低位腹裂无顿症小领症下颗裂口唇裂6.4 胎鼠骨标本的制作与检查将每窝1/2的活胎（奇数或偶数）放入95%（体积分数）乙醇中固定2周3周，取出胎仔流水冲洗数分钟后放人1g/100 mL 2 g/100 mL的氢氧化饵溶液内（至少5倍于胎仔体积）8h 72 h，透明后放

9、入茜素红5应用液中染色6h 48 h，并轻摇1次天2次天，至头骨染红为宜。再放入透明液A中1天2天，放入透明液B中2天3天，待骨儒染红而软组织基本褪色，将标本放入小平皿中，用透射光源，在体视显微镜下作整体观察，然后逐步检查骨筋。测量头顶间骨及后头骨缺损情况，然后检查胸骨的数目，缺失或融合（掏骨为6个骨化不全时首先缺第5胸骨、次为缺第2H句骨）肋骨通常12对13对，常见畸形有融合肋、分叉肋、波状肋、短肋、多肋、缺肋、肋骨中断。脊柱发育和椎体数目（颈椎7个，胸椎12个13个，腰椎5个6个，底椎4个，尾椎3个5个）有无融合、纵裂等。最后检查四肢骨。将胎鼠去皮、去内脏及Bii肪后，放入茜素红溶液染色，

10、当天摇动玻璃瓶2次3次，待骨愣染成红色时为止。将胎鼠换入透明液A中1天2天，换人透明液B中2天3天。待胎鼠骨锵己染红，而软组织的紫红色基本褪去，可换置甘油中。（剥皮法）92 GB 15193. 14-2003 胎鼠骨髓检查项目见表2,表2致畸试验胎鼠骨髓检查项目枕骨骨化中心、发育不全脊柱骨数目、融合、纵裂、部分裂开、骨化中心数、发育不全、缩窄、脱离、形状骨盆弓数目、骨化中心数、形状异常、融合、裂开、缩窄、脱离四肢骨形状、数目腕骨骨化中心数掌骨形状趾骨形状肋骨数目、形状、融合、分卫、缺损、发育不全胸骨形状、完全缺损、胸骨节融合、裂开、形状异常、发育不全6.5 胎鼠内脏检查每窝的1/2活胎鼠放入B

11、ouins液中国定2周，作内脏检查。先用自来水冲去固定液，将鼠仰放在石蜡板上，剪去四肢和尾，用刀片在头部横切或纵切共5刀，再剖开胸腔和腹腔。按不同部位的断面观察器官的大小、形状和相对位置。正常切面见图l0 2 3 4 。1 5 固1大鼠头部正切面圈a) 经口从舌与两口角向枕部横切（切面1），可观察大脑、间脑、正脑、舌及领裂。b) 在眼前面作垂直纵切（切面2），可见鼻部。cl 从头部垂直通过眼球中央作纵切（切面3）。d) 沿头部最大横位处穿过脑作切面（切面4）。以上切面的目的可观察舌裂、双叉舌、领裂，眼球、鼻畸形、脑和脑室异常。e) 沿下顿水平通过颈部中部作横切面5，可观察气管、食管和延脑或脊髓

12、。以后自腹中线剪开胸、腹腔，依次检查心、肺、横脯膜、肝、胃、肠等脏器的大小、位置，查毕将其摘除，再检查肾脏、输尿管、膀眈、子宫或辜丸位置及发育情况。然后将肾脏切开，观察有无肾孟积水与扩大。试验胎鼠内脏检查项目见表3。表3致畸试验胎鼠内脏检查项目头部（脊髓）胸部腹部嗅球发育不全右位心肝分叶异常侧脑室扩张房中隔缺损肾上腺缺失第二脑室扩张室间隔缺损多囊肾无脑症主动脉弓马蹄肾元眼球症食道闭锁膀胧缺失小眼球症气管狭窄辜丸缺失角膜缺损元肺症卵巢缺失单眼球多肺症卵巢异位肺叶融合于富缺失隔茄于宫发育不全气管食管篓肾积水内脏异位肾缺失输卵管积水93 GB 15193.14-2003 6.6试验记录致畸试验记录内

13、容见表4,表4致畸试验记录内窑动物主配结圭试物期解剖检查时脑仔检查动物编号母体解剖所见体主幢查动物种品罩卵巢重量骨髓检查变配时周龄黄体数内脏检查确认查孕著库盘临库症壮胎盘重量进食进水量胎仔于宫内值置查试物E溶剂死胎盘剂量擂胎盘蜻样撞在胎仔重蜻样期限7戴据处理各种率的统计用X检验，孕鼠增重用方差分析或非参数统计，胎鼠身长、体重、窝平均活胎数、子宫连胎重量用t检验。胎鼠的数据以窝为单位进行统计。结果应能得出受试物是否有母体毒性和胚胎毒性、致畸性，最好能得出最小致畸剂量为比较不同有害物质的致畸强度，可计算致畸指数回一量一认民M二制队一和m自阳王莞iEF、雄一小LELt最azi切数指指害畸危致畸致l ( . . . . . . . . . . . . ( 2 ) 8 结果判定以致畸指数10以下为不致畸，10IOC为致睛，100以上为强致畸。为表示有害物质在食品中存在耐人体受害几率，可计算数畸危害指数，如指数大于300说明该物对人危害小，JOO300为中等，小于100为大。94