GB T 17999.9-1999 SPF鸡 间接免疫荧光试验.pdf

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1、C8/T 17999.9-1999 前言1电传染性贫血(CIA)，是近年来新发生的鸡病，国外均对其进行监测。CIA在我国鸡群中也有流行，因此，SPF鸡微生物学质量控制国家标准将其列入监测项目。目前国内已建立了SPF鸡监测CIA的通用方法间接免疫荧光试验。FA)，该方法已得到应用和验证，在此基础上制定本标准。SPF鸡微生物学质量控制国家系列标准，包括SPF鸡微生物学监测总则和9种SPF鸡微生物学检测方法。本标准为(SPF鸡间接免疫荧光试验。SPF鸡微生学检测方法还包括以下部分zGB/T 17999.1-1999 SPF鸡红细胞凝集抑制试验;GB/T 17999.2-1999 SPF鸡血清中和试验

2、;GB/T 17999.3-1999 SPF鸡血清平板凝集试验sGB/T 17999.中1999SPF鸡琼脂扩散试验;GB/T 17999.5- 1999 SPF鸡酶联免疫吸附试验;GB/T 17999.6-1999 SPF鸡胚敏感试验sGB/T 17999.7.-.1999 SPF鸡鸡臼荆沙门氏菌检验gGB/T 17999.8.-1999 SPF鸡试管凝集试验。本标准由中华人民共和国农业部、国家科学技术部提出。本标准由农业部畜牧兽医司归口。本标准起草单位北京市农林科学院畜牧兽医研究所、农业部实验动物研究中心。丰标准主要起草人:周文平、赵立红、陈德威。13 中华人民共和国国家标准SPF鸡间接免

3、疫荧光试验GB/T 17999. 9 - 1999 SPF chicken-Indirect immunofluorescent assay 1 范围本标准规定了间接免疫荧光试验试剂、材料、操作程序及结果判定等。本标准适用于SPF鸡感染鸡传染性贫血病毒(ChickenInfectious Anaemia Virus. CIA V )后的抗体监测。2 原理间接免疫荧光试验，以病毒感染细胞作抗原，与待检血清中的特异抗体结合，再与荧光色素标记的抗抗体结合，形成抗原抗体抗抗体复合物。荧光色素在紫外光或蓝紫光的作用F.激发出可见的荧光。因此出现荧光就说明标记物的存在，同时也反映了特异性抗体的存在。常采用

4、已知抗原及荧光色素标记的抗抗体检测相应的抗体。3 试验和器材3. 1 i式剂3. 1. 1 阴性、阳性血清。3.1.2 被检血清。3. 1. 3 PBS(O. 01 M、pH7.2)。3.1.4 FITC兔抗鸡1gG(按说明稀释使用)。3. 1. 5 缓冲甘泊。3. 2 材料3. 2. 1 显盒。3.2.2 培养箱。3. 2. 3 荧光显微镜。4 操作程序4. 1 感染细胞的制备用MDCC-MSB-l细胞制备鸡传染性贫血病毒感染细胞及未感染细胞(病毒培养技术参见有关文献)0 4.2 抗原片的制备4. 2. 1 收集培养48h的细胞培养物.1500 r/min离心10min，弃上清液，用PBS洗

5、涤细胞沉淀物二次，以少量PBS重悬细胞。4. 2. 2 取10川，细胞悬液(含细胞105个).滴加于镀膜印孔载破片各孔中，同时制备未感染细胞对照片。国家质量技术监督局1999-11-10批准2000 - 04 -01实施94 GB/T 17999. 9 -1999 4.2.3 滴好的抗原片用热风吹干，冷丙酣C4C)固定10min.保存于-10C.一周内使用。4. 3 间接荧光抗体染色4. 3. 1 取出抗原片室温放置10min待用。4. 3. 2 用PBS将灭活被检血清，阴性、阳性血清分别稀释成1 100、1 500两个稀释度，分别取10L滴加于抗原片各孔中。4. 3. 3 将加样抗原片置于湿盒内.37C孵育30mjn。4.3.4 用PBS浸洗三次，每次10mno 4. 3. 5 取20LFITC兔抗鸡IgG滴加于上述处理过的抗原片各孔中，孵育、洗涤同前。4. 3. 6 用缓冲甘泊封片，宣荧光显微镜下观察。5 结果判定CIAV感染细胞结构清晰，核内见清晰的荧光颗粒未感染细胞中元荧光颗粒).如j为阳性。95