GB T 4789.16-2003 食品卫生微生物学检验 常见产毒霉菌的鉴定.pdf
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1、GBj4789. 16-2003 108 前吉本标准对GB/T4789.16-1994食品卫生微生物学检验常见产毒霉菌的鉴定进行修订。本标准与GB/T4789. 16-1994相比主要修改如下2一一按照GB/T1. 1-2000对标准文本的格式和文字进行修改。一一修改并规范原标准中的设备和材料气本标准自实施之日起,GB/T4789. 16-1994同时废止.本标准的附录A、附录B、附录C和附录D为资料性附录。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口.本标准起草单位z中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准主要起草人z刘兴介、罗雪云、李风琴、李玉伟。本标准于1984年首次发布,1994年第一次
2、修订,本次为第二次修订。1 范围食品卫生微生物学检验常见产毒霉菌的鉴定本标准规定了食品中常见的常见产毒霉菌的鉴定方法。本标准适用于曲霉属、青霉属、镰刀菌属及其他菌属的产毒霉菌鉴定.2 规范性引用文件GB/T 4789. 16-2003 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准.GB/T 4789.28-2003 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3 设备和材料3. 1 冰箱,OC
3、4C。3.2 恒温培养箱,25C28C。3.3 显微镜:lOXlOOX.3.4 目镜测微计。3.5 物镜测微计。3.6 元菌接种罩。3. 7 放大镜。3.8 滴瓶。3.9 接种勾针.3. 10 分离针。3. 11 载玻片。3. 12 盖玻片,18mmX18mm。3. 13 灭菌刀子。4 培养基和试剂4. 1 乳酸-苯盼液z按GB/T4789.28-2003中3.24规定。4.2 察氏培养基:按GB/T4789. 28-2003中4.77规定。4.3 马铃薯葡萄糖琼脂培养基:按GB/T4789. 28-2003中4.78规定。4.4 马铃薯琼脂培养基=按GB/T4789.28-2003中4.79
4、规定。4.5 玉米粉琼脂培养基z按GB/T4789. 28-2003中4.81规定。109 GB/T 4789. 16-2003 5 操作步骤5. 1 菌落的观察g为了培养完整的巨大菌落以供观察记录,可将纯培养物点植于平板上。方法是z将平板倒转,向上接种一点或三点,每菌接种两个平板,倒置于250C280C温箱中进行培养.当刚长出小菌落时,取出一个平皿,以元茵操作,用小刀将菌落连同培养基切下1cmX2 cm的小块,置菌落一侧,继续培养,于5d14d进行观察。此法代替小培养法,可直接观察子实体着生状态。5.2 斜面观察=将霉菌纯培养物划线接种(曲霉、青霉)或点种(链刀菌或其他菌)于斜面,培养5d
5、14d,观察菌落形态,同时还可以将菌种管置显微镜下用低倍镜直接观察抱子的形态和排列。5.3 制片g取载玻片加乳酸苯盼液一漓,用接种针钩取一小块霉菌培养物,置乳酸-苯盼液中,用两支分离针将培养物撕开成小块,切忌涂抹,以免破坏霉菌结构;然后加盖玻片,如有气泡,可在酒精灯上加热排除。1fjtJ片时最好是在接种罩内操作,以防抱子飞扬。5.4 镜检观察霉菌的菌丝和袍子的形态和特征、抱子的排列等,并做详细记录。5.5 报告z根据菌落形态及镜检结果,参照以下各种霉菌的形态描述及检索表,确定菌种名称。6 各种霉菌的形态特征6. 1 曲霉属CAspergllus) 本属的产毒霉菌主要包括黄曲霉、寄生曲霉、杂色曲
6、霉、构巢曲霉和棕曲霉。这些霉菌的代谢产物为黄曲霉毒素、杂色曲霉素和棕曲霉毒素。曲霉属的颜色多样,而且比较稳定。营养菌丝体由具横隔的分枝菌丝构成,无色或有明亮的颜色,一部分埋伏型,一部分气生望。分生子缸子梗大都无横隔,光滑、粗糙或有麻点。梗的顶端膨大形成棍棒形、椭圆形、半球形或球形的顶囊,在顶囊上生出一层或二层小梗,双层时下面一层为梗基,每个梗基上再着生两个或几个小梗。从每个小梗的顶端相继生出一串分生抱子。由顶囊、小梗以及分生抱子链构成一个头状体的结构,称为分生抱子头。分生抱子头有各种不同颜色和形状,如球形、放射形、棍棒形或直柱形等。曲霉属只少数种形成有性阶段,产生封闭式的闭囊壳。某些种产生菌核
7、或菌核结构。少数种可产生不同形状的壳细胞。6. 1. 1 黄曲霉(A.flavus) 属于黄曲霉群。在察氏琼脂培养基上菌落生长较快,10d14 d直径3cm4 cm或4cm-7cm. 最初带黄色,然后变为黄绿色,老后颜色变暗,平坦或有放射状沟纹,反面无色或带褐色。在低倍显微镜下观察可见分生抱子头疏松放射状,继变为疏松柱状。分生袍子梗多从基质生出,长度一般小于1mm。有些菌丝产生带褐色的菌核。制片镜检观察可见分生袍子梗极粗糙,直径10m20mo顶囊烧瓶形或近球形.直径10m65囚,一般多为25m45m。全部顶囊着生小梗,小梗单层、双层或单、双层同时生在一个顶囊上g梗基(6mlOm)X (4m5.
8、 5m) ,小梗(6.5m10m) X (3m5m)。分生抱子球形、近球形或稍作洋梨形,3m6m,粗糙(见图1)。黄曲霉产生黄曲霉毒素,该毒素能引起动物急性中毒死亡,如长期食用含微量黄曲霉毒素的食物,能引起肝癌。110 G8/T 4789. 16-2003 m u O FiHL I 2 i、主二3 1 双层小梗的分生于包子头$2一一单层小梗的分生抱于头;3 分生抱于梗的基部(足细胞); 4 双层小梗的细微结构;5 分生袍子。回1黄曲霉6. 1. 2 寄生曲霉(A.parasiticus) 亦属于黄曲霉群,8d10 d菌落2.5 cm-.4 cm,平坦或带放射状沟纹,幼时带黄色,老后呈暗绿色,反
9、面奶油色至淡褐色。低倍显微镜下观察见分生抱子头疏松放射状,直径400m500m,分生抱子梗长短不一,一般为200m1000m,制片镜检观察,见分生袍子梗光滑或粗糙,近顶囊处宽10m12m,顶囊近球形或烧瓶形或样状,直径20m35m,小梗单层,(7m9m)X (3m 4m) ,排列紧密。分生于包子球形,极粗糙,具小刺,直径3.5m5.5m,未报道过产生菌核。寄生曲霉的菌株都能产生黄曲霉毒素。6. 1. 3 杂色曲霉(A.versicolor) 属于杂色曲霉群。在察氏琼脂培养基上菌落生长局限,14d直径2cm-3 cm,绒状、絮状或两者同时存在。颜色变化相当广泛,不同菌系可能局部淡绿、灰绿、浅黄甚
10、至粉红色;反面近于元色至黄橙色或玫瑰色,有的菌落有无色至紫红色的液漓。分生子包子头疏松放射状,大小为100m125m。分生于包子梗长度可达500m700m,宽12m16m,光滑,元色或略带黄色。顶囊半椭圆形至半球形,上半部或四分之三部位上着生小梗。小梗双层,梗基(5.5m8m)X3m,小梗(5m7.5m)X (2m2. 5m) ,分生抱子球形,粗糙,直径2.5m3m或稍大。有些菌系产生球形的壳细胞见图2)。杂色曲霉产生杂色曲霉素,该毒素引起肝和肾的损害,并能引起肝癌。111 GB/T 4789. 16-2003 。PI r10 m & I 1 。dh川1 分生抱于头$2一一分生抱于p3一一壳细
11、胞回回2杂色幽霉6. 1. 4 构巢曲霉(A.nidulans) 属于构巢曲霉群。菌落生长较快.14d直径5cm.6 cm,绒状,绿色,有的菌系由于产生较多的闭囊壳而显现黄褐色,反面紫红色。分生于包子头短柱形,(40m80m)X (25m40m)。分生于包子梗极短,常弯曲,一般75m100m,近顶囊处直径3.5m5m,褐色,壁光滑。顶囊半球形,直径8m10m,小梗双层,梗基(5m6m)X (2m3m) ,小梗(5m6m)X (2m 2. 5m)。分生袍子球形,粗糙,直径3m3.5m,闭囊壳球形,暗紫红色,直径135m150m,子囊抱子双凸镜形,紫红色,约5mX4m,有两个鸡冠状突起。闭囊壳外面
12、包围着一层壳细胞,淡黄色,球形,壁厚,直径约25m(见图3)。构巢曲霉产生杂色曲霉素。1 。10m 2 l 分生于包于头52 足细胞;3 壳细胞.图3构巢曲霉112 GB/T 4789. 16-2003 6. 1.5 蜻曲霉(A.ochraceus) 属于筛曲霉群。在察氏琼脂培养基上菌落生长稍局限,10d14d直径3cm,., 4 cm,褐色或浅黄色,基质中菌丝元色或具有不同程度的黄色或紫色,反面带黄褐色或绿褐色。分生抱子头幼时球形,老后分裂成2个3个柱状分叉。分生子包子梗长达1mm,-._,l. 5 mm,直径10m-14m,带黄色,极粗糙,有明显的麻点。顶囊球形,直径30m50m或更大。小
13、梗双层,自顶囊全部表面密集着生。分生于包子球形至近球形,直径2.5m3m或更大,常略粗糙。有些菌系产生较多的菌核,初期为白色,老后淡紫色,球形、卵形至柱形,直径达1mm(见图的。据曲霉产生精曲霉毒素,该毒素是一种强的肾脏毒和肝脏毒。1一一分生殖于头$2 分生抱于梗。6.2 青霉属(Penicillium)10m 2 固4蒲曲霉本属产毒霉菌,主要包括黄绿青霉、桔青霉、圆弧青霉、展开青霉、纯绿青霉、红青霉、产紫青霉、冰岛青霉和皱裙青霉等。这些霉菌的代谢产物为黄绿青霉素、桔青霉素、圆弧偶氮酸、展青霉素、红青霉素、黄天精、环氯素和皱榴青霉素。青霉属的营养菌丝体呈无色、淡色或鲜明的颜色,具横隔,或为埋伏
14、型或部分埋伏型部分气生型。气生菌丝密毡状、松絮状或部分结成菌丝索。分生抱子梗由埋伏型或气生型菌丝生出,稍垂直于该菌丝(除个别种外,不象曲霉那样生有足细胞),单独直立或作某种程度的集合乃至密集为一定的菌丝束,具横隔,光滑或粗糙。其先端生有扫帚状的分枝轮,称为帚状枝。帚状校是由单轮或两次到多次分校系统构成,对称或不对称,最后一级分枝即产生抱子的细胞,称为小梗。着生小梗的细胞叫梗基,支持梗基的细胞称为副枝。小梗用断离法产生分生抱子,形成不分校的链,分生抱子呈球形、椭圆形或短柱形,光滑或粗糙,大部分生长时呈蓝绿色,有时呈无色或呈别种淡色,但决不呈污黑色。少数种产生闭囊壳,或结构疏松柔软,较快地形成子囊
15、和子囊抱子,或质地坚硬如菌核状由中央向外缓慢地成熟。还有少数菌种产生菌核。6.2. 1 黄绿青霉(P.citreoviride) ,异名=毒青霉(P.toxicarum) 属单轮青霉组,斜卧青霉系。菌落生长局限,10d12d直径2cm,._, 3 cm,表面皱槽,有的中央凸起或凹陷,淡黄灰色,仅微具绿色,表面绒状或稍现絮状,营养菌丝细,带黄色。渗出液很少或没有,有时呈现拧橡黄色,略带霉味。反面及培养基呈现亮黄色。分生于包子梗自紧贴于基质表面的菌丝生出,一般(50m-lOOm)XCl.6m2. 2m) ,壁光滑。帚状枝大部为单轮,偶尔有作一、二次分校者。分生GB/T 4789. 16-2003
16、于包子链约略平行或稍散开。小梗为紧密的一簇.8个12个,大多(9m12m)X (2. 2m 2.8m)。分生于包子呈球形,2.2m2. 8m,壁薄,光滑或近于光滑,成链时具明显的抱隔(见图5)。黄绿青霉的代谢产物为黄绿青霉素,该毒素是一种很强的神经毒。1 gzcN -20 r 00已10m 1 帚状枝$2 分生抱于.图5黄绿青霉6.2.2 桔青霉(P.citrinum) 属于不对称青霉组,绒状青霉亚组,桔青霉系。菌落生长局限,10d14d直径2cm.-.2. 5 cm,有放射状沟纹,大多数菌系为绒状,另一些则呈现絮状,艾绿色。反面黄色至橙色,培养基颜色相仿或带粉红色,渗出液呈淡黄色。低倍显微镜
17、下分生抱子链为明确的分散柱状。分生抱子梗大多自基质生出,也有自菌落中央气生菌丝生出者,一般(50m200m)X(2.2m3m),壁光滑,一般不分枝。帚状枝由3个4个轮生而略散开的梗基构成,(12m20m) X (2.2m3m) ,每个梗基上簇生6个10个略密集而平行的小梗,(8mllm)X(2m2.8m)。分生抱子呈球形或近球形,直径2.2m3. 2m,光滑或近于光滑(见图6)。桔青霉产生桔青霉素,该毒素是一种强的肾脏毒。2 10 J-l m I 帚状枝$2 分生抱子。图6桔青霉6.2.3 圃弧青霉(P.cyclopium) 属于不对称青霉组,束状青霉亚组,圆弧青霉系。菌落生长较快,12d14
18、d直径4.5cm.S cm , 114 GB/T 4789. 16-2003 略带放射状皱纹,老后或显现环纹,暗蓝绿色,在生长期有宽1mm2 mm之白色边缘,质地绒状或粉粒状,但在较幼区域为显著束状,渗出液元或较多,色淡。反面无色或初期带黄色,继变为橙褐色。帚状校不对称,紧密,常具三层分枝,约50m60m.上生纠缠的分生于包子链。分生抱子梗大多(200m400m) X(3m3. 5m).典型地粗糙,但也有一些菌系近于光滑。副校(15m30m)X (2. 5m 3. 5m)。梗基(10m15m)X (2. 5m3.3m)。小梗4个8个轮生.(7mlOm)X (2. 2m 2.8m)。分生于包子大
19、多近球形.3m4m.光滑或略现粗糙(见图7)。圆弧青霉的代谢产物为圆弧偶氮酸,该毒素是一种神经毒。 m H O o -20 J.l m 因76.2.4 岛青霉(P.islandicum) 属于双轮对称青霉组,绳状青霉系。在察氏琼脂培养基上菌落生长局限,致密丛状,呈橙色、红色及暗绿色的混合体。反面浊橙色至红色,变至浊褐色。低倍显微镜下分生抱子链纠缠链状,分生抱子梗短,长50m75m.由气生菌丝或菌丝索上生出,壁光滑,帚状枝典型对称双轮生,稍短,小梗有些骤然变尖.(7m9m)X2m,分生于包子椭圆形,光滑.(3m3.5m) X (2. 5m3m)(见图8)。岛青霉产生黄天精和环氯素,该毒素均为肝脏
20、毒,能引起动物的肝损害,并能引起肝癌。圆弧青霉的帚状校及分生于自子链。001 帚状枝$2 分生抱于。固B岛膏.6.2.5 展开青霉(P.pa阳lum)异名z尊麻青霉(P.urticae) 属于不对称青霉组,柬状青霉亚组。在察氏琼脂培养基上,菌落生长局限.12d14 d直径2cm 2.5 cm,大多有放射状沟纹,边缘陡峭,中央稍凸起,表面呈现粒状,有些在边缘有明显的茵丝束,有的则呈现絮状,厚密。灰绿色至亮灰色。有的菌系产生近于元色的渗出液,气味不明显。反面暗黄色渐变为橙褐色乃至红褐色,稍扩散于培养基中。帚状枝疏松散开,可具3层4层分枝,其大小和复杂程度差别很大,一般40m50m.极限20m80阻
21、。分生于包子链略散开,长达50m100m。分生于包子梗一部分单生,一部分集结成束,多弯曲,壁光滑,一般(400m520m)X (3m4m)。副校GB/T 4789. 16-2003 散开,大多05m-20m)X(3m-3.5m).梗基较短,大多为(7m-9m)X(3m-3.5m)。小梗短,(4. 5m-6.5m) X (2m-2.5m) ,8个-10个密集一簇。分生泡子椭圆形,后变为近球形,长轴2.5m-3m,光滑(见图的。展开青霉产生展青霉素,该毒素能引起动物中毒死亡。皮下反复注射展青霉素,可引起注射部位的肉瘤。展青霉素也是一种神经毒。2011 m EE伽如扣俨俨m 抖。圈9展开青霉的帚状枝
22、及分!t袍子链6.2.6 纯绿青霉(P.viridica阳m)属于不对称青霉组,束状青霉亚组,纯绿青霉系。菌落生长局限,12d-14 d直径2.5 cm-3. 5 cm,亮黄绿色,有时有狭的带蓝绿色的带紧邻于白色边缘的内侧,极厚,通常为显著的粒状,老年时变为浊褐色.反面纯淡黄色至纯褐色。帚状校正常的有三层分枝,常常副校及梗基生在同一高度。分生于包子梗大部分直径3.5m-4.5m,但有时达6白,粗糙至很粗糙。小梗(7m-l0m)X(2. 5m-3m)。分生于包子椭圆形,达4.5mX3.3m,或亚球形,直径约3.5m,略粗糙,成纠缠链状或不确定的直柱状(见图10)。纯绿青霉产生精曲霉毒素和桔青霉素
23、。l 帚状枝32 分生抱子。国10纯绿青霉116 GB/T 4789. 16-2003 6.2.7 量在槽青霉(P.rugulosum) 属于对称二轮青霉组,皱福青霉系。菌落生长局限,12d14 d直径1.0 cmL 5 cm,几为绒毛状至一定的絮状,浓绿继变为稍灰色。反面最初元色,慢慢变为深色至橙色的点状及块状,在斜面培养时尤以边缘为然。帚状技大部分典型,但也常常不规则。梗基长短不一。分生袍子梗光滑,直径2. 5m3m, Ij、梗(10m12m)X(1.8m2m)。分生袍子呈椭圆形,显著地粗糙,(3m3.5m) X (2.5m3m),生成纠缠链状(见图11), 皱榴青霉产生皱禧青霉素,该毒素
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