DB21 T 4330-2025 夏洛来羊体外胚胎生产及手术法胚胎移植技术规范.pdf

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1、ICS65.150CCS B 5021辽宁省地方标准DB21/T 43302025夏洛来羊体外胚胎生产及手术法胚胎移植技术规范Technical specification for in vitro embryo production and surgicalembryo transfer of Charlotte sheep2025-11-30 发布2025-12-30 实施辽宁省市场监督管理局发 布DB21/T 43302025I前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别

2、专利的责任。本文件由辽宁省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：锦州医科大学、朝阳市朝牧种畜场有限公司、辽宁省农业发展服务中心。本文件主要起草人：王春强、张贺春、韩迪、张喆、马巍、李纯锦、张楚依、田俊英、王恩辉、李宁、杨友成。本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈，我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街2号），联系电话：024-23447862。起草单位通讯地址：锦州医科大学（辽宁省锦州市凌河区松坡路三段40号），联系电话：（0416）3675111，3675222。

3、DB21/T 433020251夏洛来羊体外胚胎生产及手术法胚胎移植技术规范1 范围本文件规定了夏洛来羊供体羊选择与饲养管理、供体羊激素处理、卵母细胞采集、卵母细胞体外成熟及鉴定、体外受精、胚胎体外培养及鉴定、胚胎冷冻保存及解冻、受体羊选择及饲养管理、手术法胚胎移植和妊娠诊断的体外胚胎生产及手术法胚胎移植主要环节的技术要求。本文件适用于夏洛来羊体外胚胎生产及移植。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期的对应版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 5458 液氮生物容器

4、NY/T 1571 羊胚胎移植技术规程NY/T 1900 畜禽细胞与胚胎冷冻保种技术规范3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1体外胚胎生产 in vitro embryo production指对供体母羊进行激素处理和活体采集卵母细胞，或从屠宰场摘取卵巢后采集卵母细胞，在体外条件下对卵母细胞进行成熟培养、体外受精、胚胎培养，生产可用于胚胎移植的胚胎的过程。3.2羊胚胎移植技术 ovine embryo transfer technology通过手术法收集的良种母羊体内早期胚胎，或通过体外受精及其他方式获得的体外早期胚胎，移植到相同生理状态的同种受体母羊体内，使之继续发育成新个体的生物

5、技术。4 缩略语下列缩略语适用于本文件。CIDR：孕激素阴道栓（Controlled Internal Drug Releasing device）FSH：促卵泡生成素（follicle-stimulating hormone）PG：前列腺素（Prostaglandin)COCs：卵丘-卵母细胞复合体（Cumulus-oocyte complex)PMSG：孕马血清促性腺激素（Pregnant Mare Serum Gonadotropin）IVM：卵母细胞体外成熟培养液(In Vitro Maturation)DB21/T 433020252IVF：体外受精液(In Vitro Fertil

6、ization)IVC：体外培养液(In Vitro Culture)5 供体羊与受体羊的选择与饲养管理5.1 选择条件按照NY/T 1571对供体羊和受体羊进行选择。5.2 饲养管理按照NY/T 1571对供体羊和受体羊进行饲养管理。6 供体羊激素处理6.1 药品所需药品按NY/T 1571执行。6.2 激素处理方式在发情周期的任意一天早6：00放CIDR，记为第0 d；第7 d更换CIDR。第12 d14 d，采用逐渐递减法连续3d肌注FSH，每天早6：00和晚18：00各1次。3 d注射总量为360 mg，第1 d每次注射80 mg，第2 d每次注射60 mg、第3 d每次注射40 mg

7、在第一次注射FSH的同时肌注PG 2 mL，在第6次注射FSH的同时取出CIDR。7 卵母细胞采集7.1 活体采卵供体羊的保定、麻醉、消毒、手术过程按NY/T 1571执行。供体羊腹腔打开后，食指和中指从刀口进入，在骨盆腔、耻骨前沿触摸子宫角，并将子宫、卵巢引出刀口外。用吸有抽卵液（配制方式详见附录A）的10 mL注射器抽取突出卵巢表面的卵泡，边缘用纱布止血。将卵泡液体置于60 mm平皿内，在体视镜下捡出所有卵母细胞。卵丘细胞2层以上，胞质均匀为合格的COCs。手术后供体的子宫角需喷涂普鲁卡因青霉素凝胶，大腿部需注射土霉素进行消炎处理，同时肌肉注射4 mg6 mg的PGF2，消除卵巢上黄体。

8、7.2 离体采卵取屠宰 1 h 内的羊卵巢，放入含 100 IU/mL 青链霉素双抗的 37 生理盐水中，运回实验室。用剪刀将卵巢周围的结缔组织去除干净，38.5 生理盐水清洗卵巢 3 次，并浸泡于生理盐水中。用吸水纸吸附卵巢上的生理盐水，再用吸有抽卵液的注射器抽吸突出卵巢表面的卵泡，将卵泡液体置于 60 mm平皿内，在体视镜下捡出所有卵母细胞。8 卵母细胞体外成熟及成熟鉴定DB21/T 433020253将捡出的卵母细胞用抽卵液洗涤3次，再用IVM液（配制方式详见附录A）洗涤3次，按50枚/孔80枚/孔的密度，放入0.6 mL/孔IVM液并覆盖0.3 mL矿物油的四孔板内。38.5、5%CO

9、2、饱和湿度的37 二氧化碳培养箱中培养24 h。卵母细胞成熟标准为：第一极体形态正常、胞质均匀、颗粒均匀、卵周隙内无杂质以及透明带形态正常。9 体外受精9.1 鲜精体外受精9.1.1 对种公羊的选择按照NY/T 1571对种公羊进行选择。9.1.2 采精采精前对种公羊外生殖器清洗消毒。采集的精液外观及气味正常，精子活力大于0.7，畸形率小于15%，可进行后续操作。精液用稀释液按1:1稀释，放入含有30 温水的250 mL烧杯中，置于4 冰箱中平衡1.5 h，待用。9.1.3 鲜精上浮取0.2 mL平衡好的鲜精加入装有2 mL IVF液（输卵管缓冲液SOF）的圆底试管底部，将试管倾斜45，置于

10、二氧化碳培养箱内，待精子上浮30min后，取上层约1 mL液体于1.5 mL离心管内，用1500 r/min转速离心4 min两次，弃去上清，留约0.1 mL，轻轻混匀，制成精子混悬液，备用。9.1.4 体外受精用含量 0.1%的透明质酸酶对成熟后的卵母细胞进行处理，除去部分卵丘细胞，并用 IVF 液洗涤 3次后置于装有 0.5 mL IVF 液的四孔培养皿内。取 30 L 精子混悬液至四孔培养皿内，与卵母细胞共同孵育。将精子和卵母细胞共同孵育 18 h24 h 的受精卵用 IVC 液洗涤 3 次，去除粘附于卵母细胞表面的精子。9.2 冻精体外受精从符合 GB/T 5458 的液氮中迅速取出冻

11、精细管，投入 37 水浴锅解冻 15 s20 s，取出细管并用纱布擦拭，剪掉细管的两端，将精液推入 1.5 mL 的离心管内，用移液枪将精液移入含 1 mL IVF 液的试管底部，上浮 30 min 后，按照操作步骤 9.1.3 和 9.1.4 进行体外受精。10 胚胎体外培养及鉴定10.1 胚胎体外培养将受精卵置于 IVC 四孔培养皿中培养至 48 h，显微镜下统计卵裂率，按照 NY/T 1571 对胚胎进行等级鉴定，其中 1、2 级胚胎可用于胚胎移植,发育至囊胚的胚胎可用于胚胎冷冻。早期胚胎发育模式图见附录 B。10.2 胚胎质量鉴定DB21/T 433020254采集的胚胎用事先在培养箱

12、预热的平皿接收，写好编号，置于 26 的恒温板上。用实体显微镜在平皿中分检可用的胚胎放入含有胚胎保持液的平皿中，盖好平皿盖后待处理。早期胚胎发育模式图见附录 B。按照 NY/T 1571 对胚胎进行等级鉴定，其中 1、2 级胚胎可用于胚胎移植或冷冻保存。11 胚胎冷冻保存与解冻11.1 胚胎的冷冻保存按照 NY/T 1900 对胚胎进行冷冻保存。11.2 冷冻胚胎的解冻从液氮中取出装有胚胎的细管，空气中停留 10 s15 s 后投入 35 水浴锅中，轻轻晃动细管约15 s，待细管中有气泡产生，剪去细管塞，将胚胎移入 0.2 mol/L0.5 mol/L 蔗糖磷酸盐缓冲液中 3 min5 min

13、将胚胎移至保存液中洗涤 3 次4 次后对胚胎进行鉴定，2 级以上胚胎可进行移植。12 手术法胚胎移植12.1 受体羊同期发情处理在发情周期的任意一天早 8:00 放入 CIDR，同时注射 PGF2 2 mL，记为第 0 d，第 6 d 早 8:00 去栓的同时肌注 300 IU PMSG，此后三天观察发情。12.2 受体羊胚胎移植受体母羊移植部位的消毒方法与采卵时的消毒方法相同。用腹腔镜观察受体母羊卵巢上的黄体情况，对有 1 cm2 cm 且圆润饱满黄体的受体进行手术法子宫角移植。可移植 1 枚 1 级胚胎，或 2 枚 2 级胚胎。消炎处理按 7.1 执行。12.3 胚胎发育期与受体移植时间

14、的对应关系胚胎发育期与受体移植时间的对应关系见附录 C，移植时机应根据受体时间选择对应时期胚胎进行移植。13 妊娠诊断连续观察 2 个3 个情期后受体无发情表现再用 B 超检测，或直接在 45 d60 d 通过 B 超的方法检查一次，结合母羊表现可判定是否受孕。DB21/T 433020255附 录 A（资料性）体外胚胎生产培养液配制A.1 抽卵液的配制在TCM199-hepes液的基础上，添加2%FBS、0.7 mg/mL肝素钠和100 IU/mL双抗。A.2 卵母细胞体外成熟培养液(IVM)的配制在TCM199液的基础上，添加10%FBS、0.05 IU/mL的FSH、0.05 IU/mL

15、的LH、1 g/mL的雌二醇、24.2g/mL的丙酮酸钠、0.1 mM半胱氨酸、10 ng/mL的EGF和100 IU/mL的双抗。A.3 体外受精液(IVF)的配制输卵管缓冲液SOF液体的成分:6.29 mg/mL氯化钠、0.534 mg/mL氯化钾、0.162 mg/mL磷酸二氢钾、0.6 L/mL乳酸钠、0.089 mg/mL硫酸镁、2.1 mg/mL碳酸氢钠、0.0357 mg/mL丙酮酸钠、0.299 mg/mL二水氯化钙、1%NEAA、2%BAA、100 IU/mL双抗。体外受精液成分：在SOF液的基础上，添加20%FBS、6 IU/mL肝素钠和100 IU/mL庆大霉素。A.4

16、体外培养液(IVC)的配制体外培养液成分：在SOF液的基础上，添加3 mg/mL牛血清白蛋白。DB21/T 433020256附 录 B（资料性）早期胚胎发育模式图早期胚胎发育模式见图 B.1。a)1 细胞b)2-细胞c)4-细胞d)8-细胞e)16-细胞f)早期桑葚期g)紧缩桑葚胚胎h)早期胚胎i)囊胚j)扩张囊胚k)孵化囊胚l)扩张的孵化囊胚标引序号说明：a)未受精卵或 1-细胞胚胎，为 1.0 日龄胚胎；b)2-细胞胚胎，为 1.02.0 日龄胚胎；c)4-细胞胚胎，为 2.02.5 日龄胚胎；d)8-细胞胚胎，为 2.53.0 日龄胚胎；e)16-细胞胚胎，为 3.04.0 日龄胚胎；

17、f)早期桑葚胚，为 4.05.0 日龄胚胎；g)紧缩桑葚胚，为 5.05.5 日龄胚胎；h)早期囊胚，为 5.56.0 日龄胚胎；i)囊胚，为 6.06.5 日龄胚胎；j)扩张囊胚，为 6.07.0 日龄胚胎；k)孵化囊胚，为 7.58.0 日龄胚胎；l)扩张的孵化囊胚，为 9.010.0 日龄胚胎。图 B.1 早期胚胎发育模式图DB21/T 433020257附 录 C(资料性)胚胎发育期与受体移植时间的对应关系胚胎发育期与受体移植时间的对应关系见表 C.1。表 C.1 胚胎发育期与受体移植时间的对应关系胚胎发育期受体移植时间(发情之时为 0 d)桑葚胚（M）5.5 d0.5 d早期胚胎(EB)6.0 d0.5 d囊胚(B)6.5 d0.5 d扩张囊胚(EXB)7.5 d0.5 d