DB61 T 1520-2021 实时荧光定量PCR分析仪性能评价规范.pdf

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1、ICS11.040.55CCS C 44DB61陕西省地方标准DB 61/T 15202021实时荧光定量 PCR 分析仪性能评价规范Evaluation specification for performance of real-time fluorescent quantitativePolymerase-Chain-Reaction analyzer2021-12-17 发布2022-01-17 实施陕西省市场监督管理局发 布DB61/T 15202021I目 次前言.II1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14技术要求.25试验方法.36评价规则.13参考文献.15DB61/T

2、 15202021II前 言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由陕西省市场监督管理局提出并归口。本文件起草单位：西北国家计量测试中心办公室、西安天隆科技有限公司、陕西国华现代测控技术有限公司、陕西省疾病预防控制中心、陕西科仪阳光检测技术服务有限公司、陕西省计量科学研究院、西安计量技术研究院、西安市质量与标准化研究院、北京林电伟业电子技术有限公司、陕西省建筑科学研究院。本文件主要起草人：陈瑛、彭年才、胡畅、陈琛、田真、余鹏博、李天来、张莉、龚大江、李姣姣、杨嘉泉、李征、张仁、杨悦、李元沉、马腾、武文昀、李磊本文件由西北国家计量测

3、试中心负责解释。本文件首次发布。联系信息如下：单位：西北国家计量测试中心办公室地址：陕西省西安市咸宁西路30号电话：029-83218679邮编：710004DB61/T 152020211实时荧光定量 PCR 分析仪性能评价规范1范围本文件规定了实时荧光定量PCR分析仪（以下简称RT-PCR仪）的术语定义、技术要求、试验方法和评价规则。本文件适用于RT-PCR仪性能的检测和评价。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 4793.

4、1测量、控制和实验室用电气设备的安全要求 第1部分：通用要求GB 4793.6测量、控制和实验室用电气设备的安全要求 第6部分：实验室用材料加热设备的特殊要求GB 4793.9测量、控制和实验室用电气设备的安全要求 第9部分：实验室用分析和其他目的自动和半自动设备的特殊要求GB/T 14710医用电器环境要求及试验方法GB/T 18268.1测量、控制和实验室用的电设备 电磁兼容性要求 第1部分：通用要求GB/T 18268.26测量、控制和实验室用的电设备 电磁兼容性要求 第26部分：特殊要求 体外诊断(IVD)医疗设备JJF 1101环境试验设备温度、湿度参数校准规范YY 0648测量、控

5、制和实验室用电气设备的安全要求 第2-101部分：体外诊断（IVD）医用设备的专用要求YY/T 1173聚合酶链反应分析仪3术语和定义JJF 1101、YY/T 1173界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1实时荧光定量PCR仪real-time PCR systems由实时荧光检测系统，温控系统，数据分析系统组成，用来监测PCR反应过程的实时荧光随循环数的变化，并通过数据分析对检测样本进行定量分析。3.2控温模块temperature control module通过感温元件、导热材料、恒温块等完成RT-PCR仪加热、制冷功能的物理组件。DB61/T 1520202123.3热盖hot

6、 lid具有加热功能，防止蒸发的水汽在RT-PCR仪管盖上凝结的装置。3.4荧光干扰fluorescence crosstalkRT-PCR仪对某一荧光通道进行荧光检测时，相邻或相近荧光通道也会检测到一定的荧光强度。4技术要求4.1温度4.1.1升温速率升温速率技术要求见表1。表 1升温速率技术要求序号项目要求1平均升温速率5090，1.5/s2最大瞬时升温速率5090，2.5/s4.1.2降温速率降温速率技术要求见表2。表 2降温速率技术要求序号项目要求1平均降温速率9050，1.5/s2最大瞬时降温速率9050，2.0/s4.1.3控温模块温度示值误差控温模块O点温度测得值与设定值差值的绝

7、对值不大于0.5。4.1.4控温模块温度波动度控温模块O点温度波动度不大于0.3。4.1.5温度均匀度控温模块各检测孔间温度差值不大于1.0。4.1.6温度持续时间相对误差温度持续时间与设定温度持续时间的相对误差不大于5%。4.1.7热盖温度示值误差热盖温度测得值与设定值差值的绝对值不大于3.0。DB61/T 1520202134.1.8热盖温度波动度热盖温度波动度不大于3.0。4.2荧光强度4.2.1荧光强度重复性荧光强度的重复性不大于1.5%。4.2.2荧光检测精密度用高、中、低三种浓度的荧光染料进行试验，每种浓度下检测结果的精密度不大于5%。4.2.3荧光线性对系列稀释荧光染料物质的样本

8、（至少5个梯度）进行检测，各浓度荧光测得值与稀释比例的线性回归系数r不小于0.990。4.3样本检测4.3.1样本检测重复性对高、中、低浓度核酸样本或有证标准物质进行检测，重复性应不大于3%。4.3.2样本线性对系列稀释梯度浓度的样本（至少5个梯度）进行检测，各浓度Ct值与浓度对数值的线性回归系数r绝对值应不小于0.990。4.3.3不同通道荧光干扰进行RT-PCR试验结果分析，其他通道荧光涨幅不高于目标通道试验结果的自动分析阈值。4.4电气安全电气安全应符合GB 4793.1、GB 4793.6、GB 4793.9及YY 0648的要求。4.5环境应符合GB/T 14710的要求。4.6电磁

9、兼容应符合GB/T 18268.1及GB/T 18268.26的要求。5试验方法5.1温度5.1.1检测点的选择控温模块温度检测点按表3进行选择。热盖温度检测点应选择在热盖中心点。DB61/T 152020214表 3控温模块温度检测点选择要求内容要求检测点数量6 个，且不少于总检测孔数的 12%。特征要求可以区分多控温模块的，检测点应包含每个控温模块内距离其中心点最近的孔位（O 点）及最远的孔位（F 点）。无法区分多控温模块的，检测点应包括离 PCR 管放置区中心最近的孔位（O 点）和最远的孔位（F点）。分布要求整个控温模块的检测点尽可能保持均匀分布，不包括 O 点和 F 点。5.1.2温度

10、控制程序的设定温度控制程序按表4要求进行设定。表 4RT-PCR 仪温度控制标准程序表阶段步骤控温模块热盖温度设定温度范围设定温度持续时间循环数设定温度范围1（500.5）1.5min6 次(1056)2（900.5）1(555)2(725)3(955)5.1.3测量设备的选择温度测量设备可选用多通道温度显示仪表或多路温度测量装置，传感器宜选用高精度热敏电阻或四线制铂电阻温度计，温度测量设备温度传感器的数量应满足检测布点要求，能与RT-PCR仪孔板接触良好，各通道应采用同种型号规格的温度传感器。温度测量设备的技术指标应满足以下要求：a)测量范围：（0120）；b)分辨力：0.01；c)最大允许

11、误差：0.17；d)温度采样频率：2Hz。5.1.4升温速率5.1.4.1平均升温速率按5.1.2表4设定温控程序，记录“阶段”的升温过程中各检测孔的温度数据。在500.5内取任意温度点，记为，在900.5内取任意温度点，记为，从到达的时间记为，DB61/T 152020215按公式（1）计算每个检测孔平均升温速率。除第1个循环外连续检测n5个循环，每个控温模块的每个循环下平均升温速率均应符合表1的要求。.(1)式中：在某一循环的升温过程中，待测模块内第i个检测孔的平均升温速率，/s；在某一循环的升温过程中，待测模块内第i个检测孔的在500.5内任意温度点，；在某一循环的升温过程中，待测模块内

12、第i个检测孔的在900.5内任意温度点，；某一循环的升温过程中，待测模块内第i个检测孔从Tu1,i到达Tu2,i的时间，s。5.1.4.2最大瞬时升温速率按5.1.2表4设定温控程序，记录扫描温度从500.5升至900.5过程中，各检测孔相邻两个温度采集点在一个温度采集时间间隔内的温度变化，取其中最大值，按照公式(2)计算最大瞬时升温速率。除第1个循环外连续检测n5个循环，每个控温模块的每个循环下最大瞬时升温速率均应符合表1的要求。.(2)式中：在某一循环的升温过程中，待测模块内所有检测孔最大瞬时升温速率，/s；在某一循环的升温过程中，待测模块内所有检测孔的采集数据中，相邻两个温度采集点温度变

13、化最大值，；温度采集时间间隔，s。5.1.5降温速率5.1.5.1平均降温速率按5.1.2表4设定温控程序，记录“阶段”的降温过程中各检测孔的温度数据。在900.5内取任意温度点，记为，在500.5内取任意温度点，记为，从到达的时间记为，DB61/T 152020216按公式（3）计算各检测孔的平均降温速率。除第1个循环外连续检测n5个循环，每个控温模块的每个循环下平均降温速率均应符合表2的要求。.(3)式中：在某一循环的降温过程中，待测模块内第i个检测孔的平均降温速率，/s；在某一循环的降温过程中，待测模块内第i个检测孔的在900.5内任意温度点，；在某一循环的降温过程中，待测模块内第i个检

14、测孔的在500.5内任意温度点，；某一循环的降温过程中，待测模块内第i个检测孔从TD1，i到达TD2，i的时间，s。5.1.5.2最大瞬时降温速率按5.1.2表4设定温控程序，记录扫描温度从900.5降至500.5过程中，各检测孔相邻两个温度采集点在一个温度采集时间间隔内的温度变化（应不大于0.5s并尽可能足够小），取其中最大值()，按照公式(4)计算最大瞬时降温速率。除第1个循环外连续检测n5个循环，每个控温模块的每个循环下最大瞬时降温速率均应符合表2的要求。.(4)式中：在某一循环的升温过程中，待测模块内所有检测孔最大瞬时升温速率，/s；在某一循环的升温过程中，待测模块内所有检测孔的采集数

15、据中，相邻两个温度采集点温度变化最大值，；温度采集时间间隔，s。5.1.6控温模块温度示值误差按5.1.2表4设定温控程序，采集“阶段”要求的温度测试数据。每个温控模块每个循环的中心点检测孔（O点）温度分别到达(555)、(725)、(955)三个温度设定值后，记录20s60s内O点的所有温度测得值为有效温度测量值。按公式（5）计算其平均值，按公式（6）计算模块温度示值误差。除第1个循环外连续检测n5个循环，每个检测点的温度示值误差均应符合4.1.3的要求。DB61/T 152020217.(5)式中：在某一循环的某个设定温度下，待测模块O点的有效温度测量值的平均值，；在某一循环的某个设定温度

16、下，待测模块O点的有效温度测量值，m在某一循环的某个设定温度下，待测模块O点的有效温度测量值的总数。.(6)式中：在某一循环的某个设定温度下，某一温度设定值的温度示值误差，；在某一循环的某个设定温度下，待测模块O点的有效温度测量值的平均值，；在某一循环的某个设定温度下，待测模块O点的温度设定值，。1.1.1控温模块温度波动度按5.1.2表4设定温控程序，采集“阶段”要求的温度测试数据。每个温控模块每个循环的中心点检测孔（O点）温度分别到达(555)、(725)、(955)三个温度设定值后，记录20s60s内O点的所有温度测得值为有效温度测量值。按公式（7）计算模块温度波动度，除第1个循环外连续

17、检测n5个循环，每个控温模块的每个循环下每个温度设定值的温度波动度均应符合4.1.4的要求。.(7)式中：在某一循环的某个温度下，待测模块的温度波动度，冠以“”号，；在某一循环的某个设定温度下，待测模块O点的有效温度测量值的最大值，；在某一循环的某个设定温度下，待测模块O点的有效温度测量值的最小值，。5.1.7温度均匀度按5.1.2表4设定温控程序，采集“阶段”要求的温度测试数据。每个温控模块每个循环的每个检测孔温度分别到达(555)、(725)、(955)三个温度设定值后，记录第70s时所有检测点的读数为有效温度测量值。按公式（8）计算模块温度均匀度T，除第1个循环外连续检测n5个循环，每个

18、循环下每个温度设定值的温度均匀度均应符合4.1.5的要求。DB61/T 152020218.(8)式中：在某一循环的某个设定温度下，待检仪器的温度均匀性，；在某一循环的某个设定温度下，所有检测点的有效温度测量值的最大值，；在某一循环的某个设定温度下，所有检测点的有效温度测量值的最小值，。1.1.2温度持续时间相对误差按5.1.2表4设定温控程序，采集“阶段，步骤3”实时温度测试数据。以950.5为计时参考点，自每个温控模块每次循环中心点检测孔（O点）显示温度首次到达计时参考点时开始计时，至末次到达计时参考点时结束，记录时间为t作为恒温时间实测值ti。除第1个循环外连续检测n5个循环，按公式（9

19、）计算连续n个循环恒温时间实测值的平均值，按公式（10）计算相对误差，每个控温模块的温度持续时间相对误差均应符合4.1.6的要求。.(9)式中：待测模块连续n个循环恒温时间实测值的平均值，s；待测模块的某一循环下恒温时间实测值，s；n循环次数。.(10)式中：某一模块温度持续时间相对误差，s；连续n个循环恒温时间实测值的平均值，s；设定温度持续时间，s。1.1.3热盖温度示值误差按5.1.2表4设定温控程序，采集热盖温度测试点的实时温度测试数据。当热盖温度到达（1056）设定值后，记录2min10min内所有温度测得值为有效温度测量值。按公式（11）计算其均值。按公式（12）计算热盖温度示值误

20、差，其结果应符合4.1.7的要求。DB61/T 152020219.(11)式中：热盖温度达到设定值，有效温度测量值的平均值，；热盖温度达到设定值，有效温度测量值，m热盖温度达到设定值，有效温度测量值总数。.(12)式中：热盖温度示值误差，；热盖温度达到设定值，有效温度测量值的平均值，；热盖的温度设定值，。5.1.8热盖温度波动度按5.1.2表4设定温控程序，采集热盖温度测试点的实时温度测试数据。当热盖温度到达（1056）设定值后，记录2min10min内所有温度测得值的最大值和最小值，按公式（13）计算热盖温度波动度，其结果应符合4.1.8的要求。.(13)式中：热盖温度波动度，冠以“”号，

21、；热盖温度达到设定值，2min10min内所有温度测得值的最大值，；热盖温度达到设定值，2min10min内所有温度测得值的最小值，。5.2荧光强度5.2.1荧光强度重复性在仪器测定范围内，随机选取n(nl)个通道，每个通道随机选取1个检测孔，分别配置各通道高、中、低三种浓度的校准荧光染料，每种检测10次，光学系统收集目标通道的数据。按公式（14）计算荧光强度重复性。每个通道高、中、低三种浓度的荧光强度重复性均应符合4.2.1的要求。DB61/T 1520202110.(14)式中：某一通道的某一浓度下荧光强度重复性；某一通道的某一浓度下10次荧光重复测量结果的实验标准差；某一通道的某一浓度下

22、10次荧光重复测量结果的平均值；某一通道的某一浓度下荧光测量结果。5.2.2荧光检测精密度在仪器测定范围内，随机选取n(nl)个通道，每个通道随机选取m(m10)个检测孔（孔位数不足10个时，则进行全部孔位检测），分别配置各通道高、中、低三种浓度的校准荧光染料，每种浓度检测1次，光学系统收集目标通道的数据。按公式（15）计算荧光强度的变异系数作为荧光强度精密度，每个通道高、中、低三种浓度的荧光强度精密度均应符合4.2.2的要求。.(15)式中：荧光强度精密度；实验标准差。某一通道的某一浓度下第i个检测孔的荧光测量结果；某一通道的某一浓度下所有检测孔荧光测量结果的平均值；m选取的检测孔总数。5.

23、2.3荧光线性在仪器测定范围内，随机选取n(nl)个通道，将已知浓度的校准荧光染料溶液梯度稀释后（至少稀释5个梯度，m5）进行检测，每一浓度梯度平行测试3孔，光学系统收集目标通道的数据。按公式（16）计算某一通道某一梯度下3个检测孔荧光测量结果的平均值，按公式（17）某一通道所有梯度下所有检测孔荧光测量结果的平均值，按公式（18）计算线性相关系数r作为荧光线性结果，每个通道荧光线性结果均应符合4.2.3的要求。DB61/T 1520202111.(16)式中：某一通道某一梯度下3个检测孔荧光测量结果的平均值；某一通道某一梯度下第j个检测孔荧光测量结果。.(17)式中：某一通道所有梯度下所有检测

24、孔荧光测量结果的平均值；某一通道某一梯度下3个检测孔荧光测量结果的平均值；m稀释梯度数.(18)式中：某一通道荧光线性相关系数；某一通道某一浓度梯度下校准荧光染料标准值；某一通道所有浓度梯度下校准荧光染料标准值的平均值；某一通道某一梯度下3个检测孔荧光测量结果的平均值；某一通道所有梯度下所有检测孔荧光测量结果的平均值；m稀释梯度数5.3样本检测5.3.1检测样本的技术要求检测样本可采用已知浓度的核酸样本或有证标准物质。若使用有证标准物质（如：质粒DNA标准物质、核糖核酸标准物质），则其技术要求如下：a)拷贝数109copies/L；DB61/T 1520202112b)相对扩展不确定度 Ure

25、l6%，k=2。5.3.2样本检测重复性在仪器测定范围内，随机选取n(nl)个通道，将已知浓度核酸样本或有证标准物质等倍数地稀释为高、中、低三种浓度的待检样本，选用生产企业规定的试剂盒进行检测。对每个通道下的每种浓度待检样本，随机选取10个检测孔同时进行检测。按公式（19）计算某一通道在某浓度下样本检测重复性。每个通道高，中，低三种浓度的样本检测重复性均应符合4.3.1的要求。.(19)式中：某一通道在某浓度下样本检测重复性；某一通道的某一浓度下核酸样本或有证标准物质10次重复测量结果的实验标准差。某一通道的某一浓度下核酸样本或有证标准物质10次重复测量结果的平均值。某一通道的某一浓度下的第i

26、次核酸样本测量结果；5.3.3样本线性在仪器测定范围内，随机选取n(nl)个通道，将已知浓度核酸样本或有证标准物质按照10倍或5倍梯度稀释后（至少稀释5个梯度，m5）进行检测。对每个通道下的每种浓度待检样本，随机地选取3个检测孔同时进行检测。按公式（20）计算某一通道某一梯度下3个检测孔核酸样本或有证标准物质测量结果的平均值，按公式（21）计算某一通道所有梯度下所有检测孔核酸样本或有证标准物质测量结果的平均值，按公式（22）计算线性相关系数作为样本线性，每个通道的样本线性均应符合4.3.2的要求。.(20)式中：某一通道某一梯度下3个检测孔核酸样本或有证标准物质测量结果的平均值；某一通道某一梯

27、度下第i个检测孔核酸样本或有证标准物质测量结果。.(21)DB61/T 1520202113式中：某一通道所有梯度下所有检测孔核酸样本或有证标准物质测量结果的平均值；某一通道某一梯度下3个检测孔核酸样本或有证标准物质测量结果的平均值。.(22)式中：某一通道样本线性；某一通道某一梯度下核酸样本或有证标准物质标准值；某一通道所有梯度下核酸样本或有证标准物质标准值的平均值；某一通道某一梯度下3个检测孔核酸样本或有证标准物质测量结果的平均值；某一通道所有梯度下所有检测孔核酸样本或有证标准物质测量结果的平均值；m稀释梯度数5.3.4不同通道荧光干扰5.3.4.1随机选取 n(n2)个通道进行检测，选用

28、生产企业规定的试剂盒进行不同通道荧光干扰试验。收集所有通道的数据，结果应符合 4.3.3 的要求。5.3.4.2软件具有通道荧光串扰修正功能或颜色补偿功能的，在修正后或补偿后，结果应符合 4.3.3的要求。5.4电气安全按GB 4793.1、GB 4793.6、GB 4793.9和YY 0648规定的方法进行测试，结果应符合4.4的要求。5.5环境按GB/T 14710.11规定的方法进行测试，结果应符合4.5的要求。5.6电磁兼容按GB/T 18268.1及GB/T 18268.26规定的方法进行测试，结果应符合4.6的要求。6评价规则6.1的型式评价应符合 4 的全部技术要求，出厂评价应符合 4.14.5 全部技术要求。使用中评价应符合 4.14.3 全部技术要求。DB61/T 1520202114DB61/T 1520202115参 考 文 献1YYT 11732010 聚合酶链反应分析仪2JJF 15272015 聚合酶链反应分析仪校准规范3JJF(浙)11242016 基因扩增仪（聚合酶链反应分析仪）校准规范4JJF 18212020 聚合酶链反应分析仪温度校准装置校准规范_