DB37 T 4674—2023 猪塞尼卡谷病毒的检测 重组酶恒温扩增法.pdf

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1、 ICS 65.020.30 CCS B 41 37 山东省地方标准 DB37/T 46742023 猪塞尼卡谷病毒的检测 重组酶恒温扩增法 2023-11-14 发布2023-12-14 实施山东省市场监督管理局发 布 DB37/T 46742023 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本文件由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。DB37/T 46742023 1 猪塞尼卡谷病毒的检测 重组酶恒温扩增法 1 范

2、围 本文件描述了猪塞尼卡谷病毒（Seneca Valley virus,SVV）的重组酶恒温核酸扩增检测（Recombinase Polymerase Amplification）方法。本文件适用于猪塞尼卡谷病毒的快速检测、诊断、检疫、监测和流行病学调查。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输

3、技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 试剂或材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。所用液体试剂均需使用无DNA/RNase的容器进行分装。RNA 提取试剂盒：市售。4.1 重组酶恒温扩增试剂盒：市售。4.2 水：GB/T 6682，一级。4.3 PBS 溶液：pH 值 7.4。4.4 称取磷酸二氢钾(KH2PO4)0.27 g、磷酸氢二钠(Na2HPO4)1.42 g、氯化钠(NaCl)8 g、氯化钾(KCl)0.2 g，加灭菌水约800 mL充分搅拌溶解，加入浓盐酸调pH值至7.4，定容至1 000 mL。0.1%DEPC 水。4.5 1 000 mL水中加1 mL

4、DEPC，放在1 000 mL容量瓶中静置4 h后备用。重组酶恒温扩增检测引物：按附录 A 规定。4.6 阳性、阴性对照。4.7 阳性对照：带有 SVV 序列 DNA 全长的质粒。阴性对照：已知 SVV 阴性样本的 DNA。5 仪器设备 荧光定量 PCR 仪：配有配套反应管（板）。支持多通道检测。5.1 分析天平：精度为 1 mg。5.2 DB37/T 46742023 2 高速冷冻离心机：转速不低于 13 000 g/min。5.3 冰箱：2 8 和-20 以下。5.4 酸度计。5.5 电热恒温水槽：室温至 100。温度精度0.5。5.6 涡旋振荡器。5.7 微量移液器：10 L、20 L、

5、100 L、1 000 L。5.8 离心管：1.5 mL。无 DNase 和 RNase。5.9 6 试验步骤 样品 6.1 符合GB 19489和NY/T 541中关于实验室生物安全和兽医诊断样品的采集和保存的要求。6.1.1 样品采集 6.1.1.1 棉拭子样品 无菌采集猪口鼻棉拭子。6.1.1.2 组织样品 按照NY/T 541兽医诊断样品采集、在运抵检测地点前的样品保存与运输技术规范确定的规程，无菌采集病死猪的淋巴结、脾、胸腺、肠粘膜和肺等组织样品。6.1.2 样品的保存 2 8 不超过24 h，-20 以下不超过3个月，-70 以下不超过10年。6.1.3 样品处理 6.1.3.1

6、棉拭子样品处理方法 口鼻拭子管6 000 g/min震荡45 s，取200 L进行RNA提取。6.1.3.2 淋巴结、脾、胸腺等组织样品处理 取0.05 g（0.01 g）组织块放入盛有500 LPBS缓冲液的研磨管中，6 000 g/min震荡研磨45 s，制成约10%的组织匀浆液，5 000 g/min离心5 min，取200 L上清液进行RNA提取。RNA 的提取 6.2 按RNA提取试剂盒说明书提取样品和对照组的RNA。提取的RNA应立即检测，否则应置于-70 冻存。重组酶恒温核酸扩增 6.3 6.3.1 扩增试剂准备 设50 L重组酶恒温核酸扩增反应体系，扩增反应液体系见表1。按重组

7、酶恒温扩增试剂盒说明书配制体系并完成相关操作。DB37/T 46742023 3 表1 扩增反应液体系 组分 用量 L 1%DEPC水 25.4 10 M SVV-F 2 10 M SVV-R 2 10 M SVV-Probe 0.6 模板 5 恒温扩增试剂 15 6.3.2 恒温扩增反应 选择检测模式：FAM。将加样后的PCR管放入荧光PCR检测仪内，做好标记。恒温扩增反应条件按照表2设置。表2 恒温扩增反应条件 反应温度 39 循环数 40 信号采集 每30 s 反应时间 20 min 结果判定 6.4 6.4.1 阴性、阳性结果判定 结果判定见表3。表3 结果判定 序号 通道 Ct 值

8、结果判断 1 FAM UNDET 或 40 样本低于检测限，报告为阴性 2 FAM 37 判定为阳性 3 FAM 3740 复检一次，如仍为 3740，则判定为阴性 6.4.2 质控标准 6.4.2.1 阴性对照无 Ct 值或大于 37，并且无扩增曲线。6.4.2.2 阳性对照的 Ct 值应小于等于 37，并出现典型的扩增曲线。6.4.2.3 如阴性和阳性对照不满足以上条件，此次实验视为无效。6.4.2.4 结果参考图谱见附录 B。DB37/T 46742023 4 A A 附录A （规范性）重组酶恒温核酸扩增引物 重组酶恒温核酸扩增引物见表A.1。表A.1 重组酶恒温核酸扩增引物 引物 序列 SVV-F 5-TTCTAAAGCGCAAATTCGTCCAAAACAACGACG-3 SVV-R 5-CCAGAATGTTGAGCCAACATAGAAACAGATTGC-3 SVV-Probe 5-TAAAGAATTTGGAAGCCATGCTCTCCTACTTC(FAM-T)(THF)(BHQ1-T)AGGAACACTACTCG-C3 spacer-3 DB37/T 46742023 5 B B 附录B （资料性）结果判定 阴性对照和阳性对照扩增曲线见图B.1。图B.1 阴性对照和阳性对照 样本检测曲线见图B.2。图B.2 样品检测