DB21 T 3646-2022 斑海豹肠道微生物菌群健康评估规范.pdf

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1、ICS 65.150 CCS B 41 DB21辽宁省地方标准 DB21/T 36462022 斑海豹肠道微生物菌群健康评估规范 Specification for health assessment of the gut microbiota of Phoca largha2022-10-30 发布2022-11-30 实施辽宁省市场监督管理局 发 布 DB21/T 36462022 I 前 言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由辽宁省农业农村厅提出并归

2、口。本文件起草单位：辽宁省海洋水产科学研究院、大连市现代农业生产发展服务中心、大连圣亚旅游控股股份有限公司、长海县海洋与渔业综合行政执法队、沈阳市现代农业研发服务中心。本文件主要起草人：田甲申、鹿志创、李多慧、孔重人、赵德辉、王震、高祥刚、张胜久、于丹。本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈，我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街2号），联系电话：024-23447862。文件起草单位通讯地址：辽宁省海洋水产科学研究院（大连市沙河口区黑石礁街50号），联系电话：041

3、1-84691609。DB21/T 36462022 1 斑海豹肠道微生物菌群健康评估规范 1 范围 本文件规定了斑海豹肠道微生物菌群的取样方法、检测方法及微生物菌群指标评估的技术要求。本文件适用于斑海豹主管部门、科研院所、水族馆等可进行斑海豹救助和饲养的机构开展斑海豹肠道微生物菌群健康评估。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SC/T 6073 水生哺乳动物饲养设施要求 SC/T 9409 水生哺乳动物谱系记录规范 SC/T

4、9606 斑海豹饲养规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 斑海豹 spotted seal 分布在我国黄、渤海海域的斑海豹为野生斑海豹；在水族馆、动物园、救助机构等人工饲养条件下生活的斑海豹为豢养斑海豹。3.2 斑海豹年龄 age of spotted seal 斑海豹从出生时起到计算时止生存的时间长度，通常用年岁来表示。小于1岁为幼崽，1岁为幼年，2岁3岁为青年，4岁以上为成年。3.3 肠道微生物菌群 gut microbiota 肠道环境中存在的微生物群落，是其中生存的全体微生物的集合。4 取样方法 4.1 样本要求 DB21/T 36462022 2 采集斑海豹的粪便

5、作为样本。豢养斑海豹应为按照SC/T 6073、SC/T 9409和SC/T 9606的相关要求饲养的个体，且在90天内未服用过抗生素类药物。4.2 取样 样本应在干燥区上采集。样本应新鲜，未粘水，无尿液混杂。取样量5g以上，装入密封袋、塑料管等无菌容器中。4.3 保存 取样后应低温保存，-20环境条件下可保存7天。-80环境条件下可长期保存。5 检测方法 5.1 DNA 提取 采用DNA试剂盒提取基因组DNA。采用琼脂糖凝胶电泳检验提取DNA的完整性。成功提取的DNA，使用微量分光光度计测定其浓度和纯度，并于-20环境条件下保存。5.2 16S rRNA 基因扩增 使用341F-806R引物

6、扩增DNA样本中的16S rRNA基因，扩增反应为25 L体系。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，使用凝胶回收试剂盒进行切胶回收。采用双链DNA定量试剂盒测定回收PCR产物的浓度，等量混合样品的PCR产物。采用DNA文库构建试剂盒构建测序文库，并进行测序。5.3 物种分类学鉴定 使用QIIME软件对测得序列进行质量控制，得到高质量的序列。将高质量的序列按照97%的相似性进行聚类，每一个聚类代表一个细菌属。使用QIIME挑选每一个聚类的代表序列，与Greengenes数据库比对进行物种分类学注释。根据注释后每一个物种的序列数目计算其丰度。6 微生物菌群指标评估 6.1 粪便指标 健康斑海豹的粪便

7、正常呈圆柱、弯曲等状态，表面光滑，富有弹性且相对柔软，颜色呈土黄色或红褐色。稀软、水状、扁条、细条状并伴有异常气味的粪便为异常，应进行肠道微生物菌群检测。6.2 肠道微生物菌群健康指标 斑海豹不同年龄阶段肠道微生物菌群健康指标范围参见表1。高于或低于某种菌属的指标范围，说明斑海豹处于疾病或亚健康状态，应进行相应的治疗。表 1 斑海豹肠道微生物菌群健康指标参考范围 菌属1 岁1 岁2 岁-3 岁4 岁梭菌属 Clostridium0.16%0.59%0.28%0.56%0.11%0.60%0.06%0.23%多尔氏菌属 Dorea2.52%32.90%2.73%10.67%0.09%4.48%8

8、.14%47.61%鲸杆菌属 Cetobacterium0.01%10.11%0.21%25.60%1.30%34.74%0.87%24.20%布劳特氏菌属 Blautia3.63%30.78%2.68%19.06%0.38%12.05%2.31%5.64%梭杆菌属 Fusobacterium0.05%4.50%0.63%8.00%0.26%11.93%0.23%2.17%DB21/T 36462022 3 斯奈克氏菌属 Slackia0.10%0.68%0.29%2.29%0.55%3.32%/拟杆菌属 Bacteroides0.15%1.66%0.58%2.83%0.03%9.76%0.0

9、8%0.56%柯林斯氏菌属 Collinsella1.57%7.16%0.36%2.36%0.22%1.14%0.54%4.43%消化球菌属 Peptococcus0.02%1.80%0.01%1.97%0.00%7.95%0.01%5.03%AB表 1 斑海豹肠道微生物菌群健康指标参考范围C表 1 斑海豹肠道微生物菌群健康指标参考范围表 1 斑海豹肠道微生物菌群健康指标参考范围（续）菌属1 岁1 岁2 岁-3 岁4 岁嗜冷杆菌属 Psychrobacter0.00%0.04%0.00%0.30%0.00%6.55%0.00%0.74%阿托波氏菌属 Atopobium0.00%2.05%0.0

10、6%2.46%0.02%0.08%0.11%2.56%粪杆菌属 Coprobacillus/0.02%0.48%0.00%0.08%0.00%4.48%颤螺菌属 Oscillospira0.01%0.12%0.06%2.26%0.10%0.31%0.02%1.54%苍白杆菌属 Ochrobactrum0.02%0.26%0.05%0.48%0.09%0.32%0.04%0.17%瘤胃球菌属 Ruminococcus0.09%0.49%0.00%0.24%0.01%0.33%0.03%0.45%八叠球菌属 Sarcina0.01%0.04%0.03%0.18%0.06%0.13%0.06%0.6

11、9%厌氧生活螺菌属 Anaerobiospirillum0.00%0.22%0.01%0.15%0.01%0.35%0.00%0.06%普雷沃氏菌属 Prevotella0.00%0.25%0.00%0.12%0.00%0.13%0.00%0.04%不动杆菌属 Acinetobacter0.02%0.15%0.03%0.12%0.01%0.11%0.01%0.05%栖粪杆菌属 Faecalibacterium0.00%0.02%0.02%0.32%0.00%0.22%0.00%0.02%土壤杆菌属 Agrobacterium0.00%0.08%0.02%0.15%0.01%0.06%0.02%0.04%发光杆菌属 Photobacterium0.00%0.20%0.00%0.04%0.00%0.37%0.00%0.10%爱德华氏菌属 Edwardsiella/0.00%0.01%0.00%0.05%0.00%0.87%沉积物杆状菌属 Sediminibacterium0.01%0.04%0.01%0.15%0.01%0.10%0.01%0.04%D_