DB43 T 1967-2020 浮萍实验室培养技术操作规程.pdf

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1、湖南省地方标准DB43湖南省市场监督管理局 发 布DB43/T167 2020 92020-12-29发布 2021-03-29实施浮萍实验室培养技术操作规程Guideline for Laboratory Culture Technology of LemnaICS 65.020CCS B 16DB43/T 19672020 I 目 次 前言 1 范围 1 2 规 范性 引用 文件 1 3 术 语和 定义 1 3.1 生物 量 1 3.2 无性 繁殖 体 1 3.3 无性 繁殖 群 1 3.4 叶片 1 4 环 境条 件 1 4.1 光照 1 4.2 水温 1 4.3 pH 2 5 培 养基

2、 2 6 仪 器设 备与 器具 2 6.1 培养 设备 2 6.2 培养 器 具 2 6.3 其它 设备 和工 具 2 7 培 养过 程 2 7.1 灭菌 2 7.2 培养 与扩 繁 2 7.3 保种 2 7.4 注意 事项 3 附录A（资 料性）改进 的Steinberg 培养 基的 配方 4 DB43/T 19672020 II DB43/T 19672020 III 前 言 本文件 按 照GB/T 1.1 2020 给 出的 规则 起草。本文件 某些 内容 可能 涉及 专利。本文 件发 布机 构不 承担识 别这 些专 利的 责任。本文件 由湖 南省 农业 农村 厅提出。本文件 由湖 南省

3、 农业 标准 化技术 委员 会归 口。本文件 起草 单位：湖 南省 植物保 护研 究所,长 沙艾 格 里生物 科技 有限 公司。本文件 主要 起草 人：刘勇、陈昂、张 德咏、张 战泓、蒋桂 芳、罗杰、罗 香文、熊浩、陈 武瑛。DB43/T 19672020 IV DB43/T 19672020 1 浮萍实验 室养殖 技术操作 规程 1 范围 本文件 规定 了湖 南省 小浮 萍、紫 背浮 萍等 浮萍 的室 内培养 环境 条件。本文件 适用 于湖 南省 浮萍 实验室 培养 的管 理。2 规 范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。

4、其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。3 术 语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。3.1 生物量 Biomass 指一个 种群 中存 活的 活体 材料的 干重，本 标准 中指 生物量 的代 替品，如 叶片 数量或 叶面 积等 代表 性测量值 即术 语“生物 量”的代替 性测 量。3.2 无性繁 殖体 Clone 指通过 无性 繁殖 产生 的生 物体或 细胞。来 自同 一个 无性繁 殖体 的个 体有 遗传 同一性。3.3 无性繁 殖群 Colony 指相互 连

5、着 的母 体和 后代 叶片（通 常24 片）的 集 合体。有时 也指 整个 植株。3.4 叶片 Frond 指浮萍 植株 的单 个“叶状 结构”。它 是最 小的 单位，即个体，有 繁殖 能力。4 环 境条 件 4.1 光照 自然光、白 炽灯、荧 光灯 都可作 为室 内培 养浮 萍的 光源。将光 源固 定在 距植 株 30 50 cm 的 上方，应预防 热损 伤，且保 证光 合作用 和生 长充 足的 光照。光照 强 度6500 10000 Lux。光/暗比为 16/8。4.2 水温 培养于 温度可 控的 设备或 区域中（恒温 箱、人工气 候箱、恒温室），最 佳生长 温度为 242，低 DB43/

6、T 19672020 2 温情况 下会 形成 冬芽。4.3 pH 在 pH6 9 的 范围 内，能够 正常生 长。低 pH 对浮 萍的 生长具 有抑 制作 用，浮萍 对 pH 耐 受的 低限 在56 之间。5 培 养基 推荐改 进 的Steinberg 培 养基（见附 录 A），用HCl 和 NaOH 调整 pH。6 仪 器设 备与 器具 6.1 培养 设备 浮萍应 培养 于温 度和 光照 可控的 设备 或区 域中，如：恒温 箱、人工 气候 箱、恒温室、高 压灭 菌锅、光源、冰箱 等。6.2 培养 器具 可以用 多种 容器，如：三 角瓶、表面 皿、组织 培养 瓶等。6.3 其它 设备 和工 具

7、 超净工 作台、照 度计、温 湿度计、网、筛、接 种环、叉子、薄 刀片 等。7 培 养过 程 7.1 灭菌 a）取 样：选取 一簇 单克 隆浮萍，将 其分 成若 干个 个体；b）去 根：用灭 菌后 的刀 片去除 所有 浮萍 个体 的根；c）漂 洗：在无 菌水 中剧 烈的摇 动，冲洗 浮萍 植株；d）表 面灭 菌：0.5 的 次 氯酸钠 溶液 中浸 泡 1 min e）漂 洗：无菌 水或 无菌 培养液 冲 洗 23 次；f）接 种：在超 净工 作台 中转接 到无 菌培 养液 中，确保转 接的 浮萍 个体 叶状 体底部 的囊 为绿 色。7.2 培养 与扩 繁 浮萍在 适宜 的条 件下 生长 速度很

8、 快，通常710 天 就会铺 满容 器并 发生 重叠，需要 将浮 萍植 株转 接入新鲜 的培 养基 中，整个 过程需 要无 菌操 作。具体 步骤为：a）灭菌：培养 基和 培养 容 器、操作 工具 等需121 高 温高压 灭菌，操作 环境 需 紫外灯 灭 菌 40 min；b）培 养基 分装：每 个培 养器 皿 150 mL 培养 基，液 面高度 为 3 cm；c）转 接：挑选 生长 状况 良好的 浮萍 植株，用 接种 环转接 入倒 有新 鲜培 养基 的容器 里；d）密封：盖上 容器 盖子，并 用 parafilm 封 口膜 密 封；e）标 记：标记 浮萍 的名 称品系 和世 代，记录 初始 叶

9、片数 和时 间。7.3 保种 DB43/T 19672020 3 将浮萍 放在 光照 较弱、温 度较低（410）的条 件 下保种，可 1 2 个月 接种 一次。在 4 冰箱 也可保种，但是 复苏 之后 老 叶片会 白化。冷冻 保藏 是 一种在 超低 温条 件下 保存 活体细 胞的 技术，珍贵 的 浮萍植株 可以 通过 超低 温冷 冻保藏 于液 氮中，以 保持 其遗传 性。基本 过程 包括：a）用 渗透 剂和 冷冻 保护 剂（如 蔗糖 和甘 油）去除 自由水；b）植 株保 存于 冻存 管中，-80 冷 冻保 存；c）浸入-196 液氮 中。复苏：低温 保藏 的浮 萍可 在 45 水 浴中 迅速

10、解冻，接种至 新鲜 培养 基即 可复 苏。7.4 注意 事项 a）野外采 集 的 浮 萍，一 定 要 进 行 无 菌 化 处 理 后 再 用 培 养 基 培 养，否 则 藻 类 的 爆 发 会 是依附在浮萍上的 藻类 增多，增 加无 菌化的 难度，可 以先 用采 集的水 暂养；b）对浮萍 的 操 作 一 定 要 轻。浮 萍 的 叶 状 体 非常纤 弱易损坏，因此移取 浮萍时只能从叶状体底 部托起，不能 夹取 叶状 体；c）培 养基 的 pH 很 重要，需要调 节 至 69 范 围内；d）螯 合铁 是浮 萍生 长不 可缺少 的，不可 以高 温高 压灭菌，只 能用 细菌 过滤 膜添加。DB43/T 19672020 4 附 录 A（资料 性）改进的 Steinberg 培 养基 的配方 表A.1 改 进的Steinberg 培养 基的 配方 物质 浓度（mg/L）KNO3 350 Ca(NO3)2 4H2O 295 KH2PO4 90 K2HPO4 12.6 MgSO4 7H2O 100 H3BO3 0.12 ZnSO4 7H2O 0.18 Na2MoO4 2H2O 0.044 MnCl2 4H2O 0.18 FeCl3 6H2O 0.76 EDTA Disodium dehydrate 1.5