SN T 5364.7-2021 出口食品中致病菌检测方法 微滴式数字PCR法 第7部分：产志贺毒素大肠埃希氏菌.pdf

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1、I C S 0 7 . 1 0 0 . 3 0 C C S X 0 4 中 华 人 民 共 和 国 出 入 境 检 验 检 疫 行 业 标 准 S N / T 5 3 6 4 . 7 2 0 2 1 出 口 食 品 中 致 病 菌 检 测 方 法 微 滴 式 数 字 P C R 法 第 7 部 分: 产 志 贺 毒 素 大 肠 埃 希 氏 菌 D r o p l e t d i g i t a l P C R m e t h o d f o r d e t e c t i o n o f p a t h o g e n s i n e x p o r t f o o d P a r t 7 :

2、 S h i g a T o x i n - p r o d u c i n g E s c h e r i c h i a c o l i 2 0 2 1 - 1 1 - 2 2 发 布 2 0 2 2 - 0 6 - 0 1 实 施 中 华 人 民 共 和 国 海 关 总 署 发 布 以正式出版文本为准以正式出版文本为准前 言 本 文 件 按 照 GB / T 1. 1 2020 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分: 标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定 起 草。 SN / T 5364 2021 出 口 食 品 中 致 病 菌 检 测 方 法 微 滴 式

3、 数 字 PCR 法 共 分 为 8 个 部 分: 第 1 部 分: 副 溶 血 性 弧 菌; 第 2 部 分: 霍 乱 弧 菌; 第 3 部 分: 溶 藻 弧 菌; 第 4 部 分: 创 伤 弧 菌; 第 5 部 分: 金 黄 色 葡 萄 球 菌; 第 6 部 分: 单 核 细 胞 增 生 李 斯 特 氏 菌; 第 7 部 分: 产 志 贺 毒 素 大 肠 埃 希 氏 菌; 第 8 部 分: 克 罗 诺 杆 菌 属( 阪 崎 肠 杆 菌); 本 文 件 为 SN / T 5364 2021 的 第 7 部 分。 请 注 意 本 文 件 的 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利。 本 文 件

4、 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 专 利 的 责 任。 本 文 件 由 中 华 人 民 共 和 国 海 关 总 署 提 出 并 归 口。 本 文 件 起 草 单 位: 中 国 海 关 科 学 技 术 研 究 中 心、 中 华 人 民 共 和 国 石 家 庄 海 关。 本 文 件 主 要 起 草 人: 魏 咏 新、 马 丹、 张 琳、 李 丹、 魏 海 燕、 徐 蕾 蕊、 张 西 萌、 汪 琦、 曾 静。 S N / T 5 3 6 4. 7 2 0 2 1 以正式出版文本为准以正式出版文本为准出 口 食 品 中 致 病 菌 检 测 方 法 微 滴 式 数 字 P C R 法 第 7 部

5、 分: 产 志 贺 毒 素 大 肠 埃 希 氏 菌 1 范 围 本 文 件 规 定 了 食 品 中 产 志 贺 毒 素 大 肠 埃 希 氏 菌 的 微 滴 式 数 字 PCR 检 测 方 法。 本 文 件 适 用 于 食 品 中 产 志 贺 毒 素 大 肠 埃 希 氏 菌 的 快 速 定 性 检 测。 本 文 件 的 检 出 限 为 1 CFU / 25 g5 CFU / 25 g ( 或 1 CFU / 25 mL5 CFU / 25 mL )。 2 规 范 性 引 用 文 件 下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的

6、 条 款。 其 中, 注 日 期 的 引 用 文 件, 仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件; 不 注 日 期 的 引 用 文 件, 其 最 新 版 本( 包 括 所 有 的 修 改 单) 适 用 于 本 文 件。 GB 4789. 6 食 品 安 全 国 家 标 准 食 品 微 生 物 学 检 验 致 泻 大 肠 埃 希 氏 菌 检 验 GB / T 6682 分 析 实 验 室 用 水 规 格 和 试 验 方 法 GB / T 27403 2008 实 验 室 质 量 控 制 规 范 食 品 分 子 生 物 学 检 测 3 术 语 和 定 义 本 文 件 没 有 需

7、要 界 定 的 术 语 和 定 义。 4 缩 略 语 下 列 缩 略 语 适 用 于 本 文 件。 DNA ( deoxy r i bonu l e i c a c i d ): 脱 氧 核 糖 核 酸。 ddPCR ( d r op l e t d i g i t a l po l yme r a s e cha i n r e a c t i on ): 微 滴 式 数 字 PCR 。 h l yA : 产 志 贺 毒 素 大 肠 埃 希 氏 菌 溶 血 素 前 体 蛋 白 基 因。 PCR ( po l yme r a s e cha i n r e a c t i on ): 聚 合

8、酶 链 式 反 应。 5 方 法 原 理 针 对 产 志 贺 毒 素 大 肠 埃 希 氏 菌 溶 血 素 前 体 蛋 白 基 因( h l yA ) 保 守 序 列 设 计 引 物、 探 针, 将 一 定 浓 度 的 引 物、 探 针 与 模 板 DNA 及 数 字 PCR 反 应 预 混 液 混 合, 配 成 PCR 反 应 体 系。 将 该 数 字 PCR 体 系 分 布 到 10 00020 000 个 微 滴 中, 使 大 部 分 微 滴 中 模 板 DNA 分 子 的 数 量 为 1 或 0 , 然 后 进 行 PCR 扩 增。 h l yA 的 基 因 探 针 5 端 标 记 FA

9、M 荧 光 基 团, 利 用 数 字 PCR 系 统 的 检 测 通 道, 可 对 每 个 微 滴 的 荧 光 信 号 进 行 采 集 分 析。 含 有 模 板 DNA 的 微 滴 出 现 荧 光 信 号 的 增 强, 形 成 阳 性 微 滴 簇。 根 据 阳 性 微 滴 的 有 无 判 定 样 品 中 是 否 含 有 产 志 贺 毒 素 大 肠 埃 希 氏 菌。 1 S N / T 5 3 6 4. 7 2 0 2 1 以正式出版文本为准6 主 要 设 备 及 耗 材 6. 1 天 平: 感 量 0. 1 g 。 6. 2 匀 质 器。 6. 3 恒 温 培 养 箱: 36 1 。 6. 4

10、 高 速 台 式 冷 冻 离 心 机( 离 心 力 12 000 g )。 6. 5 涡 旋 振 荡 仪。 6. 6 核 酸 蛋 白 分 析 仪 或 紫 外 分 光 光 度 计。 6. 7 生 物 安 全 柜。 6. 8 ddPCR 扩 增 仪 及 相 关 配 套 设 备。 6. 9 不 同 量 程 移 液 器: 100 L1 000 L 、 20 L200 L 、 10 L100 L 、 0. 5 L10 L 。 6. 1 0 离 心 管: 2 mL 、 1. 5 mL 和 0. 2 mL 。 7 材 料 与 试 剂 7. 1 仅 使 用 分 析 纯 试 剂 和 符 合 GB / T 668

11、2 规 定 的 一 级 水。 7. 2 细 菌 基 因 组 提 取 试 剂 盒。 7. 3 ddPCR 反 应 配 套 试 剂。 7. 4 去 游 离 核 酸 酶: 伯 乐 1) 。 1 ) 给 出 这 一 信 息 是 为 了 方 便 本 文 件 使 用 者, 并 不 表 示 只 认 可 该 产 品。 如 果 其 他 等 效 产 品 具 有 相 同 的 效 果, 则 可 使 用 等 效 产 品。 7. 5 阳 性 对 照: 产 志 贺 毒 素 大 肠 埃 希 氏 菌 标 准 菌 株 DNA , 或 含 目 的 片 段 的 DNA 亦 可。 7. 6 产 志 贺 毒 素 大 肠 埃 希 氏 菌

12、h l yA 基 因 特 异 性 序 列 片 段 参 见 附 录 A , 引 物 探 针 如 下: STEC -F : 5 - CGGGTTATGCCTGCAAGTTC - 3 ; STEC -R : 5 - GCAGTAGAAAGAGCAGTCGCAAT- 3 ; STEC -P : FAM- CCGATCTTCTCATCCCAATGTTGCTGG-BHQ1 - 3 。 8 检 测 程 序 食 品 中 产 志 贺 毒 素 大 肠 埃 希 氏 菌 ddPCR 检 测 程 序 见 图 1 。 2 S N / T 5 3 6 4. 7 2 0 2 1 以正式出版文本为准图 1 食 品 中 产 志

13、贺 毒 素 大 肠 埃 希 氏 菌 d d P C R 检 测 程 序 9 实 验 操 作 步 骤 9. 1 样 品 制 备 参 照 GB 4789. 6 中 方 法 进 行 样 品 制 备 和 增 菌。 9. 2 D N A 提 取 直 接 取 9. 1 获 得 的 增 菌 液 2 mL 加 到 无 菌 离 心 管 中, 8 000 g 离 心 2 mi n , 尽 量 吸 弃 上 清; 利 用 100 L 磷 酸 盐 缓 冲 液 重 悬 沉 淀, 加 入 20 L 去 游 离 核 酸 酶, 置 于 37 作 用 15 mi n 30 mi n , 95 加 热 10 mi n 使 酶 失

14、活。 继 而 利 用 细 菌 基 因 组 提 取 试 剂 盒 提 取 DNA , 操 作 方 法 按 试 剂 盒 说 明 书 进 行。 9. 3 D N A 浓 度 和 纯 度 测 定 取 适 量 DNA 原 液 加 双 蒸 水 稀 释 一 定 倍 数 后, 使 用 核 酸 蛋 白 分 析 仪 或 紫 外 分 光 光 度 计 测 定 260 nm 和 280 nm 处 的 吸 收 值, 按 照 式( 1 ) 计 算 DNA 的 浓 度。 = A260 N50 ( 1 ) 式 中: DNA 浓 度, 单 位 为 微 克 每 毫 升( g / mL ) ; A260 260 nm 处 的 吸 光

15、值; N 核 酸 稀 释 倍 数。 当 DNA 浓 度 为 0. 1 g / mL100 g / mL , A260 / A280 在 1. 82. 0 之 间 时, 适 用 ddPCR 检 测。 3 S N / T 5 3 6 4. 7 2 0 2 1 以正式出版文本为准9. 4 d d P C R 检 测 9. 4. 1 对 照 和 平 行 检 测 过 程 中 分 别 设 置 阳 性 对 照、 阴 性 对 照 和 空 白 对 照。 以 产 志 贺 毒 素 大 肠 埃 希 氏 菌 标 准 菌 株 DNA 或 含 目 的 片 段 的 DNA 作 为 阳 性 对 照, 利 用 细 菌 基 因 组

16、 提 取 试 剂 盒 按 步 骤 9. 2 提 取 的 大 肠 埃 希 氏 菌 标 准 菌 株 DNA 作 为 阴 性 对 照, 用 等 体 积 的 双 蒸 水 代 替 DNA 模 板 作 为 空 白 对 照。 每 个 待 检 样 品 提 取 的 DNA 溶 液 进 行 3 个 平 行 ddPCR 检 测。 9. 4. 2 反 应 体 系 按 照 表 1 配 置 反 应 体 系。 表 1 d d P C R 反 应 体 系 试 剂 名 称 储 备 液 浓 度 终 浓 度 体 积 数 字 PCR 反 应 预 混 液 2 1 10 L STEC -F 10 mo l / L 0. 75 mo l

17、/ L 1. 5 L STEC -R 10 mo l / L 0. 75 mo l / L 1. 5 L STEC -P 10 mo l / L 0. 25 mo l / L 0. 5 L DNA 模 板 5 L 水 1. 5 L 体 系 总 体 积 20 L 9. 4. 3 微 滴 生 成 将 配 制 好 的 数 字 PCR 反 应 混 合 液, 加 入 微 滴 生 成 装 置 加 样 孔 中, 按 仪 器 操 作 说 明 生 成 微 滴。 9. 4. 4 d d P C R 扩 增 将 生 成 的 微 滴 缓 慢 转 移 至 96 孔 板 中, 封 膜 后 置 于 PCR 仪 上, 按 以

18、 下 参 数 进 行 PCR 扩 增: 95 10 mi n ( 升 降 温 速 度: 1 / s ); 94 30 s ( 升 降 温 速 度: 1 / s ), 60 1 mi n ( 升 降 温 速 度: 1 / s ), 45 个 循 环; 98 10 mi n ( 升 降 温 速 度: 1 / s ), 4 保 存 反 应 产 物。 注: PCR 反 应 参 数 可 根 据 基 因 扩 增 仪 型 号 的 不 同 进 行 适 当 的 调 整。 9. 4. 5 荧 光 信 号 读 取 扩 增 反 应 结 束 后, 将 96 孔 板 放 入 ddPCR 检 测 仪 中 对 每 个 微 滴

19、 进 行 荧 光 检 测, 采 用 FAM 通 道 读 取 荧 光 信 号。 1 0 结 果 分 析 与 表 述 1 0. 1 阈 值 的 设 定 根 据 空 白 对 照 的 终 点 荧 光 值 设 定 阈 值 限, 阈 值 限 应 对 空 白 和 阳 性 扩 增 结 果 进 行 明 确 的 区 分。 1 0. 2 质 量 控 制 1 0. 2. 1 体 系 分 隔 产 生 的 有 效 微 滴 的 总 数 量 满 足 所 用 ddPCR 仪 器 型 号 要 求。 4 S N / T 5 3 6 4. 7 2 0 2 1 以正式出版文本为准1 0. 2. 2 阴 性 对 照 和 空 白 对 照

20、无 荧 光 信 号 检 出。 1 0. 2. 3 阳 性 对 照 有 荧 光 信 号 检 出 且 阴 性 微 滴 簇 与 阳 性 微 滴 簇 能 够 截 然 分 开。 1 0. 2. 4 以 上 质 控 条 件 中 有 一 项 不 符 合 者, 实 验 结 果 视 为 无 效, 查 找 原 因 后 再 次 进 行 ddPCR 检 测。 1 0. 3 结 果 表 述 1 0. 3. 1 待 检 样 品 所 有 微 滴 的 荧 光 信 号 均 低 于 阈 值 限, 待 测 样 品 中 不 含 有 产 志 贺 毒 素 大 肠 埃 希 氏 菌, 检 测 结 果 表 述 为“ 未 检 出 产 志 贺 毒

21、 素 大 肠 埃 希 氏 菌”。 1 0. 3. 2 待 检 样 品 3 个 平 行 中 至 少 1 个 平 行 有 荧 光 信 号 高 于 阈 值 限 的 阳 性 微 滴, 且 阴 性 微 滴 簇 与 阳 性 微 滴 簇 能 够 截 然 分 开, 该 样 品 结 果 为 产 志 贺 毒 素 大 肠 埃 希 氏 菌 初 筛 阳 性, 对 样 品 的 增 菌 液 进 一 步 按 GB 4789. 6 中 的 操 作 步 骤 进 行 确 认 后 报 告 结 果。 1 1 防 污 染 措 施 检 测 过 程 中 防 止 交 叉 污 染 的 措 施 按 照 GB / T 27403 2008 中 附

22、录 D 的 规 定 执 行。 5 S N / T 5 3 6 4. 7 2 0 2 1 以正式出版文本为准附 录 A ( 资 料 性) 产 志 贺 毒 素 大 肠 埃 希 氏 菌 特 异 性 基 因 序 列 片 段 产 志 贺 毒 素 大 肠 埃 希 氏 菌 h l yA 基 因 序 列( 部 分) 及 引 物 设 计 示 意 图( GenBank No. EU118026. 1 ) 见 图 A. 1 。 图 A. 1 产 志 贺 毒 素 大 肠 埃 希 氏 菌 h l yA 基 因 序 列( 部 分) 及 引 物 设 计 示 意 图 注: 阴 影 部 分 分 别 为 上 下 游 引 物 序

23、列, 方 框 部 分 为 探 针 序 列。 6 S N / T 5 3 6 4. 7 2 0 2 1 以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 2 0 2 7 4 6 3 5 T / N S 中 华 人 民 共 和 国 出 入 境 检 验 检 疫 行 业 标 准 出 口 食 品 中 致 病 菌 检 测 方 法 微 滴 式 数 字 P C R 法 第 7 部 分: 产 志 贺 毒 素 大 肠 埃 希 氏 菌 SN / T 5364. 7 2021 * 中 国 海 关 出 版 社 有 限 公 司 出 版 发 行 北 京 市 朝 阳 区 东 四 环 南 路 甲 1 号( 100023 ) 编 辑 部:( 010 ) 65194242 - 7509 网 址 www. cus t omskb. c om / book 中 国 标 准 出 版 社 秦 皇 岛 印 刷 厂 印 刷 * 开 本 88012301 / 16 印 张 0. 75 字 数 22 千 字 2022 年 6 月 第 一 版 2022 年 6 月 第 一 次 印 刷 印 数 1 500 * 书 号: 155175 737 定 价 1 2. 0 0 元