GA T 1909-2021 法庭科学 生物检材中α-茄碱和α-卡茄碱检验 液相色谱-质谱法.pdf

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1、 ICS 13.310 CCS A 92 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA GA/T 法庭科学 生物检材 中 - 茄碱 和 - 卡茄 碱 检验 液相 色谱- 质谱 法 Forensic sciences Examination methods for -solanine and -chaconine in biological samples LC-MS - 发布 - - 实施 中华人民 共和国 公安部 发 布 GA/T I 前 言 本文件 按 照 GB/T 1.1 2020 标 准化 工作 导则 第 1 部分： 标准 化文 件的 结构 和起草 规则 的 规定

2、起草。 请注意 本文 件的 某些 内容 可能涉 及专 利 。 本文 件的 发布机 构不 承担 识别 专利 的责任 。 本 文件 由全 国刑 事技 术标 准化技 术委 员会 毒物 分析 分技术 委员 会 （SAC/TC 179/SC 1 ） 提 出并 归口。 本 文件 起草 单位 ： 司 法鉴 定科学 研究 院 。 本 文件 主要 起草 人： 刘伟 、沈敏 、卓 先义 、沈 保华 、向平 。 GA/T 1 法庭科学 生 物检 材中 - 茄碱 和 - 卡茄碱检 验 液相 色谱- 质谱法 1 范围 本 文件 规定 了法 庭科 学领域 生物 检材 （血 液、 尿液 、肝脏 ） 中 - 茄 碱和 - 卡

3、 茄碱 的 液相 色谱- 串联 质谱（LC-MS/MS ）定 性 定量方 法。 本 文件 适用 于法 庭科 学领域 生物 检材 （血 液、 尿液 、肝脏 ）中- 茄碱 和- 卡 茄碱 的 定性 定量 分析 。 其他检 材 可 参照 使用 。 2 规范 性引 用文 件 下 列文 件中 的内 容通 过文中 的规 范性 引用 而构 成本文 件必 不可 少的 条款 。 其中， 注日 期的 引用 文件， 仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件； 不注 日期 的引 用文件 ， 其 最新 版本 （包 括所有 的修 改单 ） 适 用于 本 文件。 GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方

4、 法 GA/T 122 毒物 分析 名词 术语 3 术语 和定 义 GA/T 122 界 定的 术语 和定 义适用 于本 文件 。 4 原理 以空白 样品和 添加 样品作 对照， 按平行 操作 的要求 对生物 检材进 行固 相萃取 ，采用 液相色 谱-串联 质谱法 定性 定量 ，以 保留 时间、 质谱 特征 离子 对 和 离子对 丰度 比作 为定 性判 断依据 ； 以 峰面 积为 依据 ， 采用外 标法 或内 标法 进行 定量分析 。 5 试剂 和材料 5.1 试剂 实验用 水应 符合GB/T 6682-2008中 规定 的一 级水 ，试 剂包括 ： a) 甲醇（ 色谱 纯） ； b) 甲酸（

5、 优级 纯） ； c) 乙腈（ 色谱 纯） ； d) 0.1% 甲 酸溶 液： 移取 甲酸 10mL ， 加水 稀释 并定 容 至 1000mL ，混 匀； e) 标准物 质溶 液： 1) 1.0mg/mL 标准 物质 储备 溶 液： 根据 -茄碱和 -卡茄碱 标准 物质 的纯 度换 算后 ， 各称 取适 量， 用甲 醇分 别配 制成 1.0mg/mL - 茄 碱和 - 卡茄 碱 标准物 质储 备 溶 液 。 密 封 ， 置 于冰 箱 中冷冻 保存 ，有效期 12 个 月； 2) 单 一 标 准 物 质 工 作 溶 液 ： 移 取 1.0mg/mL 标 准 物 质 储 备 溶 液 ， 用 甲

6、醇 配 制 成 浓 度 为 0.1mg/mL 的单 一标 准工 作 溶液， 密封 ， 置 于冰 箱中 冷藏 保 存， 有效 期 3 个月 。实验 中所 用其他 浓度 的单 一标 准物质 工作 溶液 由 0.1mg/mL 单一 标准 物质 工作 溶液 逐级 稀释 得 到； 3) 混合标 准物 质工作 溶 液： 分别移取 1.0mg/mL 的 - 茄碱 和 - 卡 茄碱 标准 物质 储备溶 液， 用GA/T 2 甲醇配 制成 浓度 为 0.1mg/mL 的 混合 标准 物质 工作 溶 液 ， 密封 ， 置于 冰箱中 冷 藏 保存 ， 有 效期 3 个月 。 实 验中 所用 其他浓 度的 混合 标准

7、 物质 工作溶 液 由 0.1mg/mL 混 合 标准物 质工 作溶液 逐级 稀释 得到 ； 4) 1.0mg/mL 内标 储备 溶液 ： 以美替 诺龙 醋酸 酯作 为内 标，根 据其 纯度 换算 后， 用 甲醇 配制 成 1.0mg/mL 内 标储 备 溶 液 ，密封 ，置 于冰 箱 中 冷冻 保存， 有效 期 12 个 月； 5) 0.5 g/mL 内 标工 作溶 液 ： 移取 1.0mg/mL 内标 储备 液，用 甲醇 逐级 配制 成 0.5 g/mL 内标 工作溶 液， 密封 ，置 于冰 箱 中冷 藏保存 ， 有效 期 3 个月。 5.2 材料 材料 包 括： a) 具盖离 心管 ；

8、b) 具塞玻 璃试 管 ； c) 固相萃 取柱 ：Oasis HLB 或等效 固相 萃取 柱 ； 注：Oasis HLB 柱是 Waters 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产 品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 6 仪器 和设 备 仪器和 设备 包括 ： a) 液相色 谱-串联 质 谱仪 ，配 有电喷 雾离 子源 （ESI）； b) 固相萃 取仪 ； c) 电子天 平： 定性 检验 实际 分度 值 d0.1mg ， 定量 检 验实际 分度 值 d0.01mg ； d) 离心机 ； e) 振荡器； f) 移液器 ； g) 浓

9、缩器 。 7 操作 方法 7.1 定 性分 析 7.1.1 样品 前处 理 7.1.1.1 检材 样品 制备 7.1.1.1.1 血 液、 尿液 样 品制备 移取血 液或 尿 液 0.2mL ， 加入 水 1mL ，混 匀， 不低 于 13000r/min 离心 5 min ，取上 层清 液 1mL 以 约 0.5 mL/min 的 速度 在固 相萃取 小柱 上样 （固 相萃 取小柱 在用 前依 次用 甲 醇 1mL、水 1mL 活 化） 。然 后依次 用 5% 甲醇 溶 液 1 mL 和水 1 mL 淋 洗， 抽干 小 柱 6min ， 用甲 醇 1mL 洗 脱 ，重 复 2 次， 合并 洗

10、脱 液，洗 脱液 在浓 缩器 上 55下氮 气流 下浓 缩至 干， 残留物 用 200 L 甲醇 复溶 ，得到 检材 样品 提取 液 ， 供仪器 检测 。 7.1.1.1.2 组 织样 品制 备 称取研 碎组 织 0.2g ， 加入 水 1.2mL ， 混匀 ，不 低于 13000r/min 离心 5 min ， 余 下同 7.1.1.1.1 。 7.1.1.2 质控 样品 制备 GA/T 3 取等量 相似 基质 的空 白样 品 （ 若无 相似 基质 空白 样 品可用 血液 替代 ） 两份 于 具盖离 心管 中 ， 一 份作 为空白 样品 ，一 份添加 10ng/mL 的 - 茄碱 和 - 卡

11、 茄 碱标准 工作 溶 液 10 L ， 加 入水 1mL （组 织样 品为 1.2mL）， 作 为添 加样 品 ， 与检材 样品 平行 操作 ， 得 到空 白 样品 提取 液和 添加 样品提 取液 ， 供 仪器 检测 。 7.1.2 仪器 检测 7.1.2.1 液相 色谱- 串联 质谱仪 条件 以下为 参考 条件 ，可 根据 不同品 牌仪 器和 不同 样品 等实际 情况 进行 调整 ： a) 色谱 柱：Restek Allure PFP Propyl 液相 色谱 柱（100mm 2.1mm ，5m ）或 其他等 效柱 ； 注：Restek Allure PFP Propyl 柱是 Reste

12、k 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不 是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 流 动相 ：A 相： 乙腈 ；B 相：0.1% 甲 酸溶 液 （ 体积比 为 70:30 ） ； c) 流速 ：300 L/min ，恒 流模式 ； d) 柱温 ：4 ； e) 进样 量：10 L ； f) 离子 源： 电喷 雾电 离- 正离子 扫描 （ESI + ）； g) 检 测方 式： 多反 应监 测（MRM）； h) 离 子源 电压(IS) ：5500V ； i) 碰撞 气(CAD) 、 气 帘气 (CUR) 、 雾化 气 (GS1)

13、、 辅助 气 2 (GS2) 均为 高纯 氮 气， 使 用前 调节 各气 流流量 以使 质谱 灵敏 度达 到检测 要求 ； j) 喷雾 电压(IS) 、 去簇 电 压(DP) 、碰 撞能 量(CE) 等 电压值 应优 化至 最佳 灵敏 度 ； k) 定性 离 子对 、定 量离 子对见 表 1 。 表 1 定性 离子 对 、 定量 离 子对 目标物 定量离子对 m/z 定性离子对 m/z - 茄碱 868.6/398.5 868.6/398.5 868.6/722.4 - 卡茄碱 852.6/706.5 852.6/706.5 852.6/398.5 美替诺龙醋酸酯 345.4/187.4 34

14、5.4/187.4 345.4/83.1 7.1.2.2 进样 分别 吸 取检 材样 品 提 取液 、空白 样品 提取 液和 添加 样品提 取液，按 7.1.2.1 条 件进样 分析 。 7.2 定量 分析 7.2.1 样 品前 处理 移 取 （ 或称 取） 检材 血液0.2mL （ 或尿 液0.2mL ， 组织0.2g ） 两份 ， 加0.5 g/mL 美 替诺龙 醋酸 酯内 标 工作溶 液20 L （ 外标 法 不 用加 ） ， 再 加入 水1mL （ 组 织样品 为1.2mL ） ， 按7.1.1.1.1 （或7.1.1.1.2 ） 操 作 ， 得到检材 样 品提 取液 ，供 仪器检 测

15、 。 GA/T 4 另取相 同基 质空 白样品 若干 份， 添加 系 列浓 度的- 茄碱 、 - 卡 茄碱 或单 点浓 度的-茄碱、- 卡 茄碱 ， 作为添 加样 品 ， 与检 材样 品平行 操作 。 检材样 品中- 茄碱 、-卡茄碱 的 浓 度应 在工作 曲 线的 线性范 围内 。 配 制单 点浓 度的 添 加样 品 时 ， 检 材中- 茄 碱、- 卡茄 碱 浓 度需在 该浓 度的 （100 50 ）%范围 内。 7.2.2 仪 器检 测 7.2.2.1 仪器 参考 条件 同 7.1.2.1 。 7.2.2.2 进样 分别取 检材 样品 提取 液 、 添加样 品提 取液，按 7.1.2.1

16、条件进 样分 析 。 每 份样 品 提取液 各 进 样分 析2 3次。 7.2.3 计算 7.2.3.1 计算 含量 7.2.3.1.1 外标-工 作曲 线 法 记录检 材样 品提 取液 和添 加 系列 浓度 样品 提取 液中 目标物 的保 留时 间和 峰面 积值 ， 以添加 系 列浓 度 样品提 取液中 目 标物 的峰 面积的 平均 值为 纵坐 标 、 添加 系列 浓度 样品 中 目 标物 的含量 为横 坐标 进行 线性 回归， 得到线 性方 程。根 据检材 样品提 取液 中目标 物的峰 面积值 ，按 公式 （1 ）计算 出检材 样品 中目标 物的含量 。 . （1 ） 式中： 检 材样 品

17、中 目标 物的 含量; y 检 材样 品提 取液 中目 标 物的峰 面积 的 平 均值 ； a 线 性方 程的 斜率 ； b 线 性方 程的 截距 。 7.2.3.1.2 外标-单 点校 正法 记录检 材样 品提 取液 和添 加样品 提取 液中 目标 物的 保留时 间和 峰面 积值 ，按 公式 （2） 计算 检材 样 品中目 标物 的含量 。 . （2 ） 式中： 检 材样 品中 目标 物的 含量； A检 材样品 提取 液 中目标 物 的 峰面 积 的 平均 值 ； A 添加 样品 提取 液 中目 标物 的峰 面积 的平 均值 ； 添加 样品 中目 标物的 含量 。 7.2.3.1.3 内标-

18、工 作曲 线法 GA/T 5 记录检 材样 品提 取液 和添 加 系列 浓度 样品 提取 液中 目标物 和内 标的 保留 时间 和峰面 积值 ， 以 添加 系 列浓度 样品 提取 液中 目标 物与内 标物 的峰 面积 比的 平均值 为纵 坐标 、 添加 系列 浓度样品 中 目标 物的 含 量 为横坐 标进 行线 性回 归 ， 得到线 性方 程 。 根据 检材 样品提 取液 中目 标物 及内 标的峰 面积 值 ， 按公 式 （3 ） 计算出 检材 样品 中目 标物 的 含量 。 a b y = . （3 ） 式中 ： 检 材样 品中 目标 物的 含量； y 检 材样 品提 取液 中目标物 与内

19、标物 的峰 面积 比的 平均值 ； a 线性 方程 的斜 率 ； b 线 性方 程的 截距 。 7.2.3.1.4 内标-单 点校 正法 记录检 材样 品提 取液 和添 加样品 提取 液中 目标 物和 内标的 保留 时间 和峰 面积 值，按 公 式 （4 ）计算 检材样 品中 目标 物的 含量 。 . （4） 式中： 检 材样 品中 目标 物的 含量； A检 材样品 提取 液 中目标 物的 峰面 积 的 平均 值 ； A 添加 样品 提取 液 中目 标物 的峰 面积 的平 均值 ； Ai 检材 样品 提取 液 中内 标物 的峰 面积 的平 均值 ； Ai添 加样 品 提 取液 中内 标物的 峰

20、面 积 的 平均 值 ； 添加 样品 中目 标物 的 含量 。 7.2.3.2 计算 相对 相差 记录 7.2.3.1 中 计算 得到 的 检材样 品中 目标 物的 含量 ， 按公 式 （5） 计算 相对 相 差： 12 100% - RD = . （5 ） 式中 ： RD相 对相 差， 用百 分比 （% ） 表示 ； 1 、 2 两 份检 材样 品中 目标物 的含 量； 两份检 材样 品中 目标 物 含量的 平均 值。 8 结 果评 价 8.1 定性 结果 评价 8.1.1 阳 性结 果评 价 在相同 条件 下进 行样 品测 定时， 检材 样品 中 目 标物 的色谱 峰保 留时 间与 添加

21、样品 一 致 （ 相对 误差 在 2.5% 之 内 ） 、 其 定性 离子 对 （ 至少 两对 定性 离子 对 ）与添加 样品 一致 ， 且离 子 对丰 度比 与 添 加样 品 相 比，相 对 误 差不 超过 表3 规 定的范 围， 空白 样品 无干 扰，则 可判 断检 材样 品中 检出 目 标物 。 GA/T 6 表 2 离子 对丰 度比 的最 大 允许相 对 误 差范 围 离子 对丰度比 50% 2050 1020 10% 最大允许相对 误差 20 25 30% 50% 8.1.2 阴 性结 果评 价 检材样 品未 出现 与 添 加样 品中 目 标物 一致 的色 谱峰 ， 且空 白样 品无

22、 干扰 ， 则 可 判断检 材样 品中 未检 出目标 物 。 8.2 定量 结果 评价 检 材样 品中目 标物含 量的RD 20% ，定 量数据 可靠， 其含 量按 两 份检材 的平均 值计 算。检 材样 品 中目标 物含 量的RD 20% ，定量 数据 不可 靠 ， 应按7.2 重新 提取 检验 。 8.3 方 法检 出限 和定 量下 限 本方法 血液 和尿 液 中 - 茄 碱或 - 卡茄 碱的 检出 限均 为 0.2ng/mL ， 定量 下限 均 为 0.5ng/mL ； 肝组 织 中 - 茄 碱或 - 卡茄 碱的 检 出限均为 0.2ng/g ，定 量下 限均 为 0.5ng/g 。 -

23、 茄碱、- 卡茄 碱相 关资 料 、研 究数 据及 谱图 参见 附录 A 、 附录 B 及附 录 C 。 A GA/T 7 附 录 A （资料 性 ） - 茄碱、- 卡茄 碱相 关资 料 龙葵素 （Solanen ） 是存 在 于人类 的主 要粮 食作 物马 铃薯中 的一 类有 毒的 甾体 糖苷生 物碱 ， 主 要以 - 茄碱（-solanine）和 - 卡 茄碱（-chaconine ） 形式 存在， 含量 占马 铃薯 总糖 苷生物 碱的 95% 。 成熟 的 马铃薯 中 ， 龙 葵素的 含量 一般 为 7mg/100g 10mg/100g， 食用 是安 全的 。 当 马 铃薯由 于贮 存不

24、 当而 变绿 或发芽 时， 会产 生大 量的 龙葵素 ，当 龙葵 素的 含量 超过 20mg/100g 时 ，人 服 用后可 能会 导致 中毒 甚至 死亡。 龙葵素 中毒 的潜 伏期 为 2h20h 。最早出现的症状是口腔 、 咽喉部瘙痒 及烧灼感， 上 腹部 烧灼感 或疼痛 ，其 后出 现 胃 肠 炎 症 状 ， 剧 烈 吐 泻 导 致 脱 水 ， 电 解 质 紊 乱 ， 血 压 下 降 。 此 外 ， 还 有 耳 鸣 、 畏光、头晕、头痛、轻度意识障碍，呼吸困难，重症可昏迷、抽搐，最后因心脏衰竭、呼吸麻 痹而死亡。 人类毒性： 人食入 0.2g0.4g 龙葵素即可引起中毒 ， 且 中 毒

25、可 能 与 个 体 的 身 体 健 康 状 况 有 关 ， 对龙葵素吸收的敏感程度可能存在较大的个体差异。 龙葵素 半 数 致 死 量 （LD50）： 590mg/kg （ 大 鼠 口 服 ） ；75mg/kg （ 大 鼠 腹 腔 注 射 ） ；42mg/kg （小鼠腹腔注射） 。 人体志愿者 试验 表明 ： 一次 性 摄入 0.95mg/kg1.25mg/kg 龙葵素 后 ， 血 清中 - 茄碱 和 - 卡 茄碱 的达 峰时 间为 4h8h ， 最高 浓度 可达 2.9ng/mL11.8ng/mL 和 2.8ng/mL9.7ng/mL ， 半衰 期 t 1/2 分别 为 21h 和 44h

26、， 提示 人摄入 龙葵 素在 体内 有积 蓄性。 GA/T 8 附录 B （资料 性 ） - 茄碱、- 卡茄 碱相 关研 究 数据 B.1 - 茄 碱、- 卡茄 碱与 内标美 替诺 龙醋 酸酯 的 LC-MS/MS 参 数见 表 B.1 。 表B.1 - 茄 碱、- 卡茄 碱 与内标 美替 诺龙 醋酸 酯 的LC-MS/MS 参数 名称 定性离子对/ m/z 定量离子对 m/z 去簇电压 V 碰撞能量 eV 保留时间 min -茄碱 868.6/398.5 868.6/398.5 75 93 2.70 868.6/722.4 102 -卡茄碱 852.6/706.5 852.6/706.5 5

27、6 94 3.01 852.6/398.5 100 美替诺龙醋酸酯 345.4/187.4 345.4/187.4 70 41 3.28 345.4/83.1 32 B.2 各 基质 中 - 茄碱 、- 卡茄碱 的回 归方 程、 相关 系数、LOD 及 LOQ 见表 B.2 。 表 B.2 各 基质 中 - 茄 碱、- 卡茄碱 的回 归方 程、 相 关系数 、LOD 及LOQ 检材 化合物 线性范围 ng/mL(g) 回归方程 相关系数 r LOD ng/mL(g) LOQ ng/mL(g) 血液 - 茄碱 0.5 100 Y=0.530X+0.057 0.9982 0.2 0.5 - 卡茄碱

28、 0.5 100 Y=0.716X+0.126 0.9974 0.2 0.5 尿液 - 茄碱 0.5 100 Y=0.432X+0.061 0.9977 0.2 0.5 - 卡茄碱 0.5 100 Y=0.839X+0.128 0.9993 0.2 0.5 肝 - 茄碱 0.5 100 Y=0.694X+0.086 0.9988 0.2 0.5 - 卡茄碱 0.5 100 Y=1.070X+0.318 0.9984 0.2 0.5 注 ： 数据采用 - 茄碱、- 卡茄 碱定量离子对峰面积，内标法定量。 B.3 各 基质 中 - 茄碱 、- 卡茄碱 的精 密 度 、回 收率 和基质 效应 见 表

29、 B.3 。 GA/T 9 B.3 各 基质 中 - 茄碱 、- 卡茄碱 的精 密度 、回 收率 和基质 效应 检材 化合物 质控样品 ng/mL(g) RSD % 回收率 % 基质效应 % 日内(n=6) 日间(n=4) 血液 - 茄碱 0.5 6.81 8.38 50.4 52.5 1 8.79 10.07 56.1 65.1 20 10.07 8.58 50.1 59.5 80 8.31 7.13 54.2 55.2 - 卡茄碱 0.5 5.13 9.72 50.3 51.5 1 2.49 6.90 50.5 66.4 20 10.17 9.33 50.1 56.6 80 9.32 9.

30、28 51.2 59.4 尿液 - 茄碱 0.5 5.20 9.77 75.0 62.0 1 4.29 8.86 76.9 61.9 20 5.08 9.72 71.6 79.2 80 3.98 6.98 77.6 79.7 - 卡茄碱 0.5 8.23 8.39 75.5 52.5 1 6.53 6.60 79.7 52.7 20 6.36 9.22 76.9 76.1 80 3.39 4.93 78.7 70.3 肝 - 茄碱 0.5 5.69 7.49 51.2 53.1 1 6.31 8.03 50.9 54.6 20 7.68 5.60 50.0 47.5 80 3.13 4.51

31、51.9 52.6 - 卡茄碱 0.5 9.08 8.45 51.5 45.8 1 10.65 9.47 51.1 66.1 20 6.07 9.37 55.6 48.2 80 2.64 4.19 53.3 45.0 注 ： 数据采用 - 茄碱、- 卡茄 碱定量离子对峰面积，内标法定量。 GA/T 10 附录 C （资料 性 ） - 茄碱、- 卡茄 碱相 关谱 图 - 茄碱、- 卡茄 碱的 相关 谱图 见 C.1C.6 。 图C.1 空 白血 液的MRM 色谱图 标引序号 说明： 1- 茄碱； 2- 卡茄碱； 3- 美替诺龙醋酸酯 。 图 C.2 添加 血 液中 - 茄碱 （4ng/mL）、

32、- 卡 茄碱 （4ng/mL ） 及美替 诺龙 醋酸 酯 （50ng/mL ） 的MRM 色谱 图 图C.3 空 白尿 液的MRM 色谱图 GA/T 11 标引序号 说明： 1- 茄碱； 2- 卡茄碱； 3- 美替诺龙醋酸酯 。 图 C.4 添 加尿 液中 - 茄碱 （4ng/mL）、 - 卡 茄碱 （4ng/mL ） 及美替 诺龙 醋酸 酯（50ng/mL）的 MRM 色谱 图 图C.5 空 白肝 的 MRM 色 谱图 标引序号 说明： 1- 茄碱； 2- 卡茄碱； 3- 美替诺龙醋酸酯 。 图C.6 添加 肝中-茄碱 （4ng/g）、 - 卡茄 碱 （4ng/g ） 及美替 诺龙 醋酸 酯（50ng/g）的MRM 色 谱图 _