SN T 3559-2021 国境口岸裂谷热病毒检测方法.pdf

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1、以正式出版文本为准 SN/T 3559 2021 代替 SN/T 35592013 国境口岸裂谷热病毒检测方法 Detecting methods on Rift Valley fever virus at frontier ports 2021-06-18 发布 2022-01-01 实施 ICS 11. 020 CCS C 62 中华人民共和国海关总署发 布 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 SN/T 3559 2021 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规 定起草。 本文件

2、代替 SN/T 35592013裂谷热病毒 RT-PCR 和实时荧光 RT-PCR 检测方法。本文件与 SN/T 35592013 相比，除结构调整和编辑性改动外，主要技术变化如下： 增加了裂谷热病毒一步法核酸检测技术及具体流程； 增加了裂谷热病毒环介导恒温扩增检测技术及具体流程； 术语和定义中增加了对实时荧光 RT-PCR、一步法核酸检测技术、环介导恒温扩增技术等定义； 明确 PCR 防污染措施按 WS/T 230 的规定执行； 增加了附录 B 阳性对照序列，对各方法所采用的阳性序列进行了说明。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国广州海关、中国检验检疫

3、科学研究院。 本文件主要起草人：戴俊、李小波、吕洁毅、郑夔、师永霞、相大鹏、洪烨、袁帅、孙芳芳、 黄树详、刘丽娟、黄吉城。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 1 SN/T 3559 2021 国境口岸裂谷热病毒检测方法 1 范围 本文件规定了国境口岸裂谷热病毒检测的生物安全要求，样本的采集、运输、保存、前处理及 多种具体检测方法。 本文件适用于国境口岸出入境人员感染或媒介蚊虫携带裂谷热病毒的核酸检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引 用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修

4、改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 WS/T 230 临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用 人间传染的病原微生物名录（中华人民共和国卫生部 卫科教发200615 号） 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 裂谷热病毒 Rift Valley fever virus 一种RNA病毒，属布尼亚病毒科（ Bunyaviridae）白蛉热病毒属（ Phlebovirus），含单链 RNA 基因组，由 L、M 及 S 三个亚单位组成。裂谷热病毒目前仅有一个血清型，被笼统分为北非、 西非、中东非 3 个群。 3.2 逆转录聚合发酶 reverse tran

5、scription ploy merase chain reaction; RT-PCR 聚合酶链式反应（PCR）的一种广泛应用的变形。在 RT-PCR 中，由一条 RNA 单链转录为互 补 DNA（cDNA）称作“逆转录”，由依赖 RNA 的 DNA 聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA 的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的 PCR。原先的 RNA 模板被 RNA 酶降解，留下互补 DNA。 3.3 实时荧光 RT-PCR real-time fluorescence RT-PCR 实时荧光 RT-PCR 方法是在常规 RT-PCR 的基础上

6、，加入一条特异性的荧光探针。该探针为 一段寡聚核苷酸，两端分别标记 1 个荧光报告基团和 1 个荧光淬灭基团。探针完整时，报告基团 发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时，利用 Taq 酶的 5 null-3null 外切酶活性将探针酶切降解， 使报告基团和淬灭基团分离，从而使荧光监测系统可以接收到荧光信号。 以正式出版文本为准 2 SN/T 3559 2021 3.4 一步法核酸检测技术 one-step nucleic acid detection method 不需经过样本前处理、核酸提取、纯化等步骤，采用通用型一步法核酸（RNA）检测试剂盒 或等效产品，加入检测样本、病毒特异性引

7、物和探针进行检测，实现将临床样本直接加到反应体 系中进行实时荧光 RT-PCR 检测的方法。 3.5 环介导恒温扩增技术 loop-mediated isothermal amplification method; LAMP 一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的 6 个区域设计 4 种特异引物，在链置换 DNA 聚合酶（Bst DNA polymerase）的作用下，60 65 恒温扩增，15 min60 min 左右即可 实现 10 9 10 10 倍的核酸扩增，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BLAST ：是一套在蛋白质数据库或 DN

8、A 数据库中进行相似性比较的分析工具，采用一种局 部的算法获得两个序列中具有相似性的序列。 Ct 值：在实时荧光 RT-PCR 中，每个反应管内荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。 FAM ：6- 羧基 - 荧光素，一种荧光报告基团。 RNA ：核糖核酸。 5检测对象 5.1国境口岸疑似感染裂谷热病毒的出入境人员或疑似携带裂谷热病毒的媒介蚊虫。 5.2其他申请检验的人员或媒介蚊虫。 6生物安全和 PCR 防污染要求 6.1生物安全要求 按照 GB 19489 和人间传染的病原微生物名录的要求，裂谷热病毒检测相关生物安全要求如下： 裂谷热病毒危害程度分类为第二类； 裂谷热病毒培养应在生物安全

9、三级（BSL-3）实验室进行； 未经培养的裂谷热病毒感染性材料的操作应该在生物安全二级（BSL-2）实验室进行； 裂谷热病毒相关的灭活材料和无感染性材料操作可在生物安全一级（BSL-1）实验室进行； 裂谷热病毒感染性材料运输和包装分为 A 类，UN 编号为 UN 2814。 6.2PCR 防污染要求 PCR 防污染措施按照 WS/T 230 确定的规定执行。 7主要仪器 7.1 荧光定量 PCR 仪。 7.2 PCR 扩增仪。 以正式出版文本为准 3 SN/T 3559 2021 7.3 超净工作台。 7.4 IIA 级生物安全柜。 7.5 电泳仪。 7.6 水平电泳槽。 7.7 凝胶成像系统

10、。 7.8 千分之一天平。 7.9 高压灭菌器。 7.10 -70 超低温冰箱（或液氮罐）。 7.11 台式高速低温离心机（带密封的离心安全杯），最大离心力 20 000 g。 7.12 涡旋振荡器。 7.13 微量移液器。 7.14 计时器。 7.15 水浴锅、金属浴。 8主要试剂 8.1实时荧光 RT-PCR 法使用试剂 8.1.1 核酸提取试剂：美国 Qiagen 公司 QIAamp Viral RNA Kit 1） 。 a 8.1.2 实时荧光 RT-PCR 通用试剂：美国 Ambion 公司 Ag-Path-ID TM One step RT-PCR Kit 1） 。 8.1.3 无

11、 RNA 酶的 DEPC 水。 8.1.4 引物和探针：引物和探针序列见表 1。 表 1 裂谷热病毒实时荧光 RT-PCR 检测的引物和探针 引物 / 探针名称 序列（5 null-3null） 扩增片段 RVF-qFP ATTCCTGAGACACATGGCAT 86 bpRVF-qRP CACTTCCTTGCATCATCTGA RVF-qPro FAM- CACAAGTCCACACAGGCCCCTTACATTBHQ1 注： 探针的 5 null 端标记的是 FAM 荧光报告基团，3 null 端标记的是 BHQ1 荧光淬灭基团。其他等效荧光标记物和淬 灭基团或等效的引物和探针或其他等效的商品

12、化检测试剂盒也可使用。 8.2RT-PCR 法使用试剂 除另有规定外，所有试剂均采用分析纯。 8.2.1 核酸提取试剂：见 8.1.1。 8.2.2 RT-PCR 试剂：美国 Qiagen 公司 One step RT-PCR kit 1） ； 8.2.3 无 RNA 酶的 DEPC 水。 8.2.4 电泳缓冲液（TAE），配方见附录 A。 8.2.5 溴化乙锭（EB，有毒有害物质，操作需谨慎）：10 mg/mL，使用浓度为 0.5 g/mL，配方见 附录A； 8.2.6 引物：本方法设计两对引物序列，分别对裂谷热病毒核酸的 S 基因序列和 L 基因序列进行 1）由指定单位提供，给出这一信息是

13、为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产 品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 以正式出版文本为准 4 SN/T 3559 2021 检测。引物序列见表 2，可选用其中一对引物进行 RT-PCR 扩增。 表 2 裂谷热病毒 RT-PCR 检测的引物序列 引物 / 探针名称 序列（5 null-3null） 扩增片段 RVF-SPF CTGAACATCTGGGATTGGAG S 基因片段，预期扩增大小为 635 bp RVF-SPR CCCTGTTGTGTCTTTCTCAT RVF-LPF GGATCACATATCTGAATTTCTCTCT L 基因片段，预期扩增大小为

14、 564 bp RVF-LPR CAAGTCACCAACAAAGTTCCAG 8.3一步法核酸检测技术使用试剂 本方法使用的主要试剂如下： 8.3.1 一步法实时荧光 RT-PCR 试剂盒，如卡尤迪通用型一步法核酸（RNA）检测试剂盒 1） 。 a 8.3.2 引物和探针：同表 1。 8.4环介导恒温扩增技术使用试剂 8.4.1 核酸提取试剂：同 8.1.1。 8.4.2 商品化试剂，如 WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix（DNA & RNA） 1） 。 8.4.3 引物：引物序列见表 3。 表 3 裂谷热病毒环介导恒温扩增技术的引物序列 引物

15、/ 探针名称 序列（5 null-3null） RVF-F3 TTCTTTGCTTCTGAYACCCT RVF-B3 CATTGARCATCCCCTAATGAT RVF-FIP CTGATGTTGCACAAGTCCACATTTTCCTGAGACACATGGCAT RVF-BIP TGATGCAAGGAAGTGGAACCAATTTAGGAGAGGTGAACTCACA RVF-LF CAGGCCCCTTACATTGC RVF-LB CAAAGTTTGCCCTCATGCT 9样本的采集、保存、运输与处理 9.1样本采集 9.1.1人血清样本 无菌采集疑似裂谷热病毒感染病例发病4 d内静脉血3 mL5

16、 mL，室温静置30 min使其凝固， 500 g 离心 10 min，收集血清放置于 2 mL 无菌螺口塑料管中，用耐低温油性记号笔登记编号。 1）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产 品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 以正式出版文本为准 5 SN/T 3559 2021 9.1.2媒介蚊虫样本 将收集于集蚊袋中的蚊虫连同集蚊袋一起置于 -20 冰箱 1 h 以上，冻死蚊虫，取出，分类 编号，按 30 只50 只一组装入 2 mL 无菌螺口塑料管内，旋紧管盖。 9.2样本保存与运输 9.2.1样本保存 采集的待测血清样本可保存于

17、 4 中立即送到实验室检测，如 24 h 内不能送到实验室检测， 应将血清置于 -70 冰箱中保存，避免反复冻融。采集的待测蚊虫样本应置于液氮、干冰或 -70 冰箱中保存。 9.2.2样本运输 待测血清样本应置于 4 生物安全运输箱中，包装按本标准第 6 章生物安全和 PCR 防污染要求 执行，由专人专车运输。蚊虫样本运输也应在液氮或干冰条件下进行，以防止其体内病毒核酸降解。 9.3样本处理 9.3.1样本前处理 9.3.1.1人血清样本 人血清样本可直接进行核酸提取，如 24 h 内不能及时检测应存放在 -70 冰箱中。使用一 步法核酸检测技术开展检测时不必提取核酸。 9.3.1.2媒介蚊虫

18、样本 从液氮、干冰或 -70 冰箱中取出媒介蚊虫样本，迅速置于预冷玻璃研磨管中，加入 1 mL Hanks 液吹洗一次，弃去 Hanks 液，加入预冷的 0.5 mL 样本处理液（样本处理液配方见附录 A）， 反复研磨至组织碎片基本消失，然后迅速将研磨液吸入 1.5 mL 无菌离心管中，置低温离心机中， 4 10 000 g 离心 10 min。取上清液进行核酸提取。媒介蚊虫样本检测不宜使用一步法核酸检测 技术。 9.3.2核酸提取 用本标准列举的商品化试剂盒或其他等效产品提取病毒核酸，提取方法详见试剂盒说明书。 10检测方法 10.1实时荧光 RT-PCR 法 10.1.1反应体系组成 裂谷

19、热病毒实时荧光 RT-PCR 法反应总体系为 20 L，见表 4。 以正式出版文本为准 6 SN/T 3559 2021 表 4 裂谷热病毒实时荧光 RT-PCR 法反应体系 成分 体积 / nullL 5RT-PCR 缓冲液（试剂盒提供） 10 20 mmol/L RVF-qFP 1 20 mmol/L RVF-qRP 1 10 mmol/L RVF-qPro 1 RT-PCR 酶混合液（试剂盒提供） 0.8 模板 RNA/ 阴性对照 / 阳性对照 6.2 注： 每组实验另各设一个阴性对照和阳性对照。阳性对照模板为根据裂谷热病毒核苷酸序列体外转录的 RNA 片段（序列见附录 B），阴性对照模

20、板为不含裂谷热病毒核酸的标本或无 RNA 酶的 DEPC 水。 10.1.2实时荧光 RT-PCR 扩增反应 在不同的荧光定量PCR仪上，TaqMan探针实时荧光RT-PCR的反应条件略有不同。以 Roche LightCycler 或 ABI 7900HT 荧光定量 PCR 仪为例，实时荧光 RT-PCR 检测扩增程序为： 50 10 min，95 10 min ；95 5 s，60 30 s（收集荧光信号），共 45 个循环。如使用其他 仪器，应根据其他仪器的要求设置具体的反应条件。 10.1.3检验结果判断及报告 10.1.3.1阈值确定 阈值确定的方法对所有的样品都是统一的，一般是以荧

21、光 PCR 反应的前 3 个 15 个循环的 荧光信号作为荧光本底信号，以本底信号标准差的 10 倍作为荧光阈值，以样品扩增产生的荧光 信号达到荧光阈值时所对应的循环数为循环阈值（Ct 值）。 10.1.3.2质量控制 反应结果应同时符合以下 2 个条件： 阴性对照无扩增曲线； 阳性对照 Ct 值小于等于 35 并有明显扩增曲线。 10.1.3.3结果判断及报告 当同时进行的阳性对照和阴性对照试验结果正常，本方法检验结果判定及报告如下： 无明显扩增曲线，判为阴性，报告“未检出裂谷热病毒特异性基因（实时荧光 RT-PCR 法）”； 有明显扩增曲线，且 Ct 值小于等于 40，报告“检出裂谷热病毒

22、特异性基因（实时荧光 RT-PCR 法）”； 有明显扩增曲线，且Ct值大于40小于等于45的标本应重新检测。重新检测后按 10.1.3.3 结果判断及报告进行判断。如仍为有明显扩增曲线，且 Ct 值大于 40 小于等于 45 的，应使用其他方法进行复测。 10.2RT-PCR 法 10.2.1反应体系组成 裂谷热病毒 RT-PCR 法反应总体系为 50 L，见表 5。 以正式出版文本为准 7 SN/T 3559 2021 表 5 裂谷热病毒 RT-PCR 法反应体系 成分 体积 / nullL 无 RNA 酶的 DEPC 水 26 5RT-PCR 缓冲液（试剂盒提供） 10 20 null m

23、ol/L RVF-SPF/RVF-LPF 2.5 20 null mol/L RVF-SPR/RVF-LPR 2.5 10 mmol/L dNTP 2 RT-PCR 酶混合液（试剂盒提供） 2 模板 RNA/ 阴性对照 / 阳性对照 5 注： 每组实验另各设一个阴性对照和阳性对照。阳性对照模板为根据裂谷热病毒核苷酸序列体外转录的 RNA 片段（序列见附录 B），阴性对照模板为不含裂谷热病毒核酸的标本或无 RNA 酶的 DEPC 水；扩增 S 基因 片段用引物对 RVF-SPF 和 RVF-SPR，扩增 L 基因片段用引物对 RVF-LPF 和 RVF-LPR。 10.2.2 RT-PCR 反应

24、 将 PCR 反应管置于 PCR 扩增仪上进行操作，RT-PCR 反应程序为：50 30 min，95 15 min ； 94 30 s，50 30 s，72 1 min，共 35 个循环，72 10 min，4 保存。 10.2.3凝胶电泳 扩增结束后，在 5 mL 扩增产物中加入 1 mL 6DNA 上样缓冲液，用含 0.5 nullg/mL 溴化乙锭 （有毒有害物质，操作需谨慎）的 1.0 % 琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，用凝胶成像系统照相记 录结果。电泳缓冲和溴化乙锭的配制方法见附录 A。 10.2.4结果判断 10.2.4.1质量控制 反应结果应同时符合以下 2 个条件： 阴性对照未

25、出现特异性条带； 阳性对照出现预期 635 bp 或 564 bp 大小的扩增条带。 10.2.4.2结果判断及报告 当同时进行的阳性对照和阴性对照试验结果正常，本方法检验结果判定及报告如下： 如待测样品中未出现预期大小的扩增产物，判为阴性，报告“未检出裂谷热病毒特异性 基因（RT-PCR 法）”； 如待测样品检测结果出现预期 635 bp 大小的 S 基因扩增条带，或检测结果出现 564 bp 大小的 L 基因扩增条带，判为阳性，报告“检出裂谷热病毒特异性基因（RT-PCR 法）”。 10.2.4.3核酸序列测定 判为阳性，报告“检出裂谷热病毒特异性基因（RT-PCR 法）”的样品，可将扩增

26、产物进行核 酸序列测定，确定其碱基组成。使用BLAST工具分析其与已公布的裂谷热病毒核酸序列的同源性， 进一步确认扩增产物是否为裂谷热病毒核酸。 以正式出版文本为准 8 SN/T 3559 2021 10.3一步法核酸检测技术 10.3.1反应体系组成 裂谷热病毒一步法核酸检测技术反应总体系为 50 L，见表 6。 表 6 裂谷热病毒一步法核酸检测技术反应体系 成分 体积 / nullL 无 RNA 酶的 DEPC 水 11 RT-PCR 反应液（试剂盒提供，成分配比具体为 Tris-HCl 200 mmol/L、KCl 150 mmol/L、MgCl 2 8 mmol/L、 dNTP 1.2

27、 mM，用无 RNA 酶的 DEPC 水混合至 30 nullL） 30 20 null mol/L RVF-qFP ：20 null mol/L RVF-qRP ：10 null mol/L RVF-qPro ：RNase-free ddH 2 O 混合液（1 : 1 : 1 : 3） 5 酶混合液（试剂盒提供，成分配比具体为 Taq DNA polymerase 5 U/ nullL：Reverse Transcriptase 5 U/ nullL，1 : 1 混合） 2 模板 RNA/ 阴性对照 / 阳性对照 2 注： 每组实验另各设一个阴性对照和阳性对照。阳性对照模板为根据裂谷热病毒核

28、苷酸序列体外转录的 RNA 片段（序列参见附录 B），阴性对照模板为不含裂谷热病毒核酸的标本或无 RNA 酶的 DEPC 水。 10.3.2反应条件 在不同的荧光定量 PCR 仪上， Taq Man 探针实时荧光 RT-PCR 的反应条件略有不同。以 ABI 7500 荧光定量 PCR 仪或卡尤迪 Mini8 Plus 实时荧光定量 PCR 仪为例，一步法实时荧光 RT-PCR 检测扩增程序如下：42 5 min 1 个循环；95 5 s，45 5 s ，15 个循环；95 5 min 1 个循 环；95 5 s，50 30 s（收集荧光），40 个循环。实验室可根据所使用的不同试剂和仪器参考

29、 上述反应条件作适当调整。 10.3.3检验结果判断及报告 10.3.3.1阈值确定 阈值确定的方法对所有的样本都是统一的，一般是以实时荧光 PCR 反应的前 3 个 15 个循环 的荧光信号作为荧光本底信号，以本底信号标准差的 10 倍作为荧光阈值，以样本扩增产生的荧 光信号达到荧光阈值时所对应的循环数为循环阈值（Ct 值）。 10.3.3.2质量控制 反应结果应同时符合以下 2 个条件： 阴性对照无扩增曲线； 阳性对照 Ct 值小于等于 35 并有明显扩增曲线。 10.3.3.3结果判断及报告 当同时进行的阳性对照和空白对照试验结果正常，本方法检验结果判定及报告如下： 检测样本无明显扩增曲

30、线，判为阴性，报告“未检出裂谷热病毒特异性基因（一步法核 酸检测技术）”； 检测样本有明显扩增曲线，且 Ct 值小于等于 33，判为阳性，报告“检出裂谷热病毒特 异性基因（一步法核酸检测技术）”； 以正式出版文本为准 9 SN/T 3559 2021 检测样本有明显扩增曲线，且Ct值大于33小于等于40的标本应重新检测。重新检测后按 10.3.3.3 结果判断及报告进行判断。如仍为有明显扩增曲线，且Ct值大于33小于等于40的， 应使用其他方法进行复测。 10.4环介导恒温扩增技术 10.4.1反应体系组成 裂谷热病毒环介导恒温扩增技术反应总体系为 25 L，见表 7。 表 7 裂谷热病毒 L

31、AMP 恒温扩增法反应体系 成分 体积 / nullL 无 RNA 酶的 DEPC 水 8 2LAMP 反应液（试剂盒提供） 12.5 10引物混合物（其中 RVF-FIP、RVF-BIP 终浓度 1.6 nullmol/L，RVF-F3、RVF-B3 终浓度 0.2 nullmol/L， RVF-LF、RVF-LB 终浓度 0.4 nullmol/L） 2.5 模板 RNA/ 阴性对照 / 阳性对照 2 注： 每组实验另各设一个阴性对照和阳性对照。阳性对照模板为根据裂谷热病毒核苷酸序列体外转录的 RNA 片段（序列见附录 B），阴性对照模板为不含裂谷热病毒核酸的标本或无 RNA 酶的 DEP

32、C 水；配置好反应 体系后每管加入 20 L 密封液（液体石蜡），如使用有热盖的 PCR 仪则可免加。 10.4.2反应程序 盖上管盖，使用低温离心机短暂离心后置于水浴锅、金属浴或 PCR 扩增仪上 65 反应 30 min。 10.4.3检验结果判断及报告 10.4.3.1质量控制 反应结果应同时符合以下 2 个条件： 阴性管内反应液呈粉红色； 阳性管内反应液呈黄色。 10.4.3.2结果判断与报告 取出已经完成反应的反应管，根据反应管内反应液颜色变化判断实验结果。 当同时进行的阳性对照和空白对照试验结果正常，本方法检验结果判定及报告如下： 管内反应液呈粉红色，判为阴性，报告“未检出裂谷热病

33、毒特异性基因（LAMP 法）”； 管内反应液呈黄色，判为阳性，报告“检出裂谷热病毒特异性基因（LAMP 法）”。 以正式出版文本为准 10 SN/T 3559 2021 附录A （资料性） 试剂的配制方法 A.1样本处理液 按 200 mL 量计：在新鲜配制的 190 mL Eagle nulls MEM 中加入 4 mL 56 热灭活 30 min 的胎 牛血清、2 mL 庆大霉素（5 000 g/mL）、2 mL 两性霉素 B（250 g/mL）和 2 mL 青链霉素（青霉 素 G 10 000 U/mL、链霉素 10 000 g/mL），用 7.5% 碳酸氢钠溶液调至 pH 7.2。 A

34、.2电泳缓冲液 TAE 配 方： 称 取 242 g Tris 碱， 溶 于 700 mL 的 ddH 2 O 中， 加 入 100 mL 0.5 mol/L EDTA （pH 8.0）、57.1 mL 冰乙酸，至充分溶解后用水定容至 1 L，室温储存。使用前用 ddH 2 O 稀释至 1TAE 进行倒胶和 DNA 电泳。 A.3溴化乙锭 10 mg/L 溴化乙锭（EB，有毒有害物质，操作需谨慎）：在 100 mL 水中加入 1 g 溴化乙锭，用 磁力搅拌器搅拌数小时以确保其完全溶解，然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中，室温储存。 以正式出版文本为准 11 SN/T 3559 2021 附录B

35、 （资料性） 阳性对照序列 B.1荧光 RT-PCR 法及一步法核酸检测法阳性对照核酸序列 attcctgagacacatggcattagggctcggaagcaatgtaaggggcctgtgtggacttgtgcaacatcagatgatgcaaggaagtg B.2RT-PCR 法阳性对照核酸序列 B.2.1L 片段 ggatcacatatctgaatttctctctgcatgctctagtgacttgtgggcaacagatgaagacctgtataaccctctctcttgtgataaagagctcagg ttggcagcccagagaattcatcagccatccttatcagaa

36、aggggcttcaatgagatcataacagagcactacaaatttatggggagtagaataggttca tggtgtcaaatggttagtctgataggagctgagttatcagcttctgtaaagcaacatgtcaagcctaactattttgtaattaaacgactattaggttctggg atttttttgctgattaagcccacttccagcaaaagccatatatttgtgtctttcgcaatcaagcgctcttgctgggcctttgatctctccacttccagggttttc aagccctacatagatgctggggatctgtta

37、gttactgactttgtttcttacaaactaagtaagcttactaacctctgcaagtgcgtttcattaatggagtcct ctttctcattttgggcagaagcatttggaattccaagctggaactttgttggtgacttg B.2.2S 片段 ctgaacatctgggattggaggaacaactggaatccagttgtttctccccatcatgctaggaagtgatgagcgcagcatcaggctctcctccataa gagcaatgagggctgagtttggaactacagcattagaaatgtcctcttttgctgcctgca

38、gaagccgaacacactggacgtgagcaacctcatacatga ggtcaaagcctggcaacaggcacagatcaatccctctgagaatagcctcagtcactatcatcctgtgtaagccaacaaaggagtcttccagatcattg gtaatcttgcagctcctcattgctagagtggcaatctgatcccttctaatgtcatcattcctgtgcactctagtagagcttaggtcaaagaaggccaggga gggttctccaagaggccaggatatggcttctttcagattggggaatcttgtgaaatcac

39、taagagtcatatggcctattagatcaataagtctctgaaaag gctttgctggtggaggtgcaacgtttgatgcaaagtctccaagtccgactcggtacgggaattctccgacattgtagaaatcagaaaatcgcaagcgaa cctcgtgactaggacgatggtgcatgagaaagacacaacaggg B.3LAMP 法阳性对照核酸序列 ttctttgcttctgataccctctgtaacccccccaataaggtaaaaattcctgagacacatggcattagggctcggaagcaatgtaaggggcctgt

40、 gtggacttgtgcaacatcagatgatgcaaggaaatggaaccaaggccattttgttacaaagtttgccctcatgctatgtgagttcacctctcctaagtggt ggccactgatcatcaggggatgttcaatg 以正式出版文本为准 SN/T 3559 2021 中华人民共和国出入境检验检疫 开本 8801230 1/16 印张 1 字数 28 千字 2021 年 7 月第一版 2021 年 7 月第一次印刷 印数 1500 书号：15517550 定价 16.00 元 国境口岸裂谷热病毒检测方法 行 业 标 准 SN/T 35592021 * * * 北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023） 编辑部：（010）65194242-7531 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 中国海关出版社有限公司出版发行 网址