DB53 T 1059.3-2021 滇金丝猴检疫技术 第3部分：隐孢子虫实验室检测技术规范.pdf

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1、ICS 11.220ICS B 41 53云 南 省 地 方 标 准DB53/T 1059.3 2021滇 金 丝 猴 检 疫 技 术第 3部 分 ： 隐 孢 子 虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范 Quarantine technique for Rhinopithecus bietiPart 3:Technical specifications for laboratory examination of Cryptosporidium 2021 -09- 30发 布 2021- 10-14实 施云 南 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布 DB53/T 1059.32021 I 目

2、次前 言 .III引 言 .1 范 围 .12 规 范 性 引 用 文 件 .13 术 语 和 定 义 .14 缩 略 语 .25 试 验 原 理 .26 试 验 条 件 .2 6.1 实 验 室 通 用 要 求 .26.2 采 样 人 员 要 求 .27 仪 器 设 备 和 试 剂 .27.1 仪 器 设 备 .27.2 试 剂 .28 样 品 .38.1 采 样 要 求 .38.2 粪 样 的 选 取 原 则 .38.3 采 样 程 序 .38.4 样 品 的 保 存 与 运 输 .39 试 验 步 骤 .3 9.1 形 态 学 检 测 .49.2 巢 式 PCR检 测 .410 试 验

3、数 据 处 理 .5附 录 A（ 规 范 性 ） 粪 样 的 采 集 信 息 表 .6附 录 B（ 规 范 性 ） 巢 式 PCR反 应 .7 DB53/T 1059.32021 III 前 言本 文 件 按 照 GB/T 1.1-2020 标 准 化 工 作 导 则 第 1部 分 ： 标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定 起草 。 本 文 件 是 DB53/T 1059 滇 金 丝 猴 检 疫 技 术 的 第 3部 分 。 DB53/T 1059已 经 发 布 了 以 下 部 分 ： 第 1 部 分 ： 产 气 荚 膜 梭 菌 实 验 室 检 测 技 术 规 范 ；

4、 第 2 部 分 ： 毛 首 线 虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范 ； 第 3 部 分 ： 隐 孢 子 虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范 ； 第 4 部 分 ： 志 贺 杆 菌 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。请 注 意 本 文 件 的 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利 。 本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 专 利 的 责 任 。本 文 件 由 云 南 省 林 业 与 草 原 局 、 云 南 省 市 场 监 督 管 理 局 共 同 提 出 。 本 文 件 由 云 南 省 林 业 标 准 化 技 术 委 员 会 （ YNTC02） 归 口 。本 文 件

5、主 要 起 草 单 位 ： 云 南 农 业 大 学 、 云 南 省 标 准 化 研 究 院 、 昆 明 动 物 园 、 云 南 省 动 物 卫 生 监 督 所 。本 文 件 主 要 起 草 人 ： 杨 建 发 、 黄 艳 梅 、 衡 昭 君 、 杨 俊 、 邹 丰 才 、 李 迅 、 陈 培 富 、 宋 海 洋 、 张 誉 方 、蒙 英 雯 、 李 云 乔 、 朱 尤 帅 。 DB53/T 1059.3 2021 引 言滇 金 丝 猴 （ Rhinopithecus bieti） 是 中 国 特 有 珍 稀 濒 危 灵 长 类 动 物 ， 属 于 国 家 级 重 点 保 护 野 生动 物 ，

6、列 入 世 界 自 然 保 护 联 盟 （ IUCN） 濒 危 物 种 红 色 名 录 。 编 制 并 发 布 DB53/T 1059 滇 金 丝 猴 检疫 技 术 地 方 标 准 ， 推 进 滇 金 丝 猴 疫 病 诊 断 的 标 准 化 和 规 范 化 ， 指 导 从 事 野 生 动 物 保 护 相 关 的 专 业 人 员按 规 范 程 序 实 施 对 滇 金 丝 猴 相 关 病 原 的 实 验 室 检 测 ， 为 滇 金 丝 猴 的 科 学 研 究 和 保 护 工 作 提 供 病 原 或 疫 病调 查 的 基 础 数 据 ， 为 滇 金 丝 猴 检 疫 、 疫 病 监 测 和 防 治 提

7、 供 重 要 的 参 考 依 据 ， 促 进 滇 金 丝 猴 繁 育 和 扩 群 ，维 护 地 区 物 种 与 生 态 平 衡 ， 提 升 生 物 多 样 性 保 护 成 效 。本 文 件 已 发 布 4个 部 分 ： 第 1 部 分 ： 产 气 荚 膜 梭 菌 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。 本 部 分 从 产 气 荚 膜 梭 菌 实 验 室 检 测 技 术 的 总 则 、产 气 荚 膜 梭 菌 分 型 、 仪 器 设 备 和 试 剂 、 样 品 、 试 验 步 骤 、 试 验 数 据 处 理 等 方 面 制 定 了 规 范 ； 第 2 部 分 ： 毛 首 线 虫 实 验 室 检 测

8、 技 术 规 范 。 本 部 分 从 毛 首 线 虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范 的 试 验 原 理 、试 验 条 件 、 仪 器 设 备 和 试 剂 、 样 品 采 集 与 保 存 、 试 验 步 骤 、 试 验 数 据 处 理 等 方 面 制 定 了 规 范 ； 第 3 部 分 ： 隐 孢 子 虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。 本 部 分 从 隐 孢 子 虫 实 验 室 检 测 技 术 的 试 验 原 理 、 试验 条 件 、 仪 器 设 备 和 试 剂 、 样 品 、 试 验 步 骤 、 试 验 数 据 处 理 等 方 面 制 定 了 规 范 ； 第 4 部 分 ： 志

9、 贺 杆 菌 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。 本 部 分 从 志 贺 杆 菌 实 验 室 检 测 技 术 涉 及 的 总 则 、 志贺 杆 菌 分 类 、 仪 器 设 备 和 试 剂 、 样 品 、 试 验 步 骤 、 试 验 数 据 处 理 等 方 面 制 定 了 规 范 。 DB53/T 1059.32021 1 滇 金 丝 猴 检 疫 技 术第 3 部 分 ： 隐 孢 子 虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范重 要 提 示 ： 本 文 件 涉 及 人 兽 共 患 病 原 体 的 操 作 ， 应 在 符 合 国 家 相 关 生 物 安 全 规 定 （ GB 19489和NY/T

10、541） 的 条 件 下 进 行 。1 范 围本 文 件 规 定 了 滇 金 丝 猴 （ Rhinopithecus bieti） 检 疫 技 术 中 隐 孢 子 虫 实 验 室 检 测 技 术 的 试 验 原 理 、 试验 条 件 、 仪 器 设 备 和 试 剂 、 样 品 、 试 验 步 骤 、 试 验 数 据 处 理 。本 文 件 适 用 于 滇 金 丝 猴 检 疫 技 术 中 隐 孢 子 虫 实 验 室 检 测 。 2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款 。 其 中 ， 注

11、 日 期 的 引 用 文 件 ，仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件 ； 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 改 单 ） 适 用 于 本文 件 。GB 19489 实 验 室 生 物 安 全 通 用 要 求GB/T27401 实 验 室 质 量 控 制 规 范 动 物 检 疫NY/T 541 兽 医 诊 断 样 品 采 集 、 保 存 与 运 输 技 术 规 范3 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件 。 3.1 隐 孢 子 虫 Cryptosporidium顶 复 门 孢 子 虫 纲 真

12、 球 虫 目 隐 孢 子 虫 科 隐 孢 子 虫 属 。 主 要 寄 生 于 动 物 的 肠 上 皮 细 胞 ， 可 引 起 隐 孢 子 虫病 。 隐 孢 子 虫 卵 囊 是 其 感 染 阶 段 ， 卵 囊 圆 形 或 椭 圆 形 ， 直 径 4 m 6 m， 囊 壁 光 滑 、 无 色 ， 一 个 卵 囊 中含 有 4个 子 孢 子 。 目 前 共 鉴 定 出 9个 隐 孢 子 虫 种 可 以 感 染 非 人 灵 长 类 动 物 。 其 中 ， 微 小 隐 孢 子 虫 （ C.parvum）和 安 氏 隐 孢 子 虫 （ C.andersoni） 感 染 较 普 遍 。3.2 巢 式 PCR

13、 nested polymerase chain reaction利 用 2套 引 物 ， 对 靶 细 胞 基 因 2次 识 别 并 进 行 2轮 扩 增 的 方 法 。 它 可 从 极 少 量 的 模 板 中 获 得 较 高 浓 度和 纯 度 的 靶 片 段 ， 第 1次 扩 增 反 应 的 产 物 被 用 作 第 2次 PCR的 模 板 ， 而 第 2次 反 应 的 寡 核 苷 酸 引 物 对 位 于 第1对 引 物 内 侧 。 DB53/T 1059.32021 2 4 缩 略 语下 列 缩 略 语 适 用 于 本 文 件 。bp： 碱 基 对 Base PairdNTPs： 脱 氧 核

14、 苷 三 磷 酸 混 合 液 Deoxyribonucleoside Triphosphates MixtureDNA： 脱 氧 核 糖 核 酸 Deoxyribonucleic AcidPCR： 聚 合 酶 链 式 反 应 Polymerase Chain ReactionTAE： Tris-乙 酸 电 泳 缓 冲 液 Tris Acetate-EDTA BufferBLAST： 基 于 局 部 序 列 比 对 算 法 的 搜 索 工 具 Basic Local Alignment Search Tool5 试 验 原 理隐 孢 子 虫 卵 囊 没 有 孢 子 囊 ， 有 4个 子 孢 子

15、， 该 形 态 特 征 与 其 他 孢 子 虫 的 卵 囊 明 显 不 同 。 依 据 该 特 征 可 进 行 隐 孢 子 虫 的 形 态 分 类 学 鉴 定 。 对 于 形 态 学 鉴 定 存 疑 的 物 种 ， 采 用 分 子 生 物 学 方 法 进 一 步 确 定 。6 试 验 条 件6.1 实 验 室 通 用 要 求实 验 室 应 满 足 GB 19489中 生 物 安 全 实 验 室 的 要 求 。6.2 采 样 人 员 要 求采 样 和 试 验 人 员 应 具 有 相 应 的 专 业 知 识 。 采 样 过 程 中 的 生 物 安 全 要 求 应 符 合 GB/T 27401的 要

16、 求 。7 仪 器 设 备 和 试 剂 7.1 仪 器 设 备7.1.1 微 量 移 液 器 ： 10 L、 50 L、 200 L、 1 000 L， 微 量 移 液 器 枪 头 若 干 。7.1.2 振 荡 器 。7.1.3 正 置 光 学 显 微 镜 。7.1.4 载 玻 片 及 盖 玻 片 若 干 。7.1.5 落 地 式 低 速 离 心 机 ： 3 000 r/min。7.1.6 玻 璃 棒 、 接 种 环 、 烧 杯 （ 或 塑 料 杯 ） 、 金 属 筛 （ 40目 ） 、 离 心 管 。7.1.7 电 子 天 平 ： 感 量 为 0.001 g。7.1.8 高 速 台 式 离

17、心 机 ： 12 000 r/min。7.1.9 恒 温 水 浴 锅 ： 36 1 ， 65 1 。7.1.10 PCR扩 增 仪 。7.1.11 电 泳 系 统 。 7.1.12 微 波 炉 。7.1.13 凝 胶 成 像 系 统 。7.2 试 剂7.2.1 商 品 化 DNA提 取 试 剂 盒 。 DB53/T 1059.32021 3 7.2.2 商 品 化 PCR分 子 扩 增 使 用 试 剂 ， 包 含 有 dNTPs、 10 buffer(Mg2+ free)、 Mg2+、 rTaq酶 。7.2.3 DL 2 000 DNA Marker。7.2.4 琼 脂 糖 粉 。7.2.5

18、电 泳 缓 冲 液 。7.2.6 商 品 化 核 酸 染 料 。7.2.7 6倍 上 样 缓 冲 液 （ 6 Loading Buffer） 。7.2.8 引 物 ： 基 于 隐 孢 子 虫 核 糖 体 小 亚 基 RNA基 因 （ SSU rRNA） 设 计 引 物 。7.2.9 饱 和 蔗 糖 水 溶 液 ： 蔗 糖 1 280 g， 蒸 馏 水 1 000 mL， 5%石 碳 酸 21 mL。7.2.10 抗 酸 染 色 液 ： 石 炭 酸 复 红 染 色 液 （ 第 一 液 ） ： 碱 性 复 红 4 g， 95 酒 精 20 mL， 5 石 炭 酸 8 mL，蒸 馏 水 100 mL

19、； 10 硫 酸 溶 液 （ 第 二 液 ） ： 纯 硫 酸 10 mL， 蒸 馏 水 90 mL（ 边 搅 拌 边 将 硫 酸 徐 徐 倾 入 水 中 ） ；20 g/L孔 雀 绿 液 （ 第 三 液 ） ： 20 g/L孔 雀 绿 原 液 1mL， 蒸 馏 水 10 mL。7.2.11 2.5%重 铬 酸 钾 溶 液 ： 重 铬 酸 钾 2.5 g， 加 蒸 馏 水 定 容 至 100 mL。 8 样 品8.1 采 样 要 求8.1.1 采 样 前 ， 准 备 好 采 样 用 具 ， 如 记 录 表 格 、 一 次 性 PE手 套 、 自 封 袋 、 样 品 管 、 镊 子 、 酒 精 喷

20、 壶 、记 号 笔 、 铅 笔 、 标 签 纸 等 。8.1.2 采 样 人 员 应 规 范 穿 戴 全 套 个 人 卫 生 安 全 防 护 装 备 做 好 自 我 防 护 ， 与 样 品 直 接 接 触 的 器 具 均 提 前做 灭 菌 处 理 以 防 样 品 被 污 染 ,应 准 备 垃 圾 袋 带 回 采 样 过 程 中 产 生 的 所 有 废 弃 物 品 。8.1.3 采 样 完 成 后 ， 所 使 用 的 器 械 、 容 器 、 个 人 防 护 用 品 以 及 废 弃 物 等 做 无 害 化 处 理 ， 防 止 环 境 污 染和 造 成 疫 病 传 播 。8.2 粪 样 的 选 取

21、原 则8.2.1 应 采 集 滇 金 丝 猴 新 鲜 粪 样 ， 采 集 同 一 堆 粪 作 为 同 一 份 样 品 ， 分 装 两 管 。 以 滇 金 丝 猴 粪 样 表 面 的 完 整 程 度 、 湿 度 颜 色 以 及 气 味 等 条 件 判 断 滇 金 丝 猴 粪 样 的 新 鲜 程 度 。8.2.2 如 遇 到 滇 金 丝 猴 母 幼 粪 样 ， 应 分 开 采 集 ； 依 据 母 猴 和 幼 猴 的 粪 便 大 小 有 明 显 差 异 作 出 判 断 ， 并在 备 注 栏 记 录 。8.3 采 样 程 序8.3.1 采 集 粪 样 时 ， 应 佩 戴 一 次 性 PE手 套 。 每

22、 次 采 样 后 更 换 新 的 PE手 套 ， 以 避 免 样 品 间 的 交 叉 污 染 。8.3.2 采 集 时 ， 直 接 分 离 新 鲜 粪 样 的 表 层 部 分 和 内 部 部 分 ， 分 别 装 入 样 品 管 ， 贴 上 样 品 标 签 纸 ， 写 上样 品 编 号 ， 并 做 好 样 品 标 记 和 采 样 记 录 。 将 样 品 管 放 入 自 封 袋 ， 密 封 保 存 。8.3.3 同 一 堆 粪 便 应 尽 量 多 取 样 品 。8.3.4 填 写 滇 金 丝 猴 粪 样 采 集 记 录 表 ， 见 附 录 A中 表 A.1， 记 录 好 采 样 信 息 。8.4

23、样 品 的 保 存 与 运 输样 品 分 两 份 保 存 ， 一 份 冷 藏 或 冷 冻 保 存 ， 一 份 置 于 装 有 2.5%重 铬 酸 钾 的 样 品 管 中 保 存 ， 48h内 低 温 运 输 送 到 相 关 实 验 室 4 保 存 ， 进 行 试 验 。9 试 验 步 骤 DB53/T 1059.32021 4 9.1 形 态 学 检 测9.1.1 饱 和 蔗 糖 溶 液 漂 浮 法取 备 检 粪 样 5 g 10 g， 放 在 烧 杯 （ 或 塑 料 杯 ） 内 ,加 入 自 来 水 30 mL， 使 用 玻 璃 棒 搅 拌 均 匀 ， 将 粪水 混 合 物 缓 慢 倒 入

24、40目 金 属 筛 中 过 滤 入 另 一 个 烧 杯 （ 或 塑 料 杯 ） 内 ， 取 滤 液 10 mL置 于 15 mL的 干 燥 离 心管 内 ， 3 000 r/min离 心 3min， 缓 慢 倾 去 上 清 液 ， 保 留 沉 淀 物 ， 向 沉 渣 中 加 入 10 mL饱 和 蔗 糖 溶 液 ， 搅拌 混 匀 ， 3 000 r/min离 心 5min， 使 用 接 种 环 蘸 取 表 面 液 膜 ， 点 样 于 载 玻 片 上 ， 加 盖 玻 片 ， 镜 检 。9.1.2 改 良 抗 酸 染 色 法取 经 上 述 方 法 获 得 的 上 清 液 ， 3 000 r/min

25、离 心 3min后 取 沉 淀 10 L滴 于 载 玻 片 上 ， 涂 片 面 积 适 当且 均 匀 ， 将 粪 膜 置 于 空 气 中 干 燥 ； 滴 加 3 4滴 甲 醇 于 粪 膜 上 ， 自 然 干 燥 后 准 备 进 行 染 色 。 滴 加 3 4滴 抗酸 染 色 液 第 1液 在 粪 膜 上 ， 静 止 5min， 用 蒸 馏 水 缓 慢 冲 洗 ； 逐 滴 滴 加 抗 酸 染 色 液 第 2液 ， 脱 色 5min 10min，载 玻 片 上 样 品 呈 粉 色 ， 用 蒸 馏 水 缓 慢 冲 洗 ； 滴 加 抗 酸 染 色 液 第 3液 ， 复 染 1min后 再 冲 洗 ，

26、待 自 然 干 燥 后 滴 加 适 量 石 蜡 油 ； 置 油 镜 下 观 察 。9.2 巢 式 PCR检 测9.2.1 样 品 的 制 备 及 DNA 提 取将 之 前 收 集 好 的 粪 样 取 出 ， 用 商 品 化 的 粪 样 DNA提 取 试 剂 盒 进 行 DNA提 取 。 样 品 的 DNA提 取 具 体 步 骤按 照 检 测 时 所 用 的 商 品 化 DNA提 取 试 剂 盒 说 明 书 进 行 。9.2.2 DNA的 保 存1周 内 使 用 的 DNA， 可 将 装 有 DNA的 离 心 管 保 存 于 4 冰 箱 中 。 长 期 保 存 的 DNA应 保 存 于 -20

27、冰 箱 中 。9.2.3 巢 式 PCR 扩 增9.2.3.1巢 式 PCR扩 增 引 物 基 于 隐 孢 子 虫 核 糖 体 小 亚 基 RNA基 因 设 计 2对 引 物 ， 引 物 序 列 见 附 录 B中 表 B.1。9.2.3.2巢 式 PCR扩 增 体 系巢 式 PCR扩 增 体 系 见 附 录 B中 表 B.2。9.2.3.3 巢 式 PCR反 应 程 序样 品 DNA在 PCR仪 上 进 行 巢 式 PCR扩 增 的 反 应 程 序 分 为 两 步 进 行 ， 同 时 设 置 阳 性 对 照 和 阴 性 对 照 ： 第 1 步 反 应 程 序 如 下 ： 94 预 变 性 5m

28、in， 94 变 性 45s， 55 退 火 45s， 72 延 伸 1min，循 环 35 次 ， 然 后 72 作 用 10min， 4 存 放 ； 第 2 步 反 应 程 序 如 下 ： 94 预 变 性 5min， 94 变 性 45s， 58 退 火 45s， 72 延 伸 1min，循 环 35 次 ， 然 后 72 作 用 10min， 4 存 放 。9.2.3.4 巢 式 PCR产 物 检 测 巢 式 PCR扩 增 完 成 后 ， 取 5 L第 2轮 PCR产 物 与 1 L 6 Loading Buffer混 合 均 匀 ， 加 入 1%琼 脂 糖 凝胶 孔 中 ， 以 DL

29、 2 000 DNA Marker作 为 参 照 ， 110 V电 压 电 泳 30min。 将 凝 胶 取 出 放 入 紫 外 凝 胶 成 像 分 析系 统 中 观 察 并 拍 照 。 DB53/T 1059.32021 5 9.2.3.5 PCR产 物 测 序 及 分 析经 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 后 阳 性 对 照 、 阴 性 对 照 结 果 成 立 ， 第 2轮 PCR产 物 出 现 大 小 为 830bp左 右 的 目 的 条带 ， 见 附 录 B中 图 B.1， 将 PCR产 物 送 测 序 ， 测 序 结 果 经 BLAST在 线 比 对 分 析 。10 试 验 数 据 处

30、理10.1 形 态 学 检 测 结 果隐 孢 子 虫 无 孢 子 囊 ， 一 个 卵 囊 有 4 个 子 孢 子 ， 其 卵 囊 透 明 无 色 ， 呈 圆 形 或 椭 圆 形 ， 直 径 4 m6 m， 囊 壁 光 滑 无 色 ， 可 见 内 有 一 小 暗 点 或 呈 淡 黄 色 的 子 孢 子 。 经 染 色 后 ， 油 镜 下 观 察 隐 孢 子 虫 卵 囊 为玫 瑰 红 色 ， 子 孢 子 呈 月 牙 形 ， 有 4 个 。10.2 巢 式 PCR检 测 结 果 将 待 测 序 列 与 GenBank中 已 有 的 不 同 种 属 隐 孢 子 虫 虫 种 进 行 比 较 ， 根 据

31、比 对 结 果 可 直 接 得 出 是 微 小隐 孢 子 虫 、 安 氏 隐 孢 子 虫 或 其 他 种 属 感 染 ， 最 终 鉴 定 虫 种 。 DB53/T 1059.32021 6 AA附 录 A（ 规 范 性 ）粪 样 的 采 集 信 息 表滇 金 丝 猴 粪 样 采 集 记 录 表 见 表 A.1。表 A.1 滇 金 丝 猴 粪 样 采 集 记 录 表样 品 编 号 采 集 管 数 内 部 管 数 外 部 管 数 种 群 采 集 地 名 经 纬 度 、 海 拔 新 鲜 程 度 采 集 日 期 采 集 人 B DB53/T 1059.32021 7 BCD附 录 B（ 规 范 性 ）

32、巢 式 PCR反 应B.1 总 则可 使 用 多 种 酶 进 行 巢 式 PCR扩 增 ， 本 文 件 使 用 的 是 rTaq酶 ， 根 据 此 酶 制 定 反 应 体 系 、 反 应 时 间 以 及最 适 退 火 温 度 。B.2 巢 式 PCR反 应 引 物 两 步 法 巢 式 PCR， 引 物 序 列 见 表 B.1。 表 B.1 引 物 序 列轮 序 引 物 序 列 （ 5 3 ） 目 的 片 段 大 小 （ bp）第 一 轮 上 游 引 物 ： TTCTAGAGCTAATACATGCG下 游 引 物 ： CCCATTTCCTTCGAAACAGGA 830第 二 轮 上 游 引 物

33、： GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG下 游 引 物 ： AAGGAGTAAGGAACAACCTCCAB.3 巢 式 PCR反 应 体 系巢 式 PCR反 应 体 系 见 表 B.2。 第 一 轮 反 应 体 系 与 第 二 轮 反 应 体 系 相 同 ， 第 二 轮 反 应 模 板 为 第 一 轮 的 PCR产 物 。 表 B.2 巢 式 PCR反 应 体 系组 分 用 量 （ L）模 板 DNA（ 20 ng/L） 2.0上 游 引 物 （ 10 M） 0.25下 游 引 物 （ 10 M） 0.25Mg 2+ 2dNTPs（ 2.5 mM） 210 buffer(Mg2+ free) 2.5rTaq 酶 0.25无 菌 水 15.75合 计 25B.4 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 及 成 像 方 法电 泳 结 果 如 图 B.1所 示 。 DB53/T 1059.32021 8 注 ： M： DL 2000 DNA Marker； N： 阴 性 ； P： 阳 性 ； 1 3： 样 品 编 号 。图 B.1 电 泳 图E_ M N P 1 2 32000 bp1000 bp750 bp500 bp250 bp 100 bp DB53/T1059.32021