SN T 5206-2020 洋葱黄矮病毒的检疫鉴定方法.pdf

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1、以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5206 2020 代替SN/T 11622002 洋葱黄矮病毒的检疫鉴定方法 Detection and identification of onion yellow dwarf virus 中华人民共和国海关总署发 布 ICS 65.020 CCS B 16 2020-12-30发布 2021-07-01实施 以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫 开本 8801230 1/16 印张 1.25 字数 37 千字 2021 年 6 月第一版 2021 年 6 月第一次印刷 印数 1500 书号： 15517532

2、 定价 20.00 元 洋葱黄矮病毒的检疫鉴定方法 行 业 标 准 SN/T 52062020 * * * 北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023） 编辑部：（010）65194242-7509 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 中国海关出版社有限公司出版发行 网址 以正式出版文本为准 I SN/T 5206 2020 前 言 本文件按照GB/T1.12020给出的规则起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国福州海关、中华人民共和国厦门海关、中国检验检疫科学研 究院、中国农业科学院生物技术研究所、福建农林大学。 本文件主要起草人：沈建国、林玲、黄

3、智辉、张永江、李为民、陈细红、廖富荣、高芳銮、周 卫川、吴祖建、陈寿铃。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 1 SN/T 5206 2020 洋葱黄矮病毒的检疫鉴定方法 1范围 本文件规定了洋葱黄矮病毒检测的程序和方法。 本文件适用于进出境植物及其产品中洋葱黄矮病毒的检测。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用 文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单） 适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 SN/T

4、2964 植物病毒检测规范 SN/T 3457 植物病毒分子生物学检测规范 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4原理 洋葱黄矮病毒的血清学特性和基因组特征是制定本检疫鉴定方法的主要依据。 5仪器设备、用具及试剂 5.1仪器设备 高速冷冻离心机、电子天平（1/1000 g）、酶联仪、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、-20低温冰 箱和-80超低温冰箱、凝胶成像分析系统、pH计、微波炉、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高压灭菌 锅、超净工作台等。 5.2用具 各种量程的可调移液器（1000 L、200 L、100 L、20 L、10 L、2 L）、PCR反应管、离心管 （1.5 mL）、研钵等。

5、 5.3试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T 6682中相关规定。DAS-ELISA试剂 见附录A、RT-PCR试剂见附录B。 以正式出版文本为准 2 SN/T 5206 2020 6抽样和样品制备 6.1抽样 抽样方法按照SN/T 2122相关中规定执行。 有病毒危害症状的植物材料单独抽样，OYDV的危害症状描述参见附录C；无危害症状的植物材 料抽样方法按照SN/T 2122中相关规定执行。 6.2样品制备 分别按照有症和无症进行样品制备，具体方法按照SN/T 2964和SN/T 3457中规定执行。 7检测与鉴定 7.1DAS-ELISA DAS-ELISA具体方

6、法见附录A。 7.2RT-PCR RT-PCR具体方法见附录B。 8结果判定与记录 8.1结果判定 样品检测时，检测流程及结果判定按下述原则进行： 首先采用DAS-ELISA进行初步筛检。 若检测结果为阳性，采用RT-PCR方法进行验证。若验证结果为阴性，则判定样品不携带 OYDV；若验证结果为阳性，则判定样品携带OYDV。 若检测结果为阴性，采用RT-PCR方法进行验证。若验证结果为阴性，则判定样品不携带 OYDV；若RT-PCR验证结果为阳性，则需要将PCR产物进行测序，测定的序列为OYDV序列时判定 样品携带OYDV。 8.2结果记录 记录包括样品来源、样品种类、检测时间、检测地点、检测

7、方法和结果、检测人员签字。DAS- ELISA检测应有酶联反应数值；RT-PCR检测应有电泳图片。 9样品的保存 将经检测结果判定为阳性的样品妥善保存在-20-80冰箱中，并做好登记和标记工作，以 备复核用。 以正式出版文本为准 3 SN/T 5206 2020 附录A （规范性） 双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA） A.1试剂 A.1.1包被抗体 特异性的洋葱黄矮病毒抗体。 A.1.2酶标抗体 碱性磷酸酯酶标记的洋葱黄矮病毒抗体。 A.1.3底物 对硝基苯磷酸二钠（ pNPP）。 A.1.41PBST缓冲液（pH 7.4） 氯化钠（NaCl） 8.0 g 磷酸二氢钾（KH 2

8、PO 4 ） 0.2 g 磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 ） 1.15 g 氯化钾（KCl） 0.2 g 吐温-20 0.5 mL 溶于900 mL灭菌双蒸水中，并定容至1 000 mL，4储存。 A.1.5样品抽提缓冲液（pH 7.4） 亚硫酸钠（ Na 2 SO 3 ） 1.3 g 聚乙烯基吡咯烷酮（ PVP, MW24 00040 000） 20.0 g 溶于 900 mL的 1PBST中，并用 1PBST定容至 1 000 mL， 4储存。 A.1.6包被缓冲液（pH 9.6） 碳酸钠（ Na 2 CO 3 ） 1.59 g 碳酸氢钠（ NaHCO 3 ） 2.93 g 溶于 900

9、 mL灭菌双蒸水中，并定容至 1 000 mL， 4储存。 A.1.7酶标抗体稀释缓冲液（pH 7.4） 牛血清白蛋白（ BSA） 2.0 g 聚乙烯基吡咯烷酮（ PVP, MW24 00040 000） 20.0 g 溶于 900 mL 1PBST中，并用 1PBST定容至 1000 mL， 4储存。 A.1.8底物缓冲液（pH 9.8) 二乙醇胺 97 mL 氯化镁（ MgCl 2 ） 0.1 g 溶于 800 mL灭菌双蒸水中，用浓盐酸（ HCl）调 pH至 9.8，定容至 1 000 mL， 4储存。 以正式出版文本为准 4 SN/T 5206 2020 A.2试验方法 A.2.1样品

10、制备 A.2.1.1待测样品 待测样品按1：10（重量：体积，W/V）加入抽提缓冲液，用研钵研磨成浆，8 000 g离心10 min， 上清即为制备好的检测样品。 A.2.1.2阳性对照样品 洋葱黄矮病毒的纯病毒或者组织抽提液由抗血清供应商提供，用抽提缓冲液制备。 A.2.1.3阴性对照样品 由抗血清供应商提供，用抽提缓冲液制备。 A.2.1.4空白对照 用抽提缓冲液作空白对照 A.2.2包被抗体 按说明用包被缓冲液将抗体稀释，加入酶联板的孔中，100 L/孔，加盖，37孵育2 h或4冰 箱孵育过夜，倒去酶联板孔中溶液，按每孔100 L的量用PBST洗涤46次，每次1 min。 A.2.3加样

11、 加入制备好的检测样品、阴性对照、阳性对照，空白对照，并且至少一个重复，100 L/孔，加 盖，37孵育2 h或4冰箱孵育过夜，倒去酶联板孔中溶液，按每孔100 L的量用 PBST洗涤46次。 每次1 min。 A.2.4加酶标抗体 按说明用酶标抗体稀释缓冲液将酶标抗体稀释至工作浓度，加入到酶联板中，100 L/孔，加盖， 37孵育2 h，倒去酶联板孔中溶液，按每孔100 L的量用PBST洗涤46次，每次1 min。 A.2.5加底物 将底物NPP加入到底物缓冲液中使终浓度为1 mg/mL（现配现用），加入到酶联板中，100 L/ 孔，室温避光孵育。 A.2.6测定光密度 酶联仪在405 nm

12、处测定光密度（OD值）。 A.3结果判断 在满足阴性对照孔的OD 405 值510，孔的重 复性基本一致的质量要求后，样品OD 405 值/阴性对照OD 405 值2，判为阳性。样品OD 405 值/阴性对照 OD 405 值在阈值附近，判为可疑样品，应重新做一次，或用其他方法加以验证。样品OD 405 值/阴性对 照OD 405 值2，判为阴性。 以正式出版文本为准 5 SN/T 5206 2020 附录B （规范性） RT-PCR检测 B.1试剂 B.1.1TrizoL裂解液 B.1.25 TBE缓冲液 Tris碱 54.0 g 硼酸（H 3 BO 3 ） 27.5 g 0.5 mol/L

13、 EDTA（pH8.0） 20 mL 补充蒸馏水至1 L。用时加蒸馏水稀释至0.5TBE。 B.1.36加样缓冲液 0.25% 溴酚蓝 40%（质量难度）蔗糖水溶液。 B.1.4引物序列 根据已报道的OYDV基因组序列设计一对用于特异性扩增的引物。 上游引物OYDVf：5 -CTGATCTTGTGCATGAAATACGA-3 下游引物OYDVr：5 -GTGCCATTTTCAATACACCA-3 RT-PCR产物大小565 bp。 B.2RT-PCR检测 B.2.1总RNA提取 取0.1 g样品组织置于研钵中，加入液氮充分研磨至粉末状后迅速移入1.5 mL离心管，再加入 1 mL TrizoL

14、试剂，剧烈振荡摇匀3 min；4，12 000 g离心10 min，取上清；加入氯仿300 L，剧烈 振荡15 s，室温静置5 min，4，12 000 g离心15 min，取上层水相；加入等体积的异丙醇，颠倒混匀 后室温下静置15 min，4，12 000 g离心10 min，弃上清；加入1 mL 75%的乙醇洗涤沉淀2次，每次 4，7 500 g离心3 min，弃上清；RNA沉淀干燥后，用20 L40 L经DEPC（焦碳酸二乙酯）处理 过的ddH 2 O溶解，-20保存备用。 注：总RNA提取也可以采用商品化试剂盒。 B.2.2cDNA合成 在PCR管中加入2 L总RNA，1 L 下游引物

15、（OYDVr），ddH 2 O 5 L，70水浴10 min，迅速冰 浴5 min，再加入下列试剂：5 RT 缓冲液2.5 L、dNTPs（10 mmol/L）1 L、M-MLVRT（200 U/ L） 0.5 L、RNasin（40 U/ L）0.5 L。42水浴60 min，70水浴10 min，自然冷却至室温，-20保存 备用。 以正式出版文本为准 6 SN/T 5206 2020 B.2.3PCR扩增 PCR反应体系见表C.1，每个反应设置2个重复。检测时以含有病毒目标片段的质粒或含病毒材 料作为阳性对照，以不含病毒的健康植物组织作阴性对照，同时以水代替模板作为空白对照。 PCR反应条

16、件：94预变性3 min, 然后94变性30 s、50 退火50 s、72延伸1 min，35个循环， 最后一个循环结束后72继续延伸10 min。 表B.1PCR反应体系 成分 体积 cDNA 3.0 Taq DNA聚合酶（5 U/ L） 0.5 dNTPs（10 mmol/L） 0.5 10 PCR缓冲液（Mg 2+ Free） 2.5 25 mmol/L MgCl 2 2.0 上游引物（10 mol/L） 1.0 下游引物（10 mol/L） 1.0 ddH 2 O 14.5 总体积 25.0 注： PCR扩增也可以采用商品化试剂盒。 B.2.4琼脂糖凝胶电泳 制备1.5%的琼脂糖凝胶，

17、对PCR产物进行电泳，电压3 V/cm5 V/cm，缓冲液0.5 TBE。电泳 结束后，在溴化乙锭（EB，浓度为0.5 mg/mL）溶液染色10 min后，再在凝胶成像系统中观察是否扩 增出预期的特异性DNA电泳带，拍照并做记录。 注：也可以采用其他染料染色。 B.3结果判断 如果阳性对照在565 bp左右处有条带，阴性对照和空白对照无特异性扩增，待测样品出现与阳性 对照一致的扩增条带，则判定为阳性。 如果阳性对照在565 bp左右处有条带，阴性对照和空白对照无特异性扩增，待测样品未出现与阳 性对照一致的扩增条带，则判定为阴性。 B.4序列测定 PCR产物纯化、回收后，进行克隆、测序，或者直接

18、测序。把测序所得到的核苷酸序列与已知的 OYDV相应序列进行比对（利用NCBI网站上的BLAST软件进行比对，网址为http:/www.ncbi.nlm.nih. gov/BLAST/）。 以正式出版文本为准 7 SN/T 5206 2020 附录C （资料性） 洋葱黄矮病毒的背景资料 C.1分类地位 中文名：洋葱黄矮病毒 学名：Onion yellow dwarf virus，缩写：OYDV。 分类地位：马铃薯Y病毒科（Potyviridae）、马铃薯Y病毒属（Potyvirus）。 C.2寄主范围 已报道的自然寄主主要为洋葱、蒜、葱等葱属植物。 C.3病害症状 受OYDV感染的洋葱植株产生矮化，叶片出现不规则的黄色条纹、叶片下卷、扁平、皱缩和脆化 等症状（见图1）；受OYDV感染的蒜产生的症状类型因蒜品种而异，包括植株矮化、叶片黄化、卷 曲、皱缩等。 图C.1OYDV侵染洋葱引起的症状（引自 C.4分布地区 世界范围内分布。 C.5传播途径 通过蚜虫、汁液摩擦接种传播。远距离通过鳞茎传播。 以正式出版文本为准 SN/T 5206 2020 C.6粒体形态 病毒粒体呈弯曲线状，大小约722 nm16 nm。 C.7病毒基因组 正义单链RNA病毒，基因组全序列约10 538个核苷酸。 书号：155175 38 定价： 16.00 元