SN T 5205-2020 柏平缕瓜花叶病毒检疫鉴定方法.pdf

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1、以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5205 2020 柏平缕瓜花叶病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Pepino mosaic virus 2020-12-30 发布 2021-07-01 实施 ICS 65.020.01 CCS B 16 中华人民共和国海关总署发 布 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 I SN/T52052020 前 言 本文件按照 GB/T 1.12020 的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布结构不承担识别这些专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并

2、归口。 本文件起草单位：中华人民共和国厦门海关、中华人民共和国青岛海关。 本文件主要起草人：陈青、陈红运、迟海英，林振基、方志鹏、黄峰、廖富荣、林石明。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 1 SN/T52052020 柏平缕瓜花叶病毒检疫鉴定方法 1 范围 本文件规定了柏平缕瓜花叶病毒检疫鉴定方法。 本文件适用于可能带有柏平缕瓜花叶病毒的植物种子、苗木及产品的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 学名： Pepino mosaic virus 缩写： PepMV 分类地位：甲型线状病毒科（ Alphafle

3、xiviridae），马铃薯 X 病毒属（ Potexvirus）的成员抗原特性 和基因组特征是检疫鉴定的主要依据。 详细资料参见附录 A。 5 主要仪器设备与试剂 5.1 主要仪器设备和用具 微量研磨仪、酶标仪、洗板机、微量天平（感量：0.001g）、PCR 仪、电泳仪、水平电泳槽、凝 胶成像仪、高速冷冻台式离心机、制冰机、旋涡震荡器、水浴槽、pH 计、可调移液器（1000 L、 200 L、20 L、2 L）、96 孔酶标板、研钵等。 5.2 主要试剂 主要试剂和缓冲液见附录 B、C、D。 6 检测样品的制备 6.1 种子样品制备 挑取畸形、不成熟种子在防虫网室内播于灭菌土中，待长出 3

4、片 4 片真叶后将表现症状的植株 编号，未表现症状的植株分组（10 株为 1 组）并编号，采集的真叶分成 2 份，根据需要分别用于后 续的试验。种子也可以直接检测。 以正式出版文本为准 2 SN/T52052020 6.2 苗木和植物产品 有症状（如叶片畸形、花叶、斑驳等）的苗木和植物产品编号单独检测。没有症状的分组并编号 检测，分组方法和检测方法同 6.1。 7 检测与鉴定 7.1 双抗体夹心酶联免疫吸附测定（ DAS-ELISA） 设阴性对照和阳性对照（健康的植物组织作阴性对照，感染了 PepMV 的植物组织作阳性对照）， 样品提取缓冲液作空白对照，其中阴性对照种类和材料（如种子或叶片）应

5、尽量与检测样品一致。不 同的检测试剂或试剂盒根据试剂或试剂盒的说明操作。具体操作见附录 B。 7.2 一步法 RT-PCR 检测 分别提取样品和对照的总 RNA，RT-PCR 一步法进行 PCR 扩增。健康的植物组织作阴性对照， 感染 PepMV 的植物组织作阳性对照，用 ddH 2 O 作空白对照。具体操作见附录 C。 7.3 一步法实时荧光 RT-PCR 检测 分别提取样品和对照的总RNA，进行一步法实时荧光RT-PCR检测。健康的植物组织作阴性对照， 感染 PepMV 的植物组织作阳性对照，ddH 2 O 作空白对照。具体操作见附录 D。 8 结果判定 酶联检测为阳性后，RT-PCR 或

6、实时荧光 RT-PCR 检测为阳性即可判断为样品携带柏平缕瓜花叶 病毒。 9 结果记录与样品保存 9.1 结果记录 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有 经手人和实验人员的签字。酶联测定需有酶联板反应的原始数据；PCR 检测需有电泳结果照片，实 时荧光 RT-PCR 要有扩增曲线图。 9.2 样品保存 经检验确定携带 PepMV 的样品应在合适条件下保存，种子 4，病叶冻干保存在 -20或 者 -80冰箱中，做好标记和登记工作。 以正式出版文本为准 3 SN/T52052020 附录A （资料性） 柏平缕瓜花叶病毒相关资料 A.1 抗原特性 Pep

7、MV 具有很强的抗原性 。 A.2 粒体形态 柏平缕瓜花叶病毒粒体为线状，长度为 500 nm，直径为 13 nm。 A.3 基因组 单链线性 RNA，基因组长度 6.5kb，基因组为单一组分，碱基比： G ： A ： C ： U=25:26:19:30， 占粒子重的 6%。基因组不带 Poly（ A）尾巴，而具有 tRNA-like 结构，编码 4 个蛋白，病毒基因组 5 和 3 端分别含有一段非编码区。 A.4 寄主范围 柏平缕瓜花叶病毒在自然界主要番茄 (Lycopersicon esculentum)、凤果（ Solanum muricatum）。 A.5 病害症状 番茄：叶片花叶、扭

8、曲、亮黄色花叶、皱缩、老叶上有褐斑，茎部褐色条纹，果实红斑 ，。 A.6 分布 PepMV 于 1974 年在秘鲁首次发现。荷兰，欧洲多个国家均有发生，包括奥地利、保加利亚、车 臣、意大利、芬兰、法国、德国、匈牙利、荷兰、挪威、波兰、斯洛伐克、西班牙、瑞典、瑞士、土 耳其和英国。 A.7 传播途径 PepMV 可通过接触传播，也可通过种子传播。 以正式出版文本为准 4 SN/T52052020 附录B （规范性） 双抗体夹心酶联免疫吸附测定 B.1 试材 B.1.1 酶联板 B.1.2 包被抗体 特异性的柏平缕瓜花叶病毒抗体 B.1.3 酶标抗体 碱性磷酸酯酶标记的柏平缕瓜花叶病毒抗体 B.1

9、.4 底物 对硝基苯磷酸二钠（ NPP） B.1.5 PBST 缓冲液（洗涤缓冲液 pH7.4） 氯化钠 (NaCl) 8.0 g 磷酸二氢钾 (KH 2 PO 4 ) 0.2 g 磷酸氢二钠 (Na 2 HPO 4 ) 1.15 g 氯化钾 (KCl) 0.2 g 叠氮化钠 (NaN 3 ) 0.2 g 吐温 20（ Tween-20） 0.5 g 加入 900 mL 水溶解，用 NaOH 或 HCl 调节 pH 值到 7.4，然后加蒸馏水至 1 L。 B.1.6 样品抽提缓冲液（pH7.4） 亚硫酸钠（ Na 2 SO 3 ） 1.3 g 聚乙烯吡咯烷酮（ PVP， MW24,000 40

10、,000） 20.0 g 叠氮化钠（ NaN 3 ） 0.2 g PBST 定容至 1 L，4储存。 B.1.7 包被缓冲液（pH9.6） 碳酸钠（ Na 2 CO 3 ） 1.59 g 碳酸氢钠（ NaHCO 3 ） 2.93 g 叠氮化钠（ NaN 3 ） 0.20 g 加入 900 ml 水溶解，用 HCl 调节 pH 值到 9.6，然后加蒸馏水至 1 L，保存在 4 中。 B.1.8 酶标抗体稀释缓冲液（pH7.4） 牛血清白蛋白（ BSA）或 脱脂奶粉 2.0 g 聚乙烯吡咯烷酮（ PVP， MW24,000 40,000） 20.0 g 叠氮化钠（ NaN 3 ） 0.2 g PB

11、ST 定容至 1 L，4储存。 B.1.9 底物（NPP）缓冲液 (pH9.8) 氯化镁（ MgCl 2 ） 0.1 g 叠氮化钠（ NaN3） 0.2 g 二乙醇胺 97 mL 溶于 800 mL 蒸馏水中，用 HCl 调 pH 值至 9.8，蒸馏水定容至 1 L，4储存。 B.2 程序 B.2.1 包被抗体 用包被缓冲液将抗体按说明稀释，加入酶联板的孔中，100 L/ 孔，37孵育 2 h，清空孔中溶 以正式出版文本为准 5 SN/T52052020 液，PBST 洗涤 3 次。 B.2.2 样品制备 待测样品按 1 ： 10（ W/V）加入抽提缓冲液，用研钵研磨成浆， 7500 g 离心

12、 10 min，上清即为制 备好的待测样品。阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行；空白对照为样品抽提缓冲液。 B.2.3 加样 根据检测需要设计 96 孔（或 48 孔）酶联板，包括 2 个阴性对照孔、2 个阳性对照孔、2 个空白 对照孔和多个待测样品孔。加样量为 100 L/ 孔，每个样品设 1 个重复。4冰箱孵育过夜，酶联板 用 PBST 洗涤 3 次。 B.2.4 加酶标抗体 用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度，并加入到酶联板中，100 L/ 孔， 37孵育 4 h，PBST 洗涤 3 次。 B.2.5 加底物 将底物 NPP 加入到底物缓冲液中使终浓度为 1

13、mg/mL（现配现用），按 100 L/ 孔，加入到酶 联板中，室温避光孵育。 B.2.6 读数 用酶标仪在 30 min、 1 h 和 2 h 于 405 nm 处读 OD 值。 注：实际检测时，孵育温度、 PBST 洗涤次数和显色读数时间需按照检测抗体或试剂盒中说明书 的规定执行。 B.3 结果判定 B.3.1 对照孔的 OD 405 值（缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔），应该在质量控制范围内，即： 阴性对照孔的 OD 405 值 2； 同一样品的 OD 405 值应基本一致。 B.3.2 在满足了 B.3.1 质量要求后，结果原则上可判定如下： 样品 OD 405 值 / 阴性对照 OD

14、 405 值 2，判为阳性； 样品 OD 405 值 / 阴性对照 OD 405 值接近阈值，判为可疑样品，需重做一次或用其他方法验证； 样品 OD 405 值 / 阴性对照 OD 405 值 2，判为阴性。 B.3.3 若满足不了 B.3.1 质量要求，则不能进行结果判定。 质量控制标准和结果判定需按照检测抗体或试剂盒中说明书的规定执行 。 以正式出版文本为准 6 SN/T52052020 附录C （规范性） RT-PCR 检测 C.1 试剂 C.1.1 RNA 提取试剂 TrizoL 裂解液、氯仿、异丙醇、 75% 乙醇 C.1.2 一步法 RT-PCR 试剂 5Reaction Buff

15、er、Transcriptor Enzyme Mix、DEPC 处理过的 ddH 2 O水 C.1.3 电泳试剂 C.1.3.1 50TAE 缓冲液 Tris 242 g 冰醋酸 57.1 ml Na 2 EDTA2H 2 O 37.2 g 加去离子水定容至 1L。用时加水稀释至 1TAE 。 C.1.3.2 6 加样缓冲液 0.25% 溴酚蓝 40%(W/V) 蔗糖水溶液 C.2 实验步骤 C.2.1 总 RNA 提取 C.2.1.1 TrizoL 提取法 称取 0.1g 植物组织加液氮研磨成粉末状，迅速将其移入灭菌的 1.5 mL 离心管中，加入 1 mL 的 TrizoL试剂，剧烈震荡摇

16、匀，室温静置3 min；4，12000 g离心10 min，取上清；加入200 L氯仿， 上下颠倒混匀，室温静止 3 min ；4，12000 g 离心 10 min，取上层水相；加等体积的异丙醇，颠倒 混匀；4，12000 g 离心 10 min，弃上清；加 1 mL 75% 的乙醇洗涤沉淀，4，7500 g 离心 5 min， 弃乙醇；沉淀于室温下充分干燥后，溶于 30 L 经 DEPC（焦碳酸二乙酯）处理的 ddH2O，-20保 存备用 C.2.2 RT-PCR 反应 C.2.2.1 引物与产物 RT-PCR 检测引物见表 C.1 表 C.1 PCR 引物序列、产物 引物名称 序列（5

17、- 3） 扩增产物 (bp) PepMV1 CATAGTTGTGCACGGAATTGC 780 PepMV2 TTCCGTCTTGATACTGACCA PepMV3 TGCCGTCTTGATATTGGCCA C.2.3 采用一步法（one step）进行 RT-PCR，反应体系见表 C.2 ： 反应参数：50 30 min; 95 5 min; 95 15 s, 50 45 s, 68 1 min，35 个循环；68 7 min。 以正式出版文本为准 7 SN/T52052020 表 C.2 PCR 反应体系 组分 体积 （ mL） ddH 2 O 14.5 5Reaction Buffer

18、5.0 PepMV 1 (10 M) 1.0 PepMV 2 (10 M) 1.0 PepMV 3 (10 M) 1.0 Transcriptor Enzyme Mix 0.5 Template RNA 2.0 Total 25 L C.2.4 PCR 产物琼脂糖电泳及结果判断 C.2.4.1 制备凝胶 将 1TAE 和电泳级琼脂糖按 1.5% (W/V) 配好，在微波炉中熔化混匀，冷却至 55左右。 C.2.4.2 加溴化乙锭（EB） 加入溴化乙锭浓度为 0.5 mg/mL，混匀，倒入已封好的凝胶平台上，插上样品梳。待凝胶凝固后， 从制胶平台上除去封带，拔出梳子，加入足够量的 TAE（缓冲液

19、没过凝胶表面约 1 mm）。 C.2.4.3 加样 用 5mL 样品 PCR 产物与加样缓冲液（6）按规定比例混合，然后将其和适合的 DNA 分子量标 准物分别加入到琼脂糖凝胶孔中。 C.2.4.4 电泳 接通电源，电压 120V 下使 DNA 向阳极移动。当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移至足够分离 DNA 片 段时，关闭电源。将整个胶置于紫外透射仪上观察。 C.2.4.5 结果判断 阳性对照在 780 bp 左右处有扩增片段，阴性对照和空白对照无特异性扩增，如果样品出现与阳 性对照一致的扩增条带，可判定为阳性；如果样品未出现与阳性对照一致的扩增条带，判定结果为 阴性。 以正式出版文本为准 8 SN

20、/T52052020 附录D （规范性） 实时荧光 RT-PCR 检测 D.1 主要试剂 RNA 提取试剂见 C.1.1。 TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents。 D.2 实时荧光 RT-PCR 检测（一步法） D.2.1 引物与探针 引物和探针序列见表 D.1。 表 D.1 引物和探针序列 Name Sequence PepMV-fwd1 ACTCCTAGAGCTGACCTCAC PepMV-fwd2 ACTCCTAGAGCTGATCTTAC PepMV-rev1 TCTCCAGCAACAGGTTGGTA PepMV-rev2 TCACCTGC

21、AACTGGTTGATA PepMV-pro FAM-TGTCAGCTTGCATTTACTTCCAAAA-BHQ D.2.2 RNA 提取 操作方法见 C.2.1。 D.2.3 反应体系 实时荧光 PCR 反应体系见表 D.2。 表 D.2 实时荧光 RT-PCR 反应体系 试剂名称 加样量（ mL） 2Master Mix without UNG 25.0 40MultiScribe and RNase Inhibitor Mix 1.25 PepMV 模板（ RNA） 3.0 PepMV -F（ 20 mol/L） 1.0 PepMV -R（ 20 mol/L） 1.0 PepMV - P

22、 （ 20 mol/L） 0.5 DEPC 处理水 补足反应总体积至 50 L D.2.4 实时荧光 RT-PCR 反应参数 检测 PepMV 反应参数见表 D.3。 以正式出版文本为准 9 SN/T52052020 表 D.3 实时荧光 RT-PCR 反应参数 作用 温度 时间 反转录 50 30 min 活化 DNA 合成酶和预变性 95 5 min PCR（ 40 个循环） 变性 95 15 s 延伸 55 1 min D.3 结果判定 检测样品的 Ct 值大于或等于 40 时，则判定柏平缕瓜花叶病毒检测结果为阴性。 检测样品的 Ct 值小于或等于 35 时，则判定柏平缕瓜花叶病毒检测结

23、果为阳性。 检测样品的Ct值小于40而大于35时，应重新进行测试，如果重新测试的Ct值大于或等于40时， 则判定柏平缕瓜花叶病毒检结果阴性；如果重新测试的 Ct 值小于 40，则判定柏平缕瓜花叶病毒检结 果为阳性。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫 开本 8801230 1/16 印张 1.25 字数 30 千字 2021 年 6 月第一版 2021 年 6 月第一次印刷 印数 1500 书号：15517580 定价 18.00 元 柏平缕瓜花叶病毒检疫鉴定方法标准 行 业 标 准 SN/T 52052020 * * * SN/T 5205 2020 北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023） 编辑部：（010）65194 242-7509 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 中国海关出版社有限公司出版发行 网址