SN T 5198-2020 熊蜂短膜虫检疫技术规范.pdf

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1、以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5198 2019 代替SN/T 11622002 熊蜂短膜虫检疫技术规范 Quarantine protocol for Crithidia bombi 中华人民共和国海关总署发 布 2020-12-30发布 2021-07-01实施 ICS 11.220 CCS B 41 以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫 开本 8801230 1/16 印张 0.75 字数 22 千字 2021 年 1 月第一版 2021 年 1 月第一次印刷 印数 1500 书号：15517538 定价 16.00 元 熊蜂短膜虫检疫技

2、术规范 行 业 标 准 SN/T 51982020 * * * 北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023） 编辑部：（010）65194242-7509 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 中国海关出版社有限公司出版发行 网址 以正式出版文本为准 I SN/T 5198 2020 前 言 本文件按照GB/T 1.12020的规定起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国福州海关、中华人民共和国海口海关、中华人民共和国北京 海关、福建农林大学、厦门瑞德利校准检测技术有限公司。 本文件主要起草人：张体银、郑腾、李丹丹、张伟、黄少康、王武军、张志灯、于师宇、

3、白泉 阳、陈美传。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 1 SN/T 5198 2020 熊蜂短膜虫检疫技术规范 1范围 本文件规定了熊蜂短膜虫检疫的聚合酶链式反应和实时荧光聚合酶链式反应检测技术。 本文件适用于熊蜂短膜虫的检疫。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用 文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单） 适用于本文件。 GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语、定义和缩略语 本文件没有需要界定的术语和定义。下列缩略语适用于本文件。 Ct 循环阈值（cycle

4、threshold） DNA 脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid） dNTP 三磷酸脱氧核苷酸（deoxynucleoside triphosphate） EB 溴化乙锭（ethidium bromide） ITS 内转录间隔区 (internal transcribed space) PCR 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） TBE 三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸（trihydroxymethyl aminomethane-boric acid- ethylene diamine tetraacetic acid ） TE TE

5、缓冲液（Tris-EDTA buffer solution） 4设备、材料和试剂 4.1设备 4.1.1高压灭菌锅。 4.1.2梯度PCR扩增仪。 4.1.3荧光PCR仪。 4.1.4高速冷冻离心机（转速12 000 r/min）。 4.1.5微量移液器。 4.1.6生物安全柜。 4.1.7DNA相对分子质量标准品（100 bp 1 000 bp）。 4.1.8水平电泳仪。 4.1.9凝胶成像系统。 4.1.10电子天平（感量0.01 g）。 以正式出版文本为准 2 SN/T 5198 2020 4.1.11冰箱（2 8 和20 ）。 4.2试剂 4.2.1水：符合GB/T 6682中一级水的

6、规格。 4.2.2液氮。 4.2.3无水乙醚。 4.2.4无水乙醇。 4.2.50.01 mol/L磷酸盐（PBS）缓冲液，配制方法见附录A中A.1。 4.2.610% SDS溶液，配制方法见附录A中A.2。 4.2.7蛋白酶K。 4.2.85 mol/L的NaCl溶液，配制方法见附录A中A.3。 4.2.9CTAB/NaCl溶液，配制方法见附录A中A.4。 4.2.10三氯甲烷/异戊醇混合液，配制方法见附录A中A.5。 4.2.11酚/三氯甲烷/异戊醇混合液，配制方法见附录A中A.6。 4.2.12异丙醇。 4.2.13TE缓冲液。 4.2.1410PCR 缓冲液。 4.2.15dNTPs（

7、含dCTP、dGTP、dATP、dTTP）。 4.2.16 Taq DNA聚合酶。 4.2.17琼脂糖。 4.2.180.5TBE缓冲液，配制方法见附录A中A.7。 4.2.19上样缓冲液，配制方法见附录A中A.8。 4.2.20EB（10 mg/mL），配制方法见附录A中A.9。 4.2.21DNA相对分子质量标准物Marker。 4.2.22DNA纯化回收试剂盒。 4.3PCR引物 上游引物Cri-F1: 5- GGAAACCACGGAATCACATAGAC-3 下游引物Cri-R1: 5- AGAAGAAGAGAGACGAGAAGGAG-3 根据熊蜂短膜虫ITS基因核酸序列设计，扩增长度

8、为447 bp（参见附录B中B.1），用水溶解至10 mol/L后，保存于-20 备用。 4.4实时荧光PCR引物和探针 上游引物Cri-F2：5-GTTGGGAAAGAGAGTCTA-3 下游引物Cri-R2：5-GACGAGAAGGAGAGTAAG-3 Taq Man探针qPCR-P： FAM-AACACACAAACAAACCAAACACACA- TAMRA 根据熊蜂短膜虫ITS基因核酸序列设计，扩增长度为80 bp（参见附录B中B.2），用水溶解至 10 mol/L后，保存于-20 备用。 4.5质控物质 使用感染熊蜂短膜虫的熊蜂腹部组织或含目的片段的DNA作为阳性对照，使用未感染熊蜂短

9、膜 虫的健康熊蜂腹部组织作为阴性对照，用水作为空白对照。 以正式出版文本为准 3 SN/T 5198 2020 5采样 5.1采样比例 5.1.1当蜂群数量小于等于10群时，所有蜂群均采样。 5.1.2当数量在11100群时，以10群采样量为基础，每增加10群，采样量增加1群。 5.1.3当蜂群数量为101200群时，按总群数的15采样。 5.1.4当蜂群数量大于等于201群时，按总群数的10采样。 5.2采样方法 从待检蜂群中采取活力较弱的熊蜂1020只，放入烧杯内盖好，记录群号。检疫前先将活蜂用 乙醚处死或置于冰箱冷冻室内冷冻10 min。 6PCR检测 6.1DNA的提取 6.1.1剪取

10、所采得熊蜂腹部组织样品置于灭菌过的研钵中，加入适量液氮反复研磨成粉末状，也可使 用磷酸盐缓冲液研磨成匀浆，转移至1.5 mL离心管中，12 000 r/min 离心2 min，弃上清液，加入50 L TE缓冲液，使样品充分悬浮后，加入60 L 10% SDS溶液和10 L 20 mg/mL的蛋白酶K，混匀后于37 下温育1 h。 6.1.2加入100 L 5 mol/L的NaCl溶液，上下颠倒充分混匀，加入80 L CTAB/NaCl溶液，混匀后65 温育10 min；加入700 L三氯甲烷/异戊醇混合液（体积比为24 : 1），混匀后12 000 r/min离心5 min。 6.1.3吸取上

11、清液至另一干净离心管，加入等体积的酚/三氯甲烷/异戊醇混合液（三者体积比为 25 : 24 : 1），上下颠倒混匀，12 000 r/min 离心5 min。 6.1.4吸取上清液至另一干净离心管，加入2倍体积预冷的异丙醇沉淀DNA，轻轻混匀，4 下 12 000 r/min离心15 min，彻底去除上清液。 6.1.5用600 L 70%预冷乙醇洗涤沉淀，4 下12 000 r/min离心10 min，弃上清液，再瞬时离心，用移 液器彻底吸除酒精，在超净工作台上自然晾干。 6.1.6加入20 L TE溶液溶解DNA，-20 下保存。DNA提取也可选用等效的商品化试剂盒。 6.2PCR扩增 6

12、.2.1反应体系 普通PCR反应体系见表1。PCR扩增可以采用等效的商品化DNA扩增试剂盒。 表1普通PCR反应体系 名称 储存液浓度 终浓度 加样量/ L 10PCR缓冲液 10 1 2.5 dNTPs 10 mmol/L 0.2 mmol/L 0.5 Taq DNA聚合酶 5 U/L 0.1 U/L 0.5 上游引物Cri-F1 10 mol/L 0.4 mol/L 1 下游引物Cri-R1 10 mol/L 0.4 mol/L 1 以正式出版文本为准 4 SN/T 5198 2020 名称 储存液浓度 终浓度 加样量/ L 模板DNA 2 水 17.5 总体积 25 注： 反应体系中各试

13、剂的量可根据反应体系总体积进行适当调整。 6.2.2反应程序 94 预变性5 min；之后94 变性45 s，59 退火30 s，72 延伸45 s，共35个循环；72 补 充延伸10 min，4 保温。同时设阳性对照、阴性对照和空白对照。 6.3琼脂糖凝胶电泳 用TBE电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖凝胶。将凝胶放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶 面。将6 L样品和2 L上样缓冲液按比例混匀后加入样品孔。在电泳时使用DNA相对分子质量标准 品作对照。5 V/cm电泳约0.5 h，当指示剂到达底部时停止。 6.4凝胶成像分析和测序 将电泳完毕的凝胶放入含0.5 g/mL EB 溶液中染色10

14、 min 30 min 后（或等效商品化核酸染料配 置琼脂糖凝胶时直接溶解在凝胶中），在水中漂洗凝胶，用凝胶成像仪观察并判断结果，经核酸扩增 电泳后如出现一条大小约447 bp的DNA片段，应切胶回收DNA片段进行测序，参考序列参见附录B 中B.1。 6.5结果判定 经核酸扩增电泳后阳性对照会出现一条大小约447 bp的DNA片段，而阴性对照和空白对照无条 带时，试验成立。待检样品经核酸扩增电泳后，在阳性对照相应位置上有条带并经测序验证者为阳 性。无条带或条带的大小不是约447 bp的为阴性。 7实时荧光PCR检测 7.1DNA提取 同6.1。 7.2实时荧光PCR扩增 7.2.1反应体系 实

15、时荧光PCR反应体系见表2。实时荧光PCR扩增可以采用等效的商品化荧光定量PCR试剂盒。 表2实时荧光PCR反应体系 名称 储存液浓度 终浓度 加样量/ L 10PCR缓冲液 10 1 2.5 表1 （续） 以正式出版文本为准 5 SN/T 5198 2020 名称 储存液浓度 终浓度 加样量/ L dNTPs 10 mmol/L 0.2 mmol/L 0.5 Taq DNA聚合酶 5 U/L 0.1 U/L 0.5 上游引物Cri-F2 10 mol/L 0.2 mol/L 0.5 下游引物Cri-R2 10 mol/L 0.2 mol/L 0.5 探针qPCR-P 10 mol/L 0.2

16、 mol/L 0.5 模板DNA 2 水 18 总体积 25 注：反应体系中各试剂的量可根据反应体系总体积或不同仪器的要求进行适当调整。 7.2.2反应程序 95 预变性5 min；之后95 变性15 s，60 退火30 s，收集荧光，共40个循环。同时设阳性对 照、阴性对照和空白对照。 7.3结果判断 7.3.1综合分析仪器给出的各项结果，基线以仪器给出的默认值作为参考，阈值设定原则以阈值线刚 好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点为准，具体根据仪器噪音情况进行调整，选择FAM通道进行 分析。 7.3.2阳性对照样品有对数扩增曲线，而且Ct值小于等于30；阴性对照和空白对照无扩增曲线，而且 Ct

17、值大于40或未检出，二者均成立才可判定试验成立。 7.3.3检验样本Ct值小于等于35时，报告熊蜂短膜虫阳性。 7.3.4检验样本Ct值大于35且小于等于40时，重复1次，如果Ct值仍然小于等于40，并且曲线有明显 的对数增长期，报告熊蜂短膜虫阳性，否则报告熊蜂短膜虫阴性。 表2实时荧光PCR反应体系 （续） 以正式出版文本为准 6 SN/T 5198 2020 附录A （规范性） 试剂的配制 A.10.01 mol/L磷酸盐（PBS）缓冲液 NaCl 8.5 g KCl 0.2 g KH 2 PO 4 0.2 g Na 2 HPO 4 12H 2 0 2.89 g 加蒸馏水至1 000 mL

18、，121 高压蒸汽灭菌15 min。 A.210% SDS溶液 在80 mL水中加入10 g电泳级SDS，加热至68 溶解，使用浓盐酸调节溶液的pH值至7.2，加水 定容至100 mL，室温保存。 A.35 mol/L的NaCl溶液 NaCL 29.3 g 蒸馏水 100 mL 溶解混匀后121 高压灭菌15 min。 A.4CTAB/NaCl溶液 2% CTAB，100 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），20 mmol/L EDTA-Na 2 ，1.4 mol/L NaCl，使用前加入0.1% （体积浓度）的-巯基乙醇。 A.5三氯甲烷/异戊醇混合液 将三氯甲烷和异戊醇按24 :

19、 1的比例混合，密闭避光保存。 A.6酚/三氯甲烷/异戊醇混合液 1.0 mol/L Tris饱和酚（pH7.90.2）、三氯甲烷和异戊醇按25 : 24 : 1的比例混合，密闭避光 保存。 A.7TBE电泳缓冲液（5浓缩液） Tris 54 g 硼酸 27.5 g EDTA 2.9 g 加蒸馏水至 1 000 mL 用5 mol/L的盐酸（HCl）调到pH 8.0，或直接购买商品化的产品。 A.8上样缓冲液 溴酚蓝 0.25 g 蔗糖 40 g 蒸馏水 100 mL 以正式出版文本为准 7 SN/T 5198 2020 溶解混匀后121 高压灭菌15 min。 A.9溴化乙锭（ethidiu

20、m bromide，EB） 溴化乙锭（EB） 100 mg 蒸馏水 10 mL 用蒸馏水配制成10 mg/mL的浓缩液。用时每100 mL染色液中加10 L的浓缩液。 以正式出版文本为准 SN/T 5198 2020 附录B （资料性） 参 考 序 列 B.1PCR扩增的熊蜂短膜虫ITS基因序列（共447 bp） ggaaaccacggaatcacatagacccacttgggaccgaggattgcaattattggtcgcgcaacgaggaatgtctcgtaggcgcagctcatcaaactgtgccga ttacgtccctgccatttgtacacaccgcccgtcgttgtt

21、tccgatgatggtgcaatacaggtgatcggacaggcggatgtctcatctgcccgaaagttcaccgatatttct tcaatagaggaagcaaaagtcgtaacaaggtagctgtaggtgaacctgcagctggatcattttccgatgattaccaaaaacacacgcactatatatatatgtgtatacct atgtgtatatgtgtatacgtatatgtgttactcgttgggaaagagagtctacacactctctttctctaacacacaaacaaaccaaacacacataacttactctccttctcgtc tctcttcttct B.2实时荧光PCR扩增的熊蜂短膜虫ITS基因序列（共80 bp） gttgggaaagagagtctacacactctctttctctaacacacaaacaaaccaaacacacataacttactctccttctcgtc SN/T 5198 2020 书号：15517538 定价： 16.00 元