SN T 5145.6-2019 出口食品及饲料中动物源成分快速检测方法 第6部分：牛成分检测 PCR-试纸条法.pdf

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1、书书书 犐犆犛 犆 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛犖 犜 出口食品及饲料中动物源成分快速 检测方法 第 部分：牛成分检测 犘犆犚 试纸条法 犚犪 狆 犻犱犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犪狀犻犿犪犾犻狀 犵 狉犲犱犻犲狀狋犻狀犲狓 狆 狅狉狋犳狅狅犱犪狀犱犳犲犲犱 犘犪狉狋 ： 犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犅狅狏犻狀犲犐狀 犵 狉犲犱犻犲狀狋犘犆犚犔犪狋犲狉犪犾犳犾狅狑犱犻 狆 狊狋犻犮犽犿犲狋犺狅犱 发布 实施 中华人民共和国海关总署发布 书书书 前 言 出口食品及饲料中动物源成分快速检测方法分为以下 个部分： 第 部分：猫成分检测 试纸条法； 第 部分：貂成分检测 试纸条法； 第 部分

2、：鹿成分检测 试纸条法； 第 部分：骆驼成分检测 试纸条法； 第 部分：狗成分检测 试纸条法； 第 部分：牛成分检测 试纸条法； 第 部分：绵羊成分检测 试纸条法； 第 部分：驴成分检测 试纸条法； 第 部分：狐狸成分检测 试纸条法； 第 部分：鹅成分检测 试纸条法； 第 部分：鸭成分检测 试纸条法； 第 部分：火鸡成分检测 试纸条法； 第 部分：鸽子成分检测 试纸条法； 本部分是 的第 部分。 本部分按照 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国天津海关，天津师

3、范大学，中国检验检疫科学研究院，北京华大蛋 白质研发中心有限公司。 本部分主要起草人：郑文杰、张霞、庞璐、刘培、赵良娟、李宗梦、张宏伟、陈颖、尹长城、孙金生。 犛犖 犜 出口食品及饲料中动物源成分快速 检测方法 第 部分：牛成分检测 犘犆犚 试纸条法 范围 本部分规定了食品及饲料中牛源性成分检测的 试纸条方法。 本部分适用于肉、肉制品及饲料中牛源性成分的定性检测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 分析实验室用水规格和试验方法 饲料 采样 实验室质量控

4、制规范 食品分子生物学检测 术语、定义和缩略语 术语和定义 下列术语和定义适应于本文件。 牛 犅狅狏犻狀犲 属于哺乳纲，偶蹄目，牛科，牛属。本标准中牛成分即指牛特异性 片段。 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ： ，脱氧核糖核酸。 ： ，脱氧核苷酸三磷酸。 ： ，十六烷基三甲基溴化铵。 ： （ ） ，三羟甲基氨基甲烷。 ： ，乙二胺四乙酸。 ： ，异硫氰酸盐。 方法原理 利用裂解液破碎样本细胞，苯酚 氯仿法抽提基因组 ，以提取的 为模板，采用上游和下游 引物分别经异硫氰酸盐（ ， ）和生物素（ ）标记进行 扩增，获 得两端分别带有异硫氰酸盐和生物素分子的 产物。用含有金标记的抗异硫氰酸盐的兔多

5、克隆抗 犛犖 犜 体和固定有链亲和素的通用核酸检测试纸条对 产物进行筛选检测，并对 阳性产物进行测序 确证。 试剂和材料 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合 的要求。 牛源性成分检测用引物（对）序列及标记物为： 牛成分扩增引物详见表 。 表 试验用引物 物种名称引物序列（ ） 端标记物靶基因 牛 ： 异硫氰酸盐（ ） ： 生物素（ ） 犆犢犜犅 试剂 聚合酶（ ， ）。 ： （ ，脱氧腺苷三磷酸）、 （ ，脱氧胸苷三磷酸）、 （ ，脱氧胞苷三磷酸）、 （ ，脱氧鸟苷三磷酸）。 缓冲液： （ ）， ， 。 三氯甲烷（氯仿）。 异丙醇。 提取液： ， ， ， ， 。 沉淀液： ，

6、， 。 酚三氯甲烷异戊醇溶液：按照 饱和酚：三氯甲烷：异戊醇溶液体积比为 进行 配制。 三氯甲烷异戊醇溶液：按照三氯甲烷：异戊醇溶液体积比为 进行配制。 乙醇（ ）。 溶液（ ）。 蛋白酶 （ ）。 试纸条：含有金标记的抗异硫氰酸盐的兔多克隆抗体和固定有链亲和素的通用核酸检测试纸 条，可通过采购的原料试剂自行组装（参见附录 ）或采用等效的商品化试纸条。 展开液： 、 、 （ ） 以及浓度为 的 ；或采 用等效的商品化产品。 仪器设备 离心机（离心力 ）， 。 微量移液器（ ， ， ， ）。 仪。 犛犖 犜 恒温水浴锅， 。 天平：感量 。 计。 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 检验步骤 样品

7、制备 食品 将固状待检样品研磨混匀，分装三份，其中一份为检样，另外两份为留存样品。液状样品直接分装。 加工食品可能富含盐、糖、植物色素和发酵产生的有色物质等，会影响下游实验操作，应通过洗涤方 式尽量去除样品中的盐、糖和色素等杂质。 饲料 饲料样品按照 采样，或若粒度为 目称取 ， 目称取 ， 目称取 。 样品 犇犖犃 提取 称取 样品于 离心管中，加入 提取液，加入 蛋白酶 ， 温育 ，期间不时震荡混匀，应保证样品自由悬浮于液体中，必要时再加入适量 提取缓冲 液；取出后 离心 ，转移上清至 离心管中，加入等体积的室温酚三氯甲烷异戊醇 （ ）颠倒混匀， 转速下离心 ；转移上清至另一灭菌的离心管中

8、，加入等体积的三 氯甲烷异戊醇（ ），颠倒混匀，室温下 离心 ；转移上清至干净离心管中，加入等体 积的 沉淀液混匀，室温沉淀 ；加入 倍体积的异丙醇或 倍体积 冰箱中预冷的无水 乙醇混匀， 放置 ， 离心 ，弃上清，用 乙醇洗涤沉淀一次， 离心 ，弃上清，室温下晾干。加入 双蒸水，室温 ，混匀， 保存。 上述方法可用等效 提取试剂盒提取模板 。 犇犖犃 浓度和纯度的测定 取 溶液加双蒸水稀释至 ，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测 和 处的吸光值 和 。 的浓度按式（ ）计算： 犆犃犖 （ ） 式中： 犆 浓度，单位为微克每微升（ ）； 犃 处的吸光值； 犖 核酸稀释倍数。 当 比值在

9、 之间时，适宜于 扩增。 犘犆犚 扩增 犘犆犚 反应体系 见表 。 犛犖 犜 表 犘犆犚 反应体系 试剂体积 缓冲液（含 ） 正向引物（ ） 反向引物（ ） （ ） 模板（ ） （ ） 灭菌 反应条件 预变性 ； 变性 ， 退火 ， 延伸 ， 个循环后进入 。 反应条件随不同的 仪略有改变。 检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。用已知含牛源性成分的样品作阳性对照，用已 知不含牛源性成分的样品作阴性对照，用等体积的双蒸水代替模板 作空白对照。 试纸条检测 取 产物点于核酸试纸条样品垫，加入到 展开液中进行检测， 后观察结果。 质量控制 以下条件有一条不满足时，实验视为无效： ） 空白对

10、照：质控线变红，检测线未变红。 ）阴性对照：质控线变红，检测线未变红。 ）阳性对照：质控线变红，检测线变红。 结果判断与报告 结果判定 试纸条质控线变红色，且检测线变红色， 扩增产物为可疑阳性。可疑阳性产物经测序进行确 证（序列参见附录 ）。 试纸条质控线变红色，检测线不变色， 扩增产物为阴性。 结果报告 产物试纸条检测为可疑阳性，同时测序结果与 基因库同源性达到 及以上者，判为 含有牛源成分，结果报告为检出牛源成分； 产物试纸条检测为可疑阳性，测序结果与 基因库同源性低于 者，视比对结果具体 分析，判定是否含有牛源成分； 产物试纸条检测为阴性，判为不含有牛源成分，结果报告为未检出牛源成分。

11、犛犖 犜 检测过程中防止交叉污染的措施 检测过程中防止交叉污染的措施按照 中附录 的规定执行。 废弃物处理 检测过程中的废弃物，收集后在焚烧炉中焚烧处理。 检出限 本部分所规定方法的最低检出限（ ）为 （质量分数）。 犛犖 犜 附 录 犃 （资料性附录） 含有金标记的抗异硫氰酸盐的兔多克隆抗体和固定有链亲和素的通用核酸检测试纸条 犃 组成成分 犃 抗 抗体单克隆抗体或多克隆抗体： 单克隆抗体： 鼠单克隆抗体 多克隆抗体： 兔多克隆抗体 犃 质控线上的二抗：依据上述兔多抗或鼠单抗方案可分别选择羊抗兔或者羊抗鼠抗体。 犃 链亲和素：重组链亲和素，大肠杆菌表达的重组 蛋白 犃 试纸条结构 吸水滤纸垫

12、； 结合物垫，附有 抗体（兔源）与胶体金颗粒的交联体； 侧向层析基质（硝酸纤维素膜）； 检测带，附有链亲和素； 质控带，附有可结合兔源抗体的抗体； 衬底； 吸水垫。 犃 试纸条检测原理 检测用试纸条的吸水垫上含有金标记的抗异硫氰酸盐（ ）的兔多克隆抗体，可与 产物一 条链上的 标记分子结合，在检测线位置上固定有链亲和素，可与 产物另一条链上的生物素 结合。 阳性 扩增产物在展开液的作用下，首先与金标记的羧基荧光素抗体结合，通过虹吸作用向上 部移动，在经过固定有链亲和素的检测线位置时，因带有生物素标记而被链亲和素捕获在该位置上，显 示棕红色，过量的产物继续向上移动至固定有羊抗兔抗体的质控线位置，因其带有抗异硫氰酸盐的兔多 克隆抗体而被捕获在质控线上，从而显示出两条色带。 非特异性扩增的 产物因无生物素或异硫氰酸盐标记的缘故，不能与金标记的异硫氰酸盐抗体 结合，且被链亲和素捕获，从而不能在检测线位置显示颜色，而未参与反应的 引物因带有异硫氰酸 盐标记，故也可被异硫氰酸盐抗体捕获向上一直移动至质控线被羊抗兔抗体捕获而显色。 犛犖 犜 附 录 犅 （资料性附录） 犘犆犚 产物测序结果 牛源性成分的基因扩增靶标参考序列（ 犵犲狀狀犫犪狀犽 号： 犖犆 ） 犛犖 犜