DB5301 T 26-2019 马铃薯品种鉴定----分子标记检测.pdf

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1、ICS 65.020.01B05 DB5301昆 明 市 地 方 标 准DB5301/T 262019代 替 DG5301/T 26-2017马 铃 薯 品 种 真 实 性 和 种 薯 纯 度 鉴 定DNA分 子 标 记 2019-12-01发 布 2019-12-01实 施昆 明 市 市 场 监 督 管 理 局 发 布 DB5301/T 262019 I 前 言本 标 准 按 照 GB/T 1.1-2009 标 准 化 工 作 导 则 第 1部 分 ： 标 准 的 结 构 和 编 写 给 出 的 规 则 起 草 。本 标 准 由 昆 明 市 农 业 局 提 出 并 归 口 。本 标 准 起

2、草 单 位 ： 云 南 师 范 大 学 马 铃 薯 科 学 研 究 院 、 昆 明 市 农 业 科 学 研 究 院 。本 标 准 主 要 起 草 人 ： 唐 唯 、 易 靖 、 李 灿 辉 、 朱 维 贤 、 段 晓 艳 、 郝 大 海 、 刘 卫 民 、 邹 万 君 、 李 华 、张 仲 平 、 李 明 富 、 张 丽 芳 、 蒋 瑜 、 杨 春 利 。本 标 准 代 替 了 DG5301/T 26-2017。 DB5301/T 262019 1 马 铃 薯 品 种 真 实 性 和 种 薯 纯 度 鉴 定 DNA 分 子 标 记1 范 围本 标 准 规 定 了 DNA分 子 标 记 鉴 定

3、马 铃 薯 （ Solanum tuberosum L.） 品 种 的 方 法 。本 标 准 适 用 于 马 铃 薯 品 种 真 实 性 鉴 定 和 种 薯 纯 度 检 测 。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 对 于 本 文 件 的 应 用 是 必 不 可 少 的 。 凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 仅 所 注 日 期 的 版 本 适 用 于本 文 件 。 凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 改 单 ） 适 用 于 本 文 件 。GB 18133 马 铃 薯 种 薯 GB/T 28660 马 铃 薯 种 薯 真

4、 实 性 和 纯 度 鉴 定 SSR分 子 标 记3 术 语 和 定 义GB/T 28660和 以 下 术 语 及 定 义 适 用 于 本 文 件 。3.1 简 单 序 列 重 复基 因 组 中 由 1 6个 核 苷 酸 残 基 组 成 的 基 本 单 位 串 联 多 次 重 复 构 成 的 DNA序 列 。GB/T 28660， 定 义 3.13.2 聚 合 酶 链 式 反 应在 耐 热 DNA聚 合 酶 作 用 下 ， 于 体 外 快 速 大 量 特 异 性 扩 增 特 定 DNA序 列 的 方 法 。GB/T 28660， 定 义 3.2 3.3 毛 细 管 电 泳是 一 类 以 毛 细

5、 管 为 分 离 通 道 、 以 高 压 直 流 电 场 为 驱 动 力 的 新 型 液 相 分 离 技 术 。3.4 DNA 分 子 标 记能 反 映 生 物 个 体 或 种 群 间 基 因 组 中 某 种 差 异 的 特 异 性 DNA片 段 。3.5 标 准 品 种按 国 家 农 作 物 品 种 审 定 标 准 认 定 的 品 种 。4 仪 器 用 具 、 试 剂 和 软 件4.1 仪 器 及 用 具 用 本 方 法 进 行 试 验 时 ， 需 要 仪 器 、 用 具 如 下 ： DB5301/ 262019 2 PCR仪 （ 96 孔 ， 梯 度 ） ； 低 温 高 速 离 心 机 （

6、 4 ， 16 000 rpm/min） ； 冰 箱 （ -20 ， -80 ） ； 制 冰 机 (200 kg/天 300 kg/天 )； 高 压 灭 菌 器 （ 121 ， 0.15 MPa） ； 微 量 移 液 器 （ 0.5 L 10 L、 10 L 100 L、 100 L 1 000 L） 及 配 套 的 枪 头 ； 凝 胶 成 像 仪 ； 电 泳 仪 ； 水 平 电 泳 槽 ； 基 因 分 析 仪 （ Genetic Analyzer, ABI 3500/3730 xl 系 列 ） ； 紫 外 可 见 分 光 光 度 计 （ 190 nm 1 100 nm） ； 0.2 mL P

7、CR管 ； 96孔 测 序 板 ； 石 英 比 色 皿 。4.2 试 剂用 本 方 法 进 行 试 验 时 ， 需 要 试 剂 如 下 ： 常 用 贮 备 液 （ 制 备 方 法 见 附 录 A） ； DNA提 取 试 剂 （ 制 备 方 法 见 附 录 B） ； DNA分 子 标 记 引 物 （ 见 附 录 C） ； Taq DNA 聚 合 酶 （ Taq DNA polymerase） 和 配 套 的 PCR 缓 冲 液 ； 1 000 bp DNA Marker； 无 DNA酶 的 RNA酶 A（ DNase-free RNase A） （ 10 mg/mL） ； 异 丙 醇 ； 乙 醇

8、 （ 70%） ； 灭 菌 双 蒸 水 （ ddH 2O） ； 甲 酰 胺 （ HIDI） ； 分 子 量 内 标 （ GeneScan 500LIZ） ； EB染 液 （ 100 mL 1 TAE + 5 L EB染 料 ） 。4.3 软 件用 本 方 法 进 行 试 验 时 ， 需 要 软 件 如 下 ： Data Collection 4.0（ ABI） ； GeneMarker 2.09 (ABI)； GeneMapper 4.0 (ABI)； Microsoft Excel 2013 (Microsoft corporation)。5 供 试 材 料 5.1 取 样 ： 按 照 GB

9、 18133取 样 所 述 方 法 进 行 ， 采 集 大 田 植 株 叶 片 或 块 茎 作 为 检 测 样 品 。5.2 样 品 保 存 ： 选 取 适 量 样 品 ， 装 入 冻 存 管 ， 液 氮 速 冻 ， 置 冰 箱 （ -80 以 下 ） 中 保 存 备 用 （ 有 效 保存 期 小 于 等 于 6 个 月 ） 。 DB5301/T 262019 3 6 鉴 定 程 序6.1 总 DNA 提 取按 下 列 顺 序 进 行a) 称 取 100 mg 待 测 样 品 ， 置 于 预 冷 2.0 mL离 心 管 中 ， 液 氮 冷 冻 下 迅 速 研 磨 成 细 粉 。b) 依 次 加

10、 入 700 L 的 两 倍 十 六 烷 基 三 甲 基 溴 化 铵 缓 冲 液 （ CTAB缓 冲 液 ） （ 见 附 录 B 表 B.1） 和2 L 的 -巯 基 乙 醇 涡 旋 混 匀 。 置 65 水 浴 1 h， 期 间 每 隔 10 min摇 动 混 匀 一 次 。c) 冰 上 冷 却 约 10 min后 ， 加 入 700 L的 氯 仿 ： 异 戊 醇 （ 24:1） 混 合 液 （ 见 附 录 B表 B.2） ， 涡旋 混 合 ,轻 缓 颠 倒 混 匀 数 次 。d) 12 000 rpm 离 心 5 min。 吸 取 上 层 水 相 至 新 1.5 mL 离 心 管 中 ，

11、加 入 等 体 积 （ 400 L 500 L）的 预 冷 异 丙 醇 。 轻 缓 颠 倒 混 匀 。e) 4 冰 箱 静 置 30 min 后 ， 12 000 rpm离 心 15 min。 弃 上 清 液 。 f) 向 离 心 管 中 加 入 70%乙 醇 1.0 mL， 静 置 3 min后 ， 12 000 rpm离 心 20 min。g) 小 心 倒 出 70%乙 醇 ， 再 加 入 90%乙 醇 1.0 mL， 静 置 5 min 后 ， 12 000 rpm离 心 10 min， 小 心倒 去 乙 醇 。h) 在 干 净 的 吸 水 纸 上 倒 置 离 心 管 ， 自 然 干 燥

12、 15 min。i) 晾 干 的 DNA， 应 为 透 明 状 。 加 入 100 L的 1 TE 缓 冲 液 ， 将 十 倍 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 -乙 二 胺 四乙 酸 缓 冲 液 （ EDTA 缓 冲 液 ） （ 见 附 录 B 表 B.3） 稀 释 10 倍 并 灭 菌 溶 解 DNA， 再 加 入 2 L 的无 DNA酶 的 RNA酶 A（ 10 mg/mL） 。 37 温 浴 1 h 去 除 RNA。 4 冰 箱 放 置 备 用 。6.2 总 DNA 质 量 鉴 定6.2.1 取 DNA提 取 液 1.0 L 5.0 L于 新 的 1.5 mL离 心 管 中 ， 加 入

13、1 TE缓 冲 液 稀 释 至 1.0 mL，混 匀 后 转 入 石 英 比 色 皿 中 ， 用 紫 外 分 光 光 度 计 测 定 OD 260和 OD280下 的 光 密 度 值 （ OD260： 紫 外 光 260 nm 下的 光 密 度 值 ； OD280： 紫 外 光 280nm 下 的 光 密 度 值 ） 。 用 OD260/OD280 比 值 判 断 DNA纯 度 ， 比 值 在 1.8 1.9之 间 表 明 DNA纯 度 较 高 。 按 公 式 （ 1） 计 算 提 取 液 中 DNA浓 度 。1000 50260 tODdsDNA .(1)式 中 ：dsDNA双 链 DNA分

14、 子 的 含 量 （ g/mL） ；OD 260紫 外 光 260 nm下 的 光 密 度 值 ；t稀 释 倍 数 。6.2.2 总 DNA浓 度 确 定 后 ， 用 1 TE缓 冲 液 将 所 提 取 的 总 DNA 稀 释 为 终 浓 度 50 ng/ L， 根 据 每 次 用量 分 装 ， 置 -20 冰 箱 保 存 备 用 。6.3 PCR反 应6.3.1 PCR反 应 体 系在 冰 盘 中 或 4 条 件 下 ， 按 表 1所 列 成 分 及 其 用 量 ， 顺 序 依 次 加 入 PCR管 ， 准 备 25.0 L PCR反 应 体 系 。 DB5301/ 262019 4 表 1

15、 PCR反 应 体 系成 分 用 量ddH2O 16.1 L10 PCR 缓 冲 液 2.5 LdNTPs (10 mM) 2.0 L正 向 引 物 (10 M) 1.0 L反 向 引 物 (10M) 1.0 LTaq DNA 聚 合 酶 (2.5 U/L) 0.4 LDNA 模 板 (50 ng/L) 2.0 L总 体 积 25.0 L 注 ： 供 1个 样 品 、 1 对 引 物 检 测 ， 25L6.3.2 反 应 程 序 :按 表 2程 序 设 置 PCR反 应 流 程 。 表 2 PCR反 应 程 序反 应 程 序 时 间 备 注94 预 变 性 5 min94 变 性 1 min退

16、 火 1 min 不 同 引 物 所 需 的 退 火 温 度 见 附 录 C 表 C.172 延 伸 1 min 循 环 次 数 35次 变 性 退 火 延 伸 反 应 循 环 次 数72 延 伸 5 min4 终 止 反 应 PCR产 物 放 置 在 4 冰 箱 中 保 存 备 用6.4 细 胞 质 标 记 检 测 用 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳6.4.1 器 具 清 洗首 先 将 配 胶 、 电 泳 、 染 胶 所 需 要 的 器 具 清 洗 干 净 ， 包 括 托 盘 、 胶 托 、 梳 子 、 电 泳 槽 、 染 胶 盘 （ EB污 染 ， 需 独 立 清 洗 ） 。 清 洗 流 程

17、为 ： 先 用 自 来 水 冲 洗 三 次 ， 然 后 用 纯 水 冲 洗 三 次 ， 最 后 用 纸 巾 或 医用 纱 布 擦 干 。6.4.2 配 胶制 备 好 的 凝 胶 需 平 整 、 不 漏 孔 ， 方 可 用 于 电 泳 检 测 。 制 胶 按 下 列 顺 序 进 行 ： a) 量 取 20 mL 的 电 泳 缓 冲 液 1 TAE至 锥 形 瓶 中 ；b) 再 称 取 0.4g 的 琼 脂 糖 倒 入 锥 形 瓶 中 ， 摇 匀 并 用 保 鲜 膜 封 口 ；c) 放 入 微 波 炉 中 以 40 %火 力 加 热 60 s， 取 出 摇 匀 ， 再 次 放 入 微 波 炉 中

18、以 40 % 火 力 加 热 至 凝 胶完 全 溶 解 。 制 备 好 的 凝 胶 应 为 色 泽 均 匀 、 无 气 泡 ；d) 将 制 备 好 的 凝 胶 放 入 65 的 水 浴 锅 中 ， 待 凝 胶 冷 却 至 65 时 ， 及 时 将 凝 胶 倒 入 装 配 好 的 干净 胶 槽 中 ；e) 待 凝 胶 完 全 凝 固 后 ， 将 胶 槽 小 心 转 移 至 4 冰 箱 ， 冷 藏 30 min后 拔 出 梳 子 ； DB5301/T 262019 5 f) 把 制 备 好 的 凝 胶 连 同 胶 托 一 起 放 入 电 泳 槽 正 中 央 ， 胶 孔 的 方 向 朝 向 负 极

19、， 往 电 泳 槽 中 倒 入 电 泳缓 冲 液 （ 1 TAE） 至 刚 好 将 凝 胶 淹 没 。6.4.3 上 样取 5 L PCR产 物 ， 加 入 1 L 6 溴 酚 蓝 （ 见 附 录 A 表 A.4） 混 匀 ， 按 胶 孔 顺 序 上 样 并 做 好 记 录 ； 以5 L的 DNA Ladder为 分 子 量 标 准 。6.4.4 电 泳在 电 压 120 V或 400 mA电 流 条 件 下 ， 电 泳 30 min或 溴 酚 蓝 条 带 迁 移 距 至 胶 板 底 部 1 cm时 停 止 。6.4.5 染 色电 泳 结 束 之 后 ， 把 凝 胶 转 移 到 EB染 胶 盘

20、 中 ， 盖 上 盖 子 避 光 染 色 30 min。 6.4.6 凝 胶 成 像将 凝 胶 放 入 凝 胶 成 像 系 统 中 ， 按 照 凝 胶 成 像 系 统 操 作 规 程 进 行 操 作 ， 拍 照 保 存 检 测 结 果 。6.5 细 胞 核 标 记 检 测 用 毛 细 管 电 泳 分 析6.5.1 内 标 配 置25 mL Hi-Di和 193 L GeneScan 500liz混 合 （ 130:1） ， 混 合 后 震 荡 15 s， 根 据 每 次 使 用 量 分 装至 1.5 mL的 灭 菌 管 中 ， -20 冻 存 ， 使 用 前 4 解 冻 。6.5.2 分 内

21、标将 解 冻 后 的 内 标 震 荡 混 匀 ， 分 别 加 入 96孔 板 ， 每 孔 9.0 L。 若 每 批 次 检 测 样 品 不 足 96个 时 ， 空 白 的孔 加 入 ddH 2O 10.0 L， 用 封 口 膜 封 闭 内 标 板 ， 瞬 时 离 心 。6.5.3 加 样小 心 揭 去 内 标 板 的 封 口 膜 ， 吸 取 0.5L -1.0 L的 待 检 测 样 品 PCR产 物 ， 按 顺 序 分 别 加 样 ， 再 次 用封 口 膜 封 闭 已 加 样 的 内 标 板 ， 并 用 吸 水 纸 压 紧 。6.5.4 变 性震 荡 10 s混 匀 ， 3 900 rpm离

22、心 5 min后 ， 放 入 PCR仪 中 96 变 性 处 理 5 min， 再 迅 速 冷 冻 (-20 )2 min， 瞬 时 离 心 。6.5.5 电 泳 与 分 析按 照 基 因 分 析 仪 （ ABI3500/3730 xl） 操 作 流 程 进 行 电 泳 、 数 据 收 集 。 用 软 件 GeneMarker和 GeneMapper进 行 数 据 分 析 ， 最 后 用 软 件 Excel进 行 数 据 统 计 。 7 数 据 记 录 和 分 析7.1 细 胞 质 DNA 标 记 检 测 结 果7.1.1 叶 绿 体 DNA标 记 检 测 ： T标 记 检 测 结 果 分 为

23、 两 种 带 型 （ 446 bp或 205 bp） ， 以 区 分 普 通 栽 培 亚种 （ T,带 型 205 bp） 和 野 生 种 （ W， 446 bp） 的 叶 绿 体 DNA类 型 。 DB5301/ 262019 6 7.1.2 线 粒 体 DNA标 记 检 测 ： D标 记 检 测 结 果 分 为 有 或 无 527 bp条 带 ， 有 条 带 表 示 携 带 六 倍 体 野 生 种Solanum demissum（ D） 的 线 粒 体 DNA类 型 。 ALM4/5标 记 检 测 结 果 为 2 400 bp、 1 600 bp 或 无 特 异 性扩 增 产 物 ， 可

24、将 线 粒 体 DNA类 型 分 别 分 为 、 或 三 种 。7.2 细 胞 核 DNA 标 记 检 测 结 果7.2.1 SSR引 物 (STI0003)标 记 检 测 ： 在 137 bp 188 bp 分 子 量 大 小 范 围 内 有 无 扩 增 峰 ， 根 据 峰 值 的位 置 和 个 数 进 行 判 断 。7.2.2 SSR引 物 (STI0033)标 记 检 测 ： 在 131 bp 155 bp 分 子 量 大 小 范 围 内 有 无 扩 增 峰 ， 根 据 峰 值 的位 置 和 个 数 进 行 判 断 。7.2.3 SSR引 物 (STM0030)标 记 检 测 ： 在 1

25、22 bp 168 bp 分 子 量 大 小 范 围 内 有 无 扩 增 峰 ， 根 据 峰 值 的位 置 和 个 数 进 行 判 断 。 8 结 果 判 定8.1 品 种 真 实 性 鉴 定8.1.1 直 接 比 较 待 测 品 种 与 标 准 品 种 样 品 的 标 记 检 测 结 果 ， 在 本 标 准 要 求 的 细 胞 质 基 因 组 3 个 分 子 标记 位 点 及 核 基 因 组 3 个 SSR分 子 标 记 位 点 检 测 结 果 基 础 上 进 行 判 定 。8.1.2 首 先 判 定 叶 绿 体 DNA标 记 类 型 ， 如 电 泳 带 型 与 标 准 样 品 不 一 致

26、， 则 判 定 和 待 测 品 种 不 一 致 ， 不进 入 检 测 。8.1.3 如 叶 绿 体 DNA 标 记 检 测 带 型 一 致 ， 则 根 据 线 粒 体 D 标 记 、 ALM4/5 标 记 及 3 个 核 基 因 组 SSR标 记检 测 结 果 进 行 判 定 。 若 待 测 品 种 样 品 与 标 准 品 种 样 品 之 间 所 有 条 带 数 目 和 峰 位 完 全 吻 合 ， 则 判 定 待 测 品种 和 标 准 品 种 为 同 一 品 种 ； 如 存 在 不 一 致 条 带 和 峰 值 ， 则 判 定 为 不 是 同 一 品 种 。8.2 种 薯 纯 度 检 测 根 据

27、 待 检 测 样 品 数 量 ， 在 逐 一 提 取 样 品 基 因 组 DNA后 ， 可 采 取 混 合 样 品 （ 5 10个 样 品 DNA等 量混 合 为 一 个 混 合 样 品 ） 检 测 。 按 8.1结 果 判 定 流 程 ， 如 判 定 为 同 一 样 品 ， 则 品 种 纯 度 （ P） 记 为 100%。如 检 测 结 果 低 于 100%， 则 对 有 差 异 的 混 合 样 品 分 别 进 行 逐 一 检 测 ， 最 后 根 据 有 差 异 的 检 测 样 品 数 量（ S） 占 总 抽 样 检 测 样 品 数 量 （ T） 的 百 分 比 来 判 定 品 种 纯 度

28、， 按 照 公 式 （ 2） 进 行 计 算 ：%1001 TSP .(2)式 （ 2） 中 ：P种 薯 纯 度 （ %） ；S有 差 异 的 检 测 样 品 数 量 ；t总 抽 样 检 测 样 品 数 量 。8.3 鉴 定 结 果 报 告 样 式 鉴 定 结 果 报 告 样 式 见 附 件 D。 DB5301/T 262019 7 附 录 A（ 规 范 性 附 录 ）常 用 贮 备 液表 A.l 表 A.4 给 出 了 常 用 贮 备 液 的 配 制 方 法 。表 A.1为 1.0 mol/L 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 -盐 酸 贮 备 液 （ Tris-HCl贮 备 液 ） （ pH

29、 8.0， 1 000 mL） 。表 A.1 Tris-HCl贮 备 液成 分 用 量 备 注三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 （ Tris碱 ） 121.1 g灭 菌 双 蒸 水 (ddH 2O) 800 mL37%浓 盐 酸 (HCl) 约 42 mL 用 约 42 mL浓 盐 酸 调 节 pH值 至 8.0最 终 体 积 1 000 mL 用 ddH2O定 容 至 1 000 mL。 灭 菌 后 ， 室 温 保 存表 A.2为 0.5 mol/L 乙 二 胺 四 乙 酸 贮 备 液 (EDTA贮 备 液 ） （ pH 8.0， 1 000 mL)。表 A.2 EDTA贮 备 液成 分 用

30、量 备 注乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 (Na2EDTA-2H 2O) 186.1 g灭 菌 双 蒸 水 (ddH2O) 700 mL10 mol/L 氢 氧 化 钠 (NaOH) 约 50 mL 用 约 50 mL氢 氧 化 钠 调 节 pH值 至 8.0最 终 体 积 1 000 mL 用 ddH2O 定 容 至 1000 mL。 灭 菌 后 ， 室 温 保 存表 A.3为 十 倍 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 -硼 酸 -乙 二 胺 四 乙 酸 缓 冲 液 （ 50 TAE缓 冲 液 ） （ pH8.0， 1000mL） 。表 A.3 50 TAE缓 冲 液成 分 用 量 备 注Tr

31、is碱 (Tris base) 242 g冰 醋 酸 (Acetic acid) 57.1 mL0.05 M EDTA (pH 8.0) 100 mL 灭 菌 双 蒸 水 (ddH2O) 800 mL 用 ddH2O定 容 至 1 000 mL最 终 体 积 1 000 mL 灭 菌 后 ， 室 温 保 存表 A.4 为 电 泳 上 样 缓 冲 液 （ 50 mL） 。表 A.4 上 样 缓 冲 液成 分 用 量 备 注98%甲 酰 胺 (Formamide) 47 mL0.2 M EDTA (pH8.0) 2.5 mL溴 酚 蓝 （ Bromophenol） 0.25 g 也 可 用 5 m

32、L ddH 2O溶 解 后 ， 按 需 要 量 加 入二 甲 苯 青 （ Xylene cyanol） 0.25 g最 终 体 积 50 mL 4 冰 箱 保 存 DB5301/ 262019 8 AB附 录 B（ 规 范 性 附 录 ）DNA提 取 试 剂表 B.1为 2X十 六 烷 基 三 甲 基 溴 化 铵 缓 冲 液 （ 2 CTAB缓 冲 液 ） (pH 8.0， 1 000 mL)。表 B.1 2 CTAB缓 冲 液成 分 用 量 备 注 1.0 M Tris-HCl (pH8.0) 100 mL0.5 M EDTA (pH8.0) 40 mL氯 化 钠 (NaCl) 81.82

33、g 加 入 600 mL ddH2O加 热 搅 拌十 六 烷 基 三 甲 基 溴 化 铵 (CTAB) 20 g聚 乙 烯 吡 咯 烷 酮 (PVP) 2 g灭 菌 双 蒸 水 (ddH 2O) 用 ddH2O定 容 至 1 000 mL最 终 体 积 1 000 mL 灭 菌 后 ， 室 温 保 存表 B.2为 氯 仿 ： 异 戊 醇 混 合 液 (24： 1， 100 mL)。表 B.2 氯 仿 ： 异 戊 醇 混 合 液成 分 用 量 备 注氯 仿 (Chloroform) 96 mL异 戊 醇 (Isoamylol) 4 mL最 终 体 积 100 mL 临 时 配 制表 B.3为 十

34、 倍 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 -乙 二 胺 四 乙 酸 缓 冲 液 （ 10 TE缓 冲 液 ） （ pH 8.0， 1 000 mL） 。表 B.3 10 TE缓 冲 液 成 分 用 量 备 注1.0 M Tris-HCl (pH 8.0) 100 mL0.5 M EDTA (pH 8.0) 20 mL灭 菌 双 蒸 水 (ddH2O) 800 mL 用 ddH2O定 容 至 1 000 mL最 终 体 积 1 000 mL 灭 菌 后 ， 室 温 保 存 DB5301/T 262019 9 BC附 录 C（ 规 范 性 附 录 ）引 物表 C.1为 细 胞 质 和 细 胞 核 引

35、物 信 息 表 。表 C.1 引 物 信 息引 物 名 称 SSR基 序 引 物 序 列 (5 3) 退 火 温 度 ( ) 染 色 体 预 期 产 物 (bp) T - F: GGAGGGGTTTTTCTTGGTTGR: AAGTTTACTCACGGCAATCG 60 cpDNA 446/205D - F: CGGGAGGTGGTGTACTTTCTR: ACGGCTGACTGTGTGTTTGA 60 mtDNA 527/N*ALM4/5 - F: AATAATCTTCCAAGCGGAGAGR: AAGACTCGTGATTCAGGCAAT 57 mtDNA 2 400/1 600/N*STI0

36、003 (ACC)n F: ACCATCCACCATGTCAATGCR: CTCATGGATGGTGTCATTGG 60 VIII 137 188STI0033 (AGG)n F: TGAGGGTTTTCAGAAAGGGAR: CATCCTTGCAACAACCTCCT 61 VII 131 155STM0030 (GT/GC)(GT)n F: AGAGATCGATGTAAAACACGT R: GTGGCATTTTGATGGATT 58 XII 122 168*： 无 条 带 扩 增 DB5301/ 262019 10 CD附 录 D（ 规 范 性 附 录 ）检 测 报 告 样 式表 D.1为

37、马 铃 薯 品 种 真 实 性 及 种 薯 纯 度 检 测 报 告 。表 D.1 马 铃 薯 品 种 真 实 性 及 种 薯 纯 度 检 测 报 告No. 样 品 名 称 马 铃 薯 询 问 品 种 名 称送 检 日 期 品 种 采 样 时 间品 种 采 样 地 点 样 品 数 量检 测 依 据 地 方 标 准 规 范 号 检 验 日 期检 测 指 标 样 品 结 果 类 型 标 准 品 结 果 类 型 一 致 性 送 检 样 品 纯 度 %细 胞 质 T标 记细 胞 质 D标 记 细 胞 质 ALM4/5标 记细 胞 核 STI0003标 记细 胞 核 STI0033标 记细 胞 核 STM0030标 记检 验 结 论 签 发 日 期 ： 年 月 日 备 注审 批 ： 送 检 员 ： _