DB32 T 3806-2020 猕猴桃细菌性溃疡病监测规范.pdf
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1、ICS 65.020.30 B 16 DB32 江 苏 省 地 方 标 准 DB32/T 3806 2020 猕猴桃细菌性溃疡病监测规范 Guideline for surveillance of kiwifruit bacterial canker 2020 - 05 - 25 发布 2020 - 06 - 25 实施 江苏省市场监督管理局 发布 DB32/T 3806 2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准制定由江苏省中国科学院植物研究所提出。 本标准由江苏省林业局归口。 本标准起草单位: 江苏省中国科学院植物研究所,江苏长江果品产业研究院有限
2、公司 。 本标准主要起草人: 贾展慧、王刚、张计育、王涛、郭忠仁、宣继萍、张英、沈 强、王建 。 DB32/T 3806 2020 1 猕猴桃细菌性溃疡病监测规范 1 范围 本 标准规定了猕猴桃溃疡病的监测原理、监测准备、监测区域、监测时期、监测方法、可疑样本检 测方法、监测结论和资料保存。 本标准适用于江苏地区猕猴桃细菌性溃疡病的疫情监测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 23621 2009 农业植物检疫实验室基础条件 LY/T 1
3、681 2006 林业有 害生物发生及成灾标准 3 监测 原理 丁香假单胞菌猕猴桃致病变种( Pseudomonas syringae pv. actinidiae, Psa)属于薄壁菌门 ( Gracilicutes)变形菌纲( Proteobacteria)假单胞菌科( Pseudomonadaceae)假单胞菌属( Pseudomonas), 是引发猕猴桃细菌性溃疡病的致病细菌。 设置监测区域,通过踏查和调查, 依据猕猴桃细菌性溃疡病田 间症状(参见附录 A) 、可疑样本病原菌检测及 病原细菌生物学特征、致病 性 和 分子生物学检测鉴定结 果 进行 病害监测 。 4 监测准备 收集当地猕
4、猴桃属植物种植情 况、猕猴桃细菌性溃疡病发生历史和现状等相关资料,制定有效易行 的猕猴桃细菌性溃疡病监测计划。 5 监测 区域 5.1 一般要求 监测区域包含猕猴桃栽培种植果园、林场、种质资源圃、种苗繁育基地、砧穗繁殖圃、境外引进猕 猴桃种苗种植区等,重点监测红阳、金艳、楚红、 Hort 16A、西选 2 号等易感病猕猴桃品种的集中种植 区域。 5.2 未发生区 重点监测疫情高风险区域,包括毗邻发生区的区域、有猕猴桃细菌性溃疡病发生历史的果园、新建 果园;猕猴桃产品集散地周围猕猴桃种植区,通往疫情发生区域交通要道沿线猕猴桃 属、 种植物等。 5.3 发生区 DB32/T 3806 2020 2
5、 重点监测发生猕猴桃细菌性溃疡病的种植区及周边区域。 6 监测时期 在每年 34月春芽膨大期 和 910月初秋溃疡病发病小高峰时期 分别 进行 1次 监测 ; 11月下旬至来年 1 月期间遭遇大风、暴雨、极速降温等异常天气应及时增加 1次 监测 。 7 监测方法 7.1 访问调查 向果农、相关生产经营者、农技人员等询问调查当地猕猴桃种植和猕猴桃细菌性溃疡病发生的情况, 特别是苗木、接穗和花粉来源和有无猕猴桃细菌性溃疡病疑似症状等情况,将调查记录填入附录 B中表 B.1。 7.2 踏查 对访问调查过程中发现的疫情发生区、可疑发生区和高风险区域进行重 点踏查,踏查面积不小于被 查面积的 50%。以
6、自然界线、道路等为单位进行线路(目测)踏查,重点检查枝蔓及其分杈处、茎蔓幼 芽、皮孔、落叶痕和新生叶片等(参见附录 A第 A.4节)。 踏查发现可疑症状应直接采样进行室内检测。确认有疫情需进一步掌握危害情况的,应设 样方 做详 细调查。 7.3 样方 调查 7.3.1 种苗、接穗繁育基地样方设置与调查 样方的累积面积应不少于调查总面积的 5%。每块样方面积为 0.1 hm2,采取棋盘式取样法,抽取样 树 5株 10株,进行病害分级调查(参见附录 C)。 7.3.2 果园样方设置与调查 按果园面积设置, 10 hm2以下(含 10hm2)设 1块 样方 ,每增加 5 hm2增设 1块 样方 。每
7、块 样方 面积为 0.1 hm2,采取棋盘式取样法,抽取样树 10株,进行病害分级调查(参见附录 C),将调查数据填入附录 B中表 B.2。 8 可疑样本 检测方法 8.1 采集部位 所采集的 样品 应包含植物的 感病叶片、花蕾、嫩梢、枝条等 部分 , 应尽可能采集病株感病初期的部 位 ,以利于病原细菌的分离。 8.2 样品保存 样品置于聚乙烯袋内或其他合适容器内防止污染。样品应冷藏存放,避免受到阳光的照射。 8.3 实验室要求 DB32/T 3806 2020 3 猕猴桃细菌性溃疡病菌鉴定用实验室的设置与管理符合 GB/T 23621 2009中农业植物检疫实验室 基础条件要求。 8.4 常
8、规检测 8.4.1 溢菌检查 用手术刀取一小块病健交界处组织,放于载玻片上,向病变组织上滴 12滴无菌水或蒸馏水,加盖 玻片后在低倍显微镜下 ( 10X) 观察,检查在水滴与组织交界处是否有云雾状菌溢。 8.4.2 革兰氏染色检测 检查到菌溢的载玻片将植物组织移去,水滴干燥后通过火焰固定,采用结晶紫草酸胺染色法染色, 观察染色反应。 8.4.3 形态特征 检 测 病原菌分离纯化、保存过程参 见附录 D。 猕猴桃细菌性溃疡病菌落和病原菌形态特征参见附录 A第 A.6章,根据菌落特征选取可疑菌落做进一步 致病性测定和 分子生物学检验 。 8.4.4 致病性的测定 8.4.4.1 烟草过敏性反应 将
9、 8.4.3纯化的猕猴桃溃疡病病原菌菌株 划线培养后 ,取生长旺盛的菌株用平板计数法配成 3108CFU/mL 的菌悬液,采用表皮皮下注射法注射 2l菌悬液在六叶龄烟草叶片的细胞间,以注射 2l 蒸馏水为对照, 3次重复,置于 25 培养, 12h后观察 烟草叶片过敏性 反应。 8.4.4.2 常规接种测定 对 烟草叶片呈过敏反应 的菌株 ,取浓度为 3108CFU/ml的菌悬液 2l,对 红阳 猕猴桃 健康 叶片和枝条 进行 离体 针刺涂抹法接种,以蒸馏水接种为对照, 3次重复,置于 20 恒温保 湿环境, 5d后逐日观察其 发病情况,至 20d。 8.5 分子生物学检验 用已知的猕猴桃溃疡
10、病菌菌株作为阳性对照,非猕猴桃溃疡病菌的植物病原细菌作为阴性对照,无 菌水作为空白对照进行 PCR检测。待测菌株 DNA提取和 PCR检测方法参见附录 E,如采用市售的试剂盒, 按说明操作。 8.6 结果判定 8.6.1 症状识别判定 田间植株发病症状符合附录 A描述猕猴桃细菌性溃疡病典型症状,判定为猕猴桃细菌性溃疡病。 8.6.2 常规诊断判定 镜检有溢菌现象,革兰氏染色菌体呈红色,即呈现阴性反应,分离培养物在选择培养基上的菌落特 征和培养特性符合附录 A第 A.5章描 述,致病性测定产生典型症状,并再次从接种病斑成功分离病原菌, 确定病原菌为猕猴桃细菌性溃疡病菌。 8.6.3 分子生物学检
11、验结果判定 观察 PCR检测 电泳结果, 如 扩增产物的片断大小与附录 E第 E.6描章描述相符,可以判定样品携带猕 猴桃细菌性溃疡病病菌 , 否则为阴性反应,即样品不携带猕猴桃细菌性溃疡病病菌。 8.7 检验记录 DB32/T 3806 2020 4 检验记录应包括:样品来源、种类(品种)、时间,检测的时间、地点、方法和结果, PCR检测需 要有电泳结果照片等,并要有检测人员、审核人员签字。上述材料应归档并妥善保存。 9 监测结论 整理汇总猕猴桃细菌性溃疡病监测调查记 录,包括猕猴桃细菌性溃疡病的发生面积、发生范围、危 害程度和变化趋势,病原鉴定过程中的各类信息(包括照片、影像等)等详细资料
12、,并 根据 LY/T 1681 2006 林业有害生物发生及成灾标准评估疫情状况, 形成监测报告,按国家、省林业主管部门规 定上报。 10 资料保存 监测过程中的各类信息(包括照片、影像等)等详细资料应建立专门监测档案,妥善保存以备查。 DB32/T 3806 2020 5 A A 附 录 A (资料性附录) 猕猴桃细菌性溃疡病菌 (Psa)相关资料 A.1 英文名称 Kiwifruit bacterial canker A.2 学名 Pseudomonas syringae pv. actinidiae A.3 发病规律 溃疡病菌主要在枝蔓病组织内越冬,春季从病部伴菌脓溢出,通过风、雨、昆虫
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