GA T 1693-2020 法庭科学 DNA二代测序检验规范.pdf
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1、 ICS 13.310 A 92 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA GA/T XXXX XXXX 法庭科学 DNA 二代测序检验规 范 Forensic sciences Specifications for second generation sequencing-based DNA examination 2020-08-01 发布 2021-01-01 实施 中华人民共和国公安部 发 布 GA/T XXXXXXXX 目 次 前 言 . I 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 缩略语 . 4 5 总则 . 4 6 原理
2、. 4 7 检验器材和试剂 . 4 8 检验流程 . 5 9 数据分析 . 6 10 遗传参数计算 . 7 附 录 A( 资料 性附录 ) 法 庭科学 DNA二代测序检验记录表 . 8 GA/T XXXXXXXX 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出 的规 则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国刑事技术标准化技术委员会 法医检验 分 技 术委员会( SAC/TC 179/SC 6) 提出并 归口。 本标准起草单位: 公安部物证鉴定中心 、 四川大学 、 广东省 公安厅 。 本标准主要起草人: 叶健 、 季安全 、
3、 王乐 、 康克莱 、 侯一平 、 张驰 、 李海燕 、 刘开会 、 张广峰 。 GA/T XXXXXXXX 1 法庭科学 DNA 二代测序检验规范 1 范围 本标准规定了利用二代测序技术进行法庭科学人类 DNA遗传标记靶向 测序检验的术语和定义、原 理、检验器材和试剂、检验流程,以及数据 分析、遗传参数计算应遵守的基本要求 。 本标准适用于 针对各类法医学物证检材的 STR、 SNP、 InDel等遗传 标记以及线粒体 DNA进行二代测 序检验分析,为法庭科学实践提供遗传学信息 , 适用于所有从事法庭科学检验的 DNA实验室和产品制 造商 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必
4、不可少的。凡是注日期的引用文件 , 仅 注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件 ,其最 新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 27025 2019 检测和校准实验室能力的通用要求 GB/T 30989 2014 高通量基因测序技术规程 GB/T 35537 2017 高通量基因测序结果 评价要求 GA/T 383 2014 法庭科学 DNA实验室检验规范 3 术语和定义 下列 术语和定义适用于本文件。 3.1 DNA 测序 DNA sequencing 对 DNA分子的 核苷酸排列顺序的测定,即测定组成核酸分子的腺嘌呤( A)、鸟嘌呤( G)、胞嘧啶 ( C)和胸腺嘧
5、啶( T)的排列顺序。 3.2 二代 测序 second generation sequencing 区别于传统 Sanger(双脱氧法)测序, 能够 一次 并行 对 大量核酸分子进行序列测定的技术 , 通常 一次测序反应能产出不低于 100 Mb的测 序数据。 3.3 靶向测序 targeted sequencing 针对 特定基因集或基因组区域内已知和新型变异 进行测序,有效降低测序成本,提高 测序深度 , 更为有效地研究特定区域的 遗传变异 。 3.4 桥 式 PCR bridge polymerase chain reaction GA/T XXXXXXXX 2 文库 两端的 DNA序
6、列与芯片表面固定的引物序列特异性结合,以文库 DNA为模板,进行桥形扩增。 通过不断 变性和扩增的循环过程使得每个 DNA片段在各自的位置上复制集中成束,生成 DNA簇。每个 DNA 簇 包含成千上万单克隆扩增子,以每个 DNA 单链为模板, 逐个合成 DNA 互补 链,将碱基信号强度 放大,进而达到测序所需信号的强 度。 3.5 乳化 PCR emulsion polymerase chain reaction 将用于 PCR反应的水相体系与油相体 系混合,形成大量油包水的微乳液独立 PCR反应空间,如果 PCR 反应体系中加入的核酸模板数量合适,每个独立反应空间中将只有一个模板分子 。在形
7、成的 独立 反应空 间 中 进 行 相同模板的 平行扩增,即可得到大量相同的扩增结果,实现 基因扩增。 3.6 DNA 纳米球 DNA nanoball 在 二代测序的模板扩增过程中,先将 DNA进行片段化处理,加接头序列和环化,形成单链环状 DNA, 然后通过滚环扩增将单链环状 DNA扩增 2 3个数量级最终产生 的产物。 3.7 单次测序 single run sequencing 测序仪器运行一个测序流程,如一次单向测序或一次双向测序的行为。 GB/T 30989-2014,定义 3.20 3.8 文库 library 通 过生物来源的 、人工合 成的 或克隆技术等所得到的一个重建分子群
8、,如基因组文库、互补 DNA 文库、噬菌体展示肽文库等。 GB/T 30989-2014,定义 3.5 3.9 接 头 adapter 用于标记和固 定待测序片段的一小段已知序列 的 DNA 片 段 。 3.10 标签或 条码 index; barcode 一段特 征性的脱 氧核苷酸短片 段,在多样本混合检测时,充当 识别特定样本来源的唯一标志。 3.11 测序通量 throughput of gene sequencing 单次测序可获 得序列信息的基因片段数量或可测 定的脱氧 核糖核酸 和 核 糖核酸(以 碱基表示)数 量。 GB/T 30989-2014,定义 3.21 3.12 测序
9、读长 read length of gene sequencing GA/T XXXXXXXX 3 测序 能测得的最长 DNA片段的长度,通常以碱基数表示。 GB/T 30989-2014,定义 3.24 3.13 测序深度 depth of sequencing 待测样本中某个指定的核苷酸被检测的次数 。 GB/T 30989-2014,定义 3.31 注 : 对于 STR 的 二代测序, 指 待测样本中某条指定的序列被检测的次数。 3.14 测序准 确率 accuracy of gene sequencing 对已知序列的基因进行测序,获得的正确碱基数占可识别的碱基数比例。 GB/T 30
10、989-2014,定义 3.25 3.15 碱基识别正确 率 accuracy of base calling 单次测序正确碱基数占碱基总数的比例。 GB/T 30989-2014,定义 3.27 3.16 碱基识别错误率 inaccuracy of base calling 单次测序错误碱基数占碱基总数的比例,与碱基识别正确率( 3.15)相对。 GB/T 30989-2014,定义 3.28 3.17 碱基识别质量 quality of base calling 衡量 碱基正确识别的概率,通常以数字值直接表示。 碱基识别质量与碱基识别错误率之间的关系可用式( 1)表示: Q = 10lg
11、P ( 1) 式中: Q 碱 基识别 质量; P 碱基识别错误率。 GB/T 30989-2014,定义 3.29 3.18 等位基 因覆盖 度 比 allele coverage ratio 基因座 分型 为 杂合子 时, 两个等位基因 的 测序 深度 的 较低 值 与 较高 值 的比 值 ( 0 ACR 1) ,常 用 于 评估 基因座内 测序信号的均衡性。 3.19 有效序列 effective read 测 序结果中,所有能比对到参考基因组的目标区域序列数占所有测序序列数的比例。 GA/T XXXXXXXX 4 4 缩略语 下 列 缩 略语适 用于本文件。 ACR:等位基因覆盖度比 (
12、 Allele Coverage Ratio) DNA:脱氧核糖核酸( Deoxyribonucleic Acid) DNB: DNA纳 米球( DNA Nanoball) EPCR: 乳化 PCR( Emulsion Polymerase Chain Reaction) InDel: 插入缺失多态性( Insertion Deletion Polymorphism) PCR:聚合酶链式反应( Polymerase Chain Reaction) SNP:单核苷酸多态性( Single Nucleotide Polymorphism) STR:短串联 重复序列( Short Tandem Re
13、peat) 5 总则 5.1 鉴定人应具有法医 物证鉴定执业资格 ,熟 悉并 掌握基 于 二代 测序进行法 庭科 学遗传标记 检验 的 原理 和方法 ,并能正确使用分析软件对测序结果进行分析与评价。 5.2 实验室应有完 备的文书体系,准确、清晰、完整地记录实验流程和结果, 相关格式 参 见 附录 A。 原始记录、报告等 应 归档留存,保证其具有可追溯性。 5.3 实验室的环境 与设施应符合 GB/T 27025 2019的规定。为了有效 防止 DNA 污染,实验室 应 设置 分隔 独立的工作区域 进 行 PCR扩增前 操作 (试剂配制、 样本制备等) 和后续 PCR扩增、测序分析等检 验 操
14、作, 并标识区分 不同工作区 , 各区间不能直 通 。 所有实验操作 应 在 规 定区域进 行。 6 原理 将生物样 本 制备成待测样品, 通过桥式 PCR、乳化 PCR 或 DNA 纳米球扩增等 PCR 扩增技术,将待 测样品放大收集成库,然后进行平行循环测序。 利用边合成边测序的策略, 加入一种或多种带标记或 不带标记的底物核苷酸,在聚合酶的作用下,按照碱基互补配对原理,进行 DNA链的延伸,延伸一轮 测取一轮底物与模板结合后发出 的信号 , 包 括 荧光信号、电信号 或 半导体芯片检测的 离 子 信号 等, 收 集该信号并确定所测 位点的碱基信息 。 当上一轮测序完成后,重复测序过程,即
15、实现 大规模并行 基因 测序 。 7 检验器材 和 试剂 7.1 通则 7.1.1 对于 采用的 检验器材和 试剂等产品 需 按照 GB/T 27025 2019的要求经方法确认后方可使用于 日常检案。 7.1.2 对 于 采用的商业化或自行开发的法庭科学遗传标记二代测序检测试剂 需 进行质量评价 验证 , 包括但不限于准确性、灵敏度、稳定性、 一致性、均衡性、 种属特异性及遗传标记的群体遗传学参数 调查。 7.2 器材 主 要 检验器材 包括 : GA/T XXXXXXXX 5 a) 二代测序仪 , 基 本 参数要求包括: 碱基识别质量 大于 20, Q值过滤 之 后的准确率 大于等于 99
16、.9%; b) PCR 仪; c)荧光定量 PCR仪 ; d) 离心机; e) 低温 冰箱; f) 移液器。 7.3 试剂 主要检验试剂 包括 : a) DNA 提取试剂,用于释放 、分离 获得各类生物样本中的所有 DNA并进行纯化 ; b) PCR复合扩增试剂 , 用于 大规模平行 复合 扩增 针对 STR、 SNP、 InDel等遗传标记 或线粒体 DNA 的 各 目标位点 靶 序列 ,试剂盒内至少应包含:扩增引物、高效扩增酶 及 缓冲液 ; c) 文库构建试 剂 , 用 于 核 酸样品 的 测序 文库构 建,试 剂盒内至少应包 含: 接头 、 DNA 连接酶 或 DNA聚合酶、缓冲液 ;
17、 d) 测序试剂 , 用于对测序文库进行 二代 测序,试剂盒内至少应包含 :测序引物、高效测序 反应 酶 及 缓冲液 。 8 检验流 程 8.1 通则 检验流程应符合相应试剂说明书和仪器操作规范要求, 并 进行 实验室 内部方法验证 , 制定相应的 作业指导书,内容 至少 包括: a) 检验步骤 : 至少 包括 DNA提取与定量、测序文库 构建 、测序文库 纯化 与 定量 、测序 检验 等 ; b) 质量 控制 :至少包括 DNA 质量和浓度控制、文库 浓度控制、测序 原始 数据质量 控制、 测序 结 果 质量 评价 等 。 8.2 DNA 提取 与纯化 按照 GA/T 383 2014 的方
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