GA T 1601-2019 法庭科学 生物检材中芬太尼检验 液相色谱-质谱法.pdf

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1、 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA GA/T 法庭科学 生物 检材 中 芬太尼 检验 液相色谱 -质谱 法 Forensic sciences Examination methods for fentanyl in biological samples LC-MS - -发布 - -实施 中华人民共和国公安部 发布 ICS 13.310 A 92 GA/T I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员

2、会（ SAC/TC 179/SC 1） 提出并 归口。 本标准 起草 单位：公安部物证鉴定中心 、 杭州市 公安司法鉴定中心 。 本标准 主要 起草人： 董颖、王瑞花、栾玉静、 任昕昕、宋歌、 董林沛、 于忠山、何毅、王芳琳、张 蕾萍、常靖、 王炯、张云峰 、应剑波、卓晓聪、李晓飞、田国刚 。 GA/T 1 法庭科学 生物 检材 中芬太尼 检 验 液相色谱 -质谱法 1 范围 本标准规定了 法庭科学 生物检材 （ 血、尿、肝、肾、胃及胃内容等 ） 中芬太尼的液相色谱 -质谱（ LC-MS） 的 定性定量 检验方法。 本标准适用于 法庭科学 生物检材中芬太尼的定性分析和定量分析 。 其 他 可疑

3、 样 品 中芬太尼的定性分 析和定量分析 可参照 使用 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。 4 原理 以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求 对生物检材进行提取、净化及浓缩， 采用 液相色 谱 -质谱法 定性定量 ，以保留时间、质谱特征离子碎片峰和相对丰度 比 作为定性判断依据； 以峰面积为

4、依据，采用 外标法 进行定量分析。 5 试剂 和 材料 5.1 试剂 实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的一级水。除非另有说明，在分析中使用的试剂均为分析纯， 试 剂包括： a） 甲醇 （色谱纯） ； b） 乙腈 （色谱纯） ； c） 氨水 ； d） 盐酸 ； e） 乙酸 铵 ； f） 标 准溶液 ： 1) 1.0mg/mL 标准 物质溶 液 ： 根据芬太尼标准物质纯度和盐型换算后，用甲醇配制 1.0mg/mL 芬太尼 标准物质溶液，置于冰箱中冷藏保存。有效期 6 个月。或采用市售标准溶液 ； 2） 0.1mg/mL 标准 工作溶液 ： 移 取 1.0mg/mL 标准物质溶液 1.0m

5、L，用甲醇稀释至 10mL，混 匀， 密封，置于冰箱中冷藏保存 。有效期 3 个月 。 实验中所用其 他 浓度的混合标准工作溶 液均由 0.1mg/mL 标准物质溶液用甲醇稀释得到。 GA/T 2 注： 特殊情况下可使用对照溶液代替标准溶液 。 5.2 材料 材料包括 ： a) 具 盖 离心管； b) 有机 系 微孔 滤膜： 0.22m； c) 混合型 阳离子交换 （ MCX） 固相萃取柱：基质为苯磺酸化的聚苯乙烯 -二乙烯苯高聚物，使用 前依次用 1mL 甲醇 、 1mL 水活化。 6 仪器 和设备 仪器和设备包括： a） 液相色谱 -质谱仪：配有电喷雾离子源（ ESI）和三重四极杆或离子阱

6、质量分析器； b） 电子天平； c） 离心机； d） 振荡器； e） 移液器 。 7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品 提取 7.1.1.1 固相萃取 移 取 血 液 等液体 检材 样品 1.0mL 2.0mL， 或称取 铰 碎 的 肝 脏 等 固体 检材 样品 1.0g 2.0g 于具盖离 心管中。 加 入 0.1mol/L 盐酸 4mL，振荡 15min， 8000r/min 离心 15min， 取上清液转移至 已活化好 的 MCX 固相萃取柱 中，依次 用 0.1mol/L 盐酸 1mL、甲醇 1mL 淋洗，弃去淋洗液， 挤干水 分 或离心或真空抽固 相萃取柱 2min， 用

7、 1mL 5%的氨水 /甲醇 溶液 （体积比 5:95） 进行洗脱，收集洗脱液， 置于浓缩器上 45 浓缩至干，残留物用甲醇 200L 溶解，用 0.22m的 有机 系 微孔滤膜过滤， 供 仪器 分析。 7.1.1.2 质控 样品制备 取等量相似基质的空白样品（若无相似基质空白样品可用血液替代）两份于具盖离心管中，一份作 为空白样品，一份添加芬太尼标准物质 ，作为添加样品（添加样品的浓度为 10ng/mL(g)） ，与检材样品 平行操作，得到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器 分析 。 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器 条件 7.1.2.1.1 液相色谱 -质谱仪（离子阱质量分析器

8、） 条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器 和不同样品等 实际情况进行调整： a) 色谱柱： XTerra RP18液相色谱柱 （ 2.1mm150mm， 3.5m） 或其他等效 色谱柱 ； 注： XTerra RP18 是 Waters 公司产品的商品名称，给 出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产 品的认可。如果 其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 流动相： 65%乙腈 :35%5mmoL/L 乙酸 铵（氨水调 节 pH 至 9.5） ； GA/T 3 c) 柱温： 30； d) 流速： 0.2mL/min； e) 进样量： 10L； f) 离子源：电

9、喷雾电离（ ESI）； g) 检测方式：正离子 ； h) 毛细管电压： 4.5kV； i) 毛细管温度： 300； j) 雾化气流速： 35arb； k) 锥孔气流速： 5arb； l) 相对碰撞能： 32%； m) 扫描模式：采用一级、二级质谱同时全扫描 （ SCAN） 。 7.1.2.1.2 液相色谱 -质谱仪（三重四 极 杆质量分析器）条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器 和不同样品等 实际情况进行调整： a) 色谱柱： ACQUITY UPLC BEH C18柱 (2.1mm50 mm,1.7m)或其他 等效 色谱柱 ； 注： ACQUITY UPLC BEH C18是 Water

10、s公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表 示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效 产 品 。 b) 流动相： A:乙腈， B:5mmoL/L乙酸 铵 (氨水调节 pH至 9)； c) 洗脱：梯度洗脱，梯度见表 1； 表 1 梯度洗脱条件 时间 min A B - 10% 90% 1.5 90% 10% 2.2 90% 10% 2.5 10% 90% 4.0 10% 90% d) 柱温： 35； e) 流速： 0.3mL/min； f) 进样量： 10L； g) 离子源：电喷雾电离（ ESI）； h) 检测方式：正离子 ； i) 毛细管电压

11、： 3.0kV； j) 源温度： 150； k) 雾化气流速： 600L/h； l) 锥孔气流速： 50L/h； m) 扫描模式：多反应离子监测（ MRM）； n) MS 参考 条件 （ 定性、定量离子 对 和锥孔电压、碰撞能量 ） 见表 2。 表 2 MS 参考 条件 检测 目标物 定量离子 对 定性离子 对 锥孔电压 V 碰撞能量 eV 芬太尼 336.49 187.90 336.49 104.94 24 36 336.49 187.90 22 GA/T 4 7.1.2.2 进样 分别吸取 检材、空白 和 添加样品提取液 及 标准工作溶液，按 7.1.2.1的 分析条件进样分析。 7.2

12、定量分析 7.2.1 样品 提 取 移 取 血液 等液体 检材 样品 1.0mL 2.0mL， 或称取绞碎的 肝脏等固体 检材 样品 1.0g 2.0g各 两份 ，按 7.1.1进行操作。 另取等量相似基质的空白样品三份，其中两份分别添加芬太尼标准物质作为添加样品（添加样品中 目标物含量应为检材样品中目标物含量的 (10050)%），另一份作为空白样品，与检材样品平行操作， 得到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器检测。 7.2.2 仪器检测 7.2.2.1 仪器 条件 按 7.1.2.1规定的条件分析 。 7.2.2.2 进样 分别吸取 检材、 空白和 添加样品提取液 及 标准工作溶 液 ，

13、按 7.1.2.1 的 分析条件每个样品进样分析 2 3 次。若要报告测量不确定度，每个样品分析次数应 不少 于 6 次。 7.2.3 计算 7.2.3.1 计算含量 记录各样品 提取液 平行进样 2 3 次 的 目标物 保留时间和 峰面积值，按公式（ 1）计算含量： 添样添 样添样 VMA VMAW = . (1) 式中： W 检材样品中目标物 的含量，单位为微克每克（ g/g）或微克每毫升（ g/mL）； A 样 检材 样品 提取液 中目标物峰面积平均值； M 添 添加样品中 目标物 添加量，单位为微克（ g）； V 样 检材 样品的定容体积 ，单位为毫升（ mL）； A 添 添加样品 提

14、取液 中目标物峰面积平均值； M 样 检材 样品的取样量，单位为克（ g）或毫升（ mL）； V 添 添加样品的定容体积，单位为毫升（ mL）。 7.2.3.2 计算 相对相差 记录 两份 平行操作的 检材 样品 中目标物的 含量，按公式（ 2）计算相对相差： %10021 = X XXRD . (2) 式中： RD 相对相差 ， 用百分比（ %）表示 ； X1、 X2 两个 检材 样品平行定量测定的含量数值； X 两个 检材 样品平行定量测定含量的平均值 。 GA/T 5 8 结果 评价 8.1 定性结果评价 8.1.1 阳性结果评价 在相同条件下进行样品测定时，检材样 品中目标物的色谱峰保

15、留时间与标准溶液一致（ 相对误差在 2.5%之内）、目标物的定性离子（至少两对定性离子）与标准溶液一致，且离子丰度比与浓度接近的 标准溶液相比，相对偏差不超过表 3规定的范围，空白样品无干扰，则可判断检材样品中检出目标物。 相关谱图参见附录 A。 表 3 离子 相对丰度比 最大允许 相对 偏差 范围 离子丰度比 50% 20% 50% 10% 20% 10% 最大允许 相对 偏差 20% 25% 30% 50% 8.1.2 阴性结果评价 检材样品未出现与目标物标准溶液一致的色谱峰，且添加样品中出现与目标物标准溶液 一致的色谱 峰，空白样品无干扰，则可判断检材样品中未检出目标物。本方法检出限参见

16、附录 A。 8.2 定量结果评价 如果检材样品中目标物含量的 RD 20%，定量数据可靠， 其含量按两份检材样品的平均值计算。 如果检材样品中目标物含量的 RD20%，定量数据不可靠。 应按 7.2重新提取检验。 芬太尼的 中毒资料参见附录 B。 GA/T 6 附 录 A （资料性附录） 芬太尼 的 检出限及 相关 谱 图 芬太尼的相关 谱 图见图 A.1 和 图 A.2。 本方法 芬太尼的 检出限为 1ng/mL(g)。 R T : 0 . 0 0 - 9 . 0 3 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5 2 . 0 2 . 5 3 . 0 3 . 5 4 . 0 4 . 5 5

17、. 0 5 . 5 6 . 0 6 . 5 7 . 0 7 . 5 8 . 0 8 . 5 9 . 0 T i m e (m i n ) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 R e l a t i ve Ab u n d a n ce 3 . 2 1 2 . 2 3 1 . 1 3 1 . 9 31 . 4 9 4 . 1 12 . 3 8 5 . 4 15 . 1 0 5 . 7 34 . 5 7 6 . 1 3 6 . 2 9 7 . 1 80 . 5 9 6 . 8 50 . 1 8 7 . 4 1

18、7 . 8 0 8 . 6 08 . 1 2 N L : 7 . 1 6 E6 T I C F : + c ES I F u l l m s 2 3 3 7 . 0 0 3 2 . 0 0 9 0 . 0 0 -4 0 0 . 0 0 M S 5 0 0 n g m l 0 3 _ 0 8 0 9 0 4232412 图 A.1 芬太尼色谱图 GA/T 7 5 0 n g m l # 157 R T : 3 . 1 7 AV: 1 NL: 5 . 6 0 E5 F: + c ES I F u l l m s 2 3 3 7 . 0 0 3 2 . 0 0 9 0 . 0 0 -4 0 0 .

19、0 0 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 m / z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 R e l a t i ve Ab u n d a n ce 1 8 8 . 0 7 3 3 7 . 1 7 2 1 6 . 0 4 1 9 0 . 0 5 2 8 1 . 1 1 2 4 4 . 0 41 3 4 . 0 11 0 5 . 0 9 1 4 6 . 0 9 3 1 8 . 9 12 2 0 . 4 21 5 7

20、 . 9 5 3 7 3 . 1 62 7 6 . 0 41 1 9 . 9 4 图 A.2 芬太尼 二级 质谱图 GA/T 8 附 录 B （资料性附录） 芬太尼 的 中毒 诊断 参考 资料 B.1 理化性质 芬太尼，英文名 Fentanyl, 是 60 年代研制合成的阿片类药物，主要用于麻醉，化学名称为 N- 1-(2- 苯乙基 )-4-哌啶基 -N-苯基 -丙酰胺，分子式为 C22H28N2O（分子结构见图 B.1），分子量为 336.46，熔点 83 84，脂溶性（辛酸 /水 =814）为吗啡的 1000 倍，最小致死量约为 2mg。 图 B.1 芬太尼的分子结构 B.2 毒理作用 首

21、次使用阿片制剂的患者，芬太尼的最小止痛血清浓度范围为 0.3ng/mL 1.5ng/mL。在血清浓度 高于 2ng/ml 以上时副作用的发生频率增加（与度冷丁相比，芬太尼具有更大的作用效果和安全范围）。 静脉注射 1min 即起效， 4min 达高峰，维持 30min 60min；肌内注射时约 7min 8min 发生镇痛作用， 可维持 1h 2h。肌内注射生物利用度 67%，蛋白结合率 80%，消除 T1/2约 3.7h。芬太尼吸收后在肝脏 快速代谢，其主要代谢途径为 N-去烷 基、水解去丙酰 基及苯基、哌啶环和支链的羟化反应 ， 其中主要 为 N-去烷基芬太尼和去丙酰基芬太尼。芬太尼大部分以代谢产物的形式经尿和粪便排泄，约 75的芬 太尼主要以代谢产物的形式排泄入尿，原形药物少于 10；约 9的使用量以代谢产物的形式排泄入粪 便。血浆中未结合的芬太尼平均值估计为 13 21，代谢产物与约 10的原形药由肾脏排出。 _