GA T 1604-2019 法庭科学 生物检材中地西泮等23种药物检验 快速溶剂萃取气相色谱-质谱法.pdf

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1、 ICS 13.310 A 92 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA GA/T 法庭科学 生物检材中地西泮等 23 种药物 检验 快速溶剂萃取气相色谱 -质谱法 Forensic sciences Examination methods for 23 sedative-hypnotics including diazepam in biological samples Accelerated solvent extraction GC-MS - -发布 - -实施 中华人民共和国公安部 发布 GA/T XXXX XXXX I 前 言 本标准按照 GB/T1.1 2

2、009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会（ SAC/TC 179/SC 1）提出 并 归口。 本标准起草单位：杭州市公安局刑事科学技术研究所 。 本标准主要起草人 ： 应剑波、李晓飞、罗永此、 唐磊 、田国刚 、程建波、 卓晓聪 、于海群 。 GA/T XXXX XXXX 1 法庭科学 生物 检材 中地西泮等 23 种药物检验 快速溶剂萃取气相色谱 -串联质谱方法 1 范围 本标准规定了法庭科学生物检材（血、尿、肝、肾、胃及胃内容等） 中地西泮等 23 种药物的快速 溶剂

3、萃取气相色谱 -串联质谱 （ ASE -GC-MS/MS）定性定量 检验方法。 本标准适用于法庭科学 生物 检材中 23种药物的定性分析和定量分析。其他可疑样品中 地西泮等 23 种药物的定性分析和定量分析 可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用 于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件 。 4 原理 以 空白样品和添加样品 作对照，

4、按平行操作的要求， 用 快速溶剂萃取仪 （ ASE）对生物检材 进行提 取、净化 及 浓缩， 采 用气相色谱串联质谱法 进行定性定量 ，以保留时间 、 一级质谱或二级质谱的特征 离子碎片峰和 相对丰度比 作为定性判断依据；以峰面积为依据，用外标法计算样品中药物的含量。 5 试剂 和仪器 5.1 试剂 实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的三级水。除非另有说明，在分析中使用的试剂均为 色谱 纯，试 剂包括： a) 环己烷； b) 乙酸乙酯 ； c) 丙酮 ； d) 二氯甲烷 ； e) 甲醇 ； f) 无水硫酸钠 （分析纯） ； g) pH 值 10.0 缓冲液： 1) 0.1 mol/L

5、氢氧化钠溶液 ：称取氢氧化钠 0.4g，用水溶解并稀释至 100mL； 2) 0.4 mol/L 硼酸溶液 ：称取硼酸 2.44g，用水溶解并稀释至 100mL； GA/T XXXX XXXX 2 3) 0.4 mol/L 氯化钾溶液 ：称取 氯化钾 2.98g，用水溶解并稀释至 100mL； 4) 量取 0.1 mol/L 的氢氧化钠溶液 43.7 mL， 加入 0.4 mol/L 的硼酸溶液 12.5 mL，再 加入 0.4 mol/L 的氯化钾溶液 12.5 mL， 混合均匀 ，得到 pH 值 10.0 缓冲液 ； h) pH 值 6.0 缓冲液：称取磷酸二氢钠 6.0g，用去离子水 4

6、50mL 溶解， 混 匀，用 1.0mol/L 氢氧化 钠溶液调 pH 值至 6.0，用水定容至 500mL； i) 标准溶液： 1) 1.0mg/mL 标准物质溶液 ： 根据地西泮等 23 种标准物质（ 23 种药物的基本信息参见附录 A） 的纯度和盐型换算后，各称取适量，分别用甲醇配制 1.0mg/mL 的标准储物质溶液，置 于 冰箱中冷藏保存。有效期 12 个月。或采用市售标准溶液； 2) 20.0g /mL 混合标准工作 溶 液：移取 1.0 mg/mL 的标准储备液各 1.0 mL，用甲醇稀释并 定容至 50mL 混匀，配制成浓度为 20.0g /mL 的 混合标准工作溶液， 置于冰

7、箱中冷藏保 存。有效期 6 个月。 实验中所用其 他 浓度的混合标准工作溶液均由 1.0mg/mL 标准物质溶 液用甲醇稀释得到。 注： 特殊情况下可使用对照溶液代替标准溶液。 5.2 材料 材料包括： a) 颗粒状硅藻土 ； b) 中性三氧化二铝 ： （ 100 200） 目 ，使用前在 130下活化 3h，冷却后按 6%比例加水搅拌均匀 ， 装入原瓶，平衡 24h后备用 ； c) 硅镁吸附 剂 ： （ 80 100） 目 ， 使用前在 130下活化 20h，冷却后按 4%比例加水搅拌均匀，装 入原瓶，平衡 24h后备用 ； d) 具盖离心管； e) pH试纸 ： 范围 1 14。 6 仪器

8、和设备 仪器和设备包括： a) 气相色谱 -串联质谱仪：配有电子轰击源（ EI）和三重四极杆质量分析器 ； b) 快速溶剂萃取仪 ； c) 凝胶色谱净化浓缩联用仪 ； d) 离心机 ； e) 移液器 ； f) 电子 天平 ； g) 浓缩器 。 7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品 提取 7.1.1.1 快速溶剂萃取 移取血液等液体检材 样品 1.0mL 3.0mL，或称取铰碎 （或匀浆） 的肝脏等固体检材样品 1.0g 3.0g， 加入 pH值 6.0的缓冲液 0.5mL， 混 匀，再加入 5g的硅藻土搅拌均匀后，倒入底部装有 5g中性三氧化二铝 GA/T XXXX XXXX 3

9、或 硅镁吸附剂 的 萃取池 中，按照 7.1.2.1.1条件进行操作。萃取完毕后，转移萃取液至试管中，高速离心 后取出有机相，按 7.1.2.1.2的条件用 凝胶色谱净化浓缩联用仪 浓缩至 0.5mL供分析，或置于浓缩器上在 温度 40 浓缩至干，残留物用甲醇 0.5mL溶解， 作为检材样品提取液供 仪器 分析。 7.1.1.2 质控样品的制备 取 等量相似基质的空白样品 （若无相似基质空白样品可用血液替代） 两份，一份作为空白样品，一 份添加地西泮等 23种物质，作为添加样品 （添加样品浓度为 0.1g/mL） ，与检材样品平行操作，得到空 白样品提取液和添加样品提取液供仪器 分析 。 7.

10、1.2 仪器 检测 7.1.2.1 仪器条件 7.1.2.1.1 快速溶剂萃取条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品 等 实际情况进行调整 ： a) 系统压力： 10 MPa； b) 萃取池 温度： 110； c) 静态萃取时间： 6min； d) 静态萃取次数： 2 次； e) 溶剂冲洗体 积： 萃取池体积的 60%； f) 氮气吹扫时间： 100s； g) 萃取溶剂 ： 乙酸乙酯 /环己烷 /丙酮（体积比 2 2 1） 混合溶剂 或二氯甲烷 /环己烷 /丙酮（体积 比 1 1 1） 混合溶剂 。 7.1.2.1.2 凝胶色谱净化浓缩联用仪条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器

11、和不同样品 等 实际情况进行调整 ： a) 净化柱： 20mm300mm，填料 50.0g 中性 多孔的交联苯乙烯二乙烯基苯聚合物或类似物 ； b) 流动相：环己烷 /乙酸乙酯 （体积比 1:1）混合溶剂； c) 流速： 4.70mL/min； d) 收集时间： 收集 500s 1400s 的洗脱液； e) 浓缩腔温度 ： 40 。 7.1.2.1.3 气相色谱 -串联质谱条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品 等 实际情况进行调整： a) 色谱柱： VF-5MS 弹性石英毛细管柱（ 30m0.25mm0.25m） 或其他等效柱 ； 注： VF-5MS 柱 是 Agilent 公司

12、产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品 的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 色谱柱温程 ： 100 保持 1min，以 20 /min速率升至 280 ，保持 15min； c) 进样口温度： 280 ； d) 载气：高纯氦气； e) 载气流量： 1.0mL/min，恒流； f) 进样方式：分流进样 ， 分流比 10： 1； g) 进样体积： 1L； h) 传输线温度： 280 ； i) 离子源温度： 230 ； GA/T XXXX XXXX 4 j) 扫描方式： SCAN； k) 扫描范围： 45amu 450amu； l)

13、 EI 源轰击能量： 70eV； m) EDR 电压： 1300V； n) 碰撞气：高纯氩气，压力为 1.8mtorr； o) 离子化方式： EI+； p) 检测方式：多反应 离子 监测（ MRM）； q) MS/MS 质谱条件 （定性离子对、定量 离子对、 碰撞能量 ）： 见表 1。 表 1 MS/MS 质谱 条件 名称 定性离子对 定量离子对 碰撞能量 eV 巴比妥 141 80 156 141 15 156 141 10 异戊巴比妥 141 80 156 141 15 156 141 10 戊巴比妥 141 80 156 141 15 156 141 10 司可巴比妥 167 124 1

14、68 153 10 168 153 10 苯巴比妥 204 161 204 161 10 204 115 25 扑尔敏 167 139 203 167 30 203 167 25 丙咪嗪 234 217 234 217 35 280 235 10 异丙嗪 284 72 284 72 10 284 213 5 卡马西平 193 165 236 193 25 236 193 10 地西泮 256 221 256 221 20 283 238 20 氯普噻吨 221 176 221 176 30 221 189 25 氯丙嗪 272 257 318 86 20 318 86 15 咪达唑 仑 310

15、 257 310 257 25 310 290 20 氟硝西泮 285 239 312 266 15 312 266 15 三氟拉嗪 407 113 407 141 20 407 141 14 硝西泮 206 151 280 234 25 280 234 15 GA/T XXXX XXXX 5 表 1 MS/MS 质谱 条件 （续） 唑吡坦 235 92 235 65 25 235 65 30 氯硝西泮 280 234 314 268 25 314 268 15 氯氮平 243 181 243 208 15 243 208 15 艾司唑仑 259 205 259 205 15 294 259

16、10 阿普唑仑 204 176 279 243 15 279 243 15 扎来普隆 263 248 305 262 10 305 262 15 三唑仑 313 243 342 313 25 342 313 15 7.1.2.2 进样 别吸取检材、空白和添加样品提取液及标准工作溶液，按 7.1.2.1的分析条件进样分析。 7.2 定量分析 7.2.1 样品 提取 移取血液等液体检材样品 1.0mL 3.0mL，或称取铰碎（或匀浆）的肝脏等固体检材样品 1.0g 3.0g 两份，按 7.1.1进行操作。 另取相同基质的空白样品三份，其中两份加入标准工作溶液 （添加样品中目标物含量应为检材样品 中

17、目标物含量的 (10050)%）另一份作为空白样品，与检材样品平行操作，得到空白样品提取液和添加 样品提取液供仪器检测。 注 ： 对 巴比妥、戊巴比妥、异戊巴比妥、司可巴比妥、苯巴比妥以外的 药物进行定量时，可将 pH 值 6.0 的缓冲液 替换为 pH 值 10.0 的缓冲液，其余步骤相同。 7.2.2 仪 器 检测 7.2.2.1 仪器条件 按 7.1.2.1规定的条件分析 。 7.2.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液及标准工作溶液，按 7.1.2.1的分析条件每个样品进样分析 2 3次。若要报告测量不确定度，每个样品分析次数应不少于 6次。 7.2.2.3 计算 7.2.

18、2.3.1 计算 含量 记录各样品 提取液 平行进样 2 3 次中目标物质的峰面积值，按公式（ 1）计算含量： GA/T XXXX XXXX 6 %1 0 0M = 添样添 样添样 VMA VAW . (1) 式中： W 检材样品 中目标物的含量，单位为微克每克 （ g/g） 或微克每毫 升（ g/mL） ； A 样 检材 样品提取液 中目标物峰面积平均值； M 添 添加样品中 目标物 添加量，单位为微克 （ g） ； V 样 检材 样品 的定容体积，单位为毫升 （ mL） ； A 添 添加样品 提取液 中目标物峰面积平均值； M 样 检材 样品 的取样量，单位为克 （ g） 或毫升 （ mL

19、） ； V 添 添加样品的定容体积，单位为毫升 （ mL） 。 7.2.2.3.2 相对相差计算 记录两份平行操作的 案件 样品含量，按照公式（ 2）计算相对相差。 %10021 = X XXRD . (2) 式中： RD 相对相差 ， 用百分比（ %）表示 ； X1、 X2两个检材样品平行定量测定的含量数值； X 两个检材样品平行定量测定含量的平均值。 8 结果评价 8.1 定性结果评价 8.1.1 阳性结果评价 在相同条件下进行样品测定时，检材样品中目标物的色谱峰保留时间与标准溶液一致（相对误差在 1%之内）、目标物的定性离子（至少两对定性离子）与标准溶液一致，且离子丰度比与浓度接近的标

20、准溶液相比 ， 相对偏差不超过表 2规定的范围，空白样品无干扰，则可判断检材样品中检出目标 物。 23 种药物的 相关 谱图参见附录 B。 表 2 离子丰度比的最大允许相对偏差范围 离子丰度比 50% 20 50 10 20 10% 最大允许相对偏差 20 25 30% 50% 8.1.2 阴性结果评价 检材样品未出现与目标物标准溶液一致的色谱峰，且添加样品中出现与目标物标准溶液一致的色谱 峰，空白样品无干扰，则可判断检材样品中未检出目标物。 本方法 23种药物检出限参见附录 C。 8.2 定量结果评价 如果目标物含量的 RD 20%，定量数据可靠，其含量按两份检材的平均值计算。如果 检材样品

21、中 目标物含量的 RD 20%，定量数据不可靠。应按 7.2重新提取检验。 23种药物的回收率和检出限参见附 录 C。 GA/T XXXX XXXX 7 附 录 A （资料 性附录） 23 种药物的基本信息 23 种 药物 的相关信息见表 A.1。 表 A.1 23 种 药物 的相关信息 编号 中文名称 CAS 编号 英文 名称 分子式 1 巴比妥 57-44-3 Barbital C8H12N2O3 2 异戊巴比妥 57-43-2 Amobarbital C11H18N2O3 3 戊巴比妥 76-74-4 Pentobarbital C11H18N2O3 4 司可巴 比妥 76-73-3 S

22、ecobarbital C12H18N2O3 5 苯巴比妥 50-06-6 Phenobarbital C12H12N2O3 6 扑尔敏 113-92-8 Chlorpheniramine C16H19ClN2 7 丙咪嗪 50-49-7 Imipramine C19H24N2 8 异丙嗪 60-87-7 Promethazine C17H20N2S 9 卡马西平 298-46-4 Carbamazepine C15H12N2O 10 地西泮 439-14-5 Diazapam C16H13ClN2O 11 氯普噻吨 113-59-7 Chlorprothixene C18H18ClNS 12

23、 氯丙嗪 50-53-3 Chlorpromazine C17H19ClN2S 13 咪达唑仑 59467-64-0 Midazolam C18H13ClFN3 14 氟硝西泮 1622-62-4 Flunidazepam C16H12FN3O3 15 三氟拉嗪 117-89-5 Trifluoperazine C21H24F3N3S 16 硝西泮 146-22-5 Nitrazepam C15H11N3O3 17 唑吡坦 82626-48-0 Zolpidem C19H21N3O 18 氯硝西泮 1622-61-3 Clonazepam C15H10ClN3O3 19 氯氮平 5786-21

24、-0 Clozapine C18H19ClN4 20 艾司唑仑 29975-16-4 Estazolam C16H11ClN4 21 阿普唑仑 28981-97-7 Alprazolam C17H13ClN4 22 扎来普隆 151319-34-5 Zaleplon C17H15N5O 23 三唑仑 28911-01-5 Triazolam C17H12Cl2N4 GA/T XXXX XXXX 8 附 录 B （资料性附录） 23 种药物的相关谱图 B.1 23 种药物的 保留时间 23 种药物保留时间 见表 B.1。 表 B.1 23 种药物的保留时间 药物名称 保留时间 min 巴比妥 6

25、.17 异戊巴比妥 7.44 戊巴比妥 7.57 司可巴比妥 7.85 苯巴比妥 8.85 扑尔敏 8.97 丙咪嗪 10.05 异丙嗪 10.35 卡马西平 10.63 地西泮 11.31 氯普噻吨 11.67 氯 丙嗪 11.70 咪哒唑仑 12.40 氟硝西泮 12.59 三氟拉嗪 12.97 硝西泮 14.35 唑吡坦 14.45 氯硝西泮 15.36 氯氮平 15.63 艾司唑仑 16.27 阿普唑仑 16.86 扎来普隆 17.48 三唑仑 18.62 B.2 23 种药物 的 MRM总离子流图和提取离子流图 23 种药物的 MRM总离子流图和提取离子流图见图 B.1图 B.24。

26、 GA/T XXXX XXXX 9 图 B.1 23 种药物 的 MRM 总离子流图 图 B.2 巴比妥的 MRM 提取离子流图 图 B.3 异戊巴比妥的 MRM 提取离子流图 GA/T XXXX XXXX 10 图 B.4 戊巴比妥的 MRM 提取离子流图 图 B.5 司可巴比妥的 MRM 提取离子流图 图 B.6 苯巴比妥的 MRM 提取离子流图 GA/T XXXX XXXX 11 图 B.7 扑尔敏的 MRM 提取离子流图 图 B.8 丙咪嗪的 MRM 提取离子流图 图 B.9 异丙嗪的 MRM 提取离子流图 GA/T XXXX XXXX 12 图 B.10 卡马西平的 MRM 提取离子

27、流图 图 B.11 地西泮的 MRM 提取离子流图 图 B.12 氯普噻吨的 MRM 提取离子流图 GA/T XXXX XXXX 13 图 B.13 氯丙嗪的 MRM 提取离子流图 图 B.14 咪哒唑仑的 MRM 提取离子流图 图 B.15 氟硝西泮的 MRM 提取离子流图 GA/T XXXX XXXX 14 图 B.16 三氟拉嗪的 MRM 提取离子流图 图 B.17 硝西泮的 MRM 提取离子流图 图 B.18 唑吡坦 的 MRM 提取离子流图 GA/T XXXX XXXX 15 图 B.19 氯硝西泮的 MRM 提取离子流图 图 B.20 氯氮平的 MRM 提取离子流图 图 B.21

28、艾司唑仑的 MRM 提取离子流图 GA/T XXXX XXXX 16 图 B.22 阿普唑仑的 MRM 提取离子流图 图 B.23 扎来普隆的 MRM 提取离子流图 图 B.24 三唑仑的 MRM 提取离子流图 GA/T XXXX XXXX 17 附 录 C （资料性附录） 23种 药 物的回收率和检出限 23种药物的回收率和检 出 限见表 C.1。 表 C.1 23种药物的回收率和检 出限 药物名称 回收率 （添加浓度 0.1g/mL） 检 出 限 ng/mL 巴比妥 93.9% 5 异戊巴比妥 88.4% 4 戊巴比妥 88.5% 2 司可巴比妥 91.8% 5 苯巴比妥 94.1% 8 扑尔敏 85.6% 3 丙咪嗪 71.7% 2 异丙嗪 65.0% 13 卡马西平 84.1% 32 地西泮 86.0% 5 氯普噻吨 78.0% 30 氯丙嗪 67.6% 4 咪哒唑仑 85.5% 20 氟硝西泮 85.2% 5 三氟拉嗪 73.9% 4 硝西泮 91.0% 15 唑吡坦 87.5% 7 氯硝西泮 88.7% 40 氯氮平 80.3% 5 艾司唑仑 88.7% 8 阿普唑仑 88.6% 15 扎来普隆 78.0% 16 三唑仑 76.4% 20 _