GA T 1633-2019 法庭科学 血液、尿液中乙基葡萄糖醛酸苷检验 气相色谱-质谱和液相色谱-质谱法.pdf

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1、 ICS 13.310 A 92 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA GA/T 法庭科学 血液、尿液中乙基葡萄糖醛酸 苷 检验 气相色谱 -质谱和液相色谱 -质谱法 Forensic sciences Examination methods for ethyl glucuronide in blood and urine samples GC-MS and LC-MS - -发布 - -实施 中华人民共和国公安部 发布 GA/T I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别

2、这些专利的责任。 本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会（ SAC/TC179/SC1） 提出并 归口。 本标准 起草 单位： 司法鉴定科学研究 院、公安部物证鉴定中心。 本标准 主要 起草人： 严慧 、沈保华 、沈敏、 卓先义、刘伟、向平 、于忠山、何毅、王芳琳 。 GA/T 1 法庭科学 血液、尿液中乙基葡萄糖醛酸苷检验 气相色谱 -质谱和液相色谱 -质谱法 1 范围 本标准规定了 法庭科学 血液 、尿液 中乙基葡萄糖醛酸苷 （ EtG） 的气相色谱 -串联质谱 （ GC-MS/MS） 、 液 相色谱 -串联质谱 （ LC-MS/MS）定性定量检验方法。 本标准适用于 法

3、庭科学 血液 、 尿液中乙基葡萄糖醛酸苷的定性 分析和 定量 分析。其他可疑样品中 乙 基葡萄糖醛酸苷 的定性分析和定量分析可参照使用 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文 件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。 4 原理 以空白样品和添加样品作为对照，按平行操作的要求，对血液、尿液 进行提取（气相色谱 -串联质 谱分析前需衍生化）后 ，

4、 采用气相色谱 -串联质谱法和液相色谱 -串联质谱法定 性定量， 以保留时间、 质 谱特征离子和相对丰度比 作为定性判断依据 ； 以峰面积为依据，采用内标法进行定量分析。 5 试剂和材料 5.1 试剂 气相色谱 -质谱 实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的三级水 ， 液相色谱 -质谱 实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的 一 级水。除非另有说明，在分析中使用的试剂均为 分析纯 ，试剂包括 ： a) 甲醇 （色谱纯） ； b) 乙腈（色谱纯） ； c) BSTFA（ 双三甲基硅烷三氟乙酰胺 ） /TMCS（ 三甲基氯硅烷 ）混合溶液 （ 体积比 99:1） ； d) 无水吡啶 ；

5、 e) 50%甲酸溶液（ 色谱纯 ）； f) 0.01%甲酸溶液 ： 取适量水置于 1000mL 容量瓶，加入 50%的甲酸溶液 0.2mL， 以水定容至 刻 度 ； g) 标准 溶液： 1） 1.0mg/mL 标准 物质溶 液 ：采用 市售 EtG 标准甲 醇 溶液，置于 冰箱中冷藏保存； GA/T 2 2） 10.0g/mL EtG 标准工作液：吸取 0.1mL1.0mg/mL EtG 标准 物质溶 液 ， 用甲醇稀释 定容 至 10mL，混匀，配 制成 质量 浓度为 10.0g/mL 的标准 物质溶 液 ，密封， 置于冰箱中 冷 藏保存。有效期 3 个月 ； 3） 1.0mg/mL Et

6、G-D5（ 内标 ） 溶 液 ：采 用 EtG-D5 市售内标溶液，置于冰 箱中冷藏保存； 4） 10.0g/mL EtG-D5（内标） 物质 甲醇 溶液 ：吸取 0.1mL 标准储备液 置于 10mL 容量瓶中， 用 甲醇 稀释 定容至刻度 ，混匀，配制成 质量 浓度为 10.0g/mL 的标准 物质甲醇 溶 液 ， 置 于冰箱中 冷藏保存。有效期 3 个月。 5.2 材料 材料包括： a) 离心管 ； b) 有机系微孔滤膜： 0.22m。 6 仪 器 和设备 仪器和设备包括： a) 气相色谱 -串联质谱仪 ：配有电子轰击离子源（ EI）和三重四极杆质量分析器； b） 液相色谱 -串联质谱仪

7、 ：配有电喷雾离子源（ ESI）和三重四极杆质量分析器； c） 离心机； d） 振荡器 ； e） 移液器； f） 恒温水浴锅； g） 干燥箱 。 7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品 提取 7.1.1.1 衍生化法（适用于气相色谱 -串联质谱） 移取血液或尿液 100L 于 1.5mL 离心管中，加入 100ng 内标物 EtG-D5 和 900L 乙腈，涡旋， 10000r/min 离心 5min，转移上清液至试管， 60C 水浴中空气流下吹干，残留物中加入 BSTFA/TMCS 混合溶液 66L 和无水吡啶 33L，置于 90C 干燥箱中反应 30min，冷却后 作为检材样品衍

8、生液供 GC-MS/MS 分析。 7.1.1.2 沉淀蛋白法（适用于液相色谱 -串联质谱） 移 取 血液或尿液 100L于 1.5mL离心管中 ， 加入 50ng内标物 EtG-D5和 900L乙腈，涡旋 ， 13000r/min 离心 3min； 取 上清液 用 有机 系 微孔滤膜过滤 ， 作为检材样品提取液 供 LC-MS/MS 分析。 7.1.1.3 质控样品制备 取 等量 相似基质的空白样品两份 于离心管中 ， 一 份作为空白样品，另 一 份添加 EtG 标准物质作为 添加样品（添加样品的质量浓度为 0.1g/mL） ， 与检材平行操作，得到空白样品提取液（或衍生液）和 添加样品提取液

9、（或衍生液）供仪器分析。 GA/T 3 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器条件 7.1.2.1.1 气相色谱 -串联质谱 条件 以下条件作为参考，可根据不同仪器 和不同样品等 实际情况进行调整： a) 色谱柱： HP-1MS柱（ 30m0.25mm0.1m） 或 等效色谱柱 ； 注： HP-1MS 柱 是 Agilent 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品 的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 柱温：初温 100C保持 1min，以 8C/min程序升温至 205C，再以 30C/min程序升温至 280C保 持

10、 3min； c) 进样口温度： 250C； d) 载气：氦气； e) 流速： 1mL/min； f) 进样量： 1L； 分流进样，分流比： 10:1； g) 离子源 220C； h) 接口温度： 300C； i) 碰撞气：氩气； j) 扫描方式： 多反应监测 (MRM)； k) MS参考条件见表 1。 表 1 气相色谱 -串联质谱 参考条件 名 称 定量离子 对 定性离子 对 EtG 261143 261143 26173 EtG-D5 266143 266143 26673 7.1.2.1.2 液 相色谱 -串联质谱 参考条件 以下条件作为参考，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际 情况 进

11、行调整： a) 色谱柱： GL Science Inertsil ODS-3柱 (3mm100mm)或 等效 色谱柱 ； b) 流动相： A:0.01%甲酸水溶液 ， B:乙腈；柱后添加乙腈： 0.1mL/min； c) 洗脱：梯度洗脱，梯度见表 2； d) 柱温： 室温 ； e) 流速 ： 300 L/min； f) 进样量： 2 L； 表 2 梯度洗脱条件 时间 min A B 0 90% 10% 3 90% 10% GA/T 4 12 10% 90% 13 10% 90% 15 90% 10% 20 90% 10% g) 离子源：电喷雾电离（ ESI）； h) 检测方式： 负 离子 ；

12、i) 离子喷雾电压： -4500V； j) 离子源温度： 450C； k) 碰撞气、气帘气等气流值应优化至最优灵敏度；扫描模式 ：多反应离子监测（ MRM）； l) MS参考 条件（ 定性、定量离子 对 和 去簇 电压、碰撞能量 ）见表 3。 表 3 液相色谱 -串联质谱 参考条件 名 称 定量离子对 定性离子对 去簇电压 V 碰撞能量 V EtG 22175 22175 -40 -18 22185 -20 EtG-D5 22675 22675 -40 -20 22685 -22 7.1.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品 提取液 （或衍生液） 及标准工作溶液 （或衍生液） 和内标工作

13、溶液 （或衍生液） ，按 7.1.2.1的分析条件进样分析。 7.2 定量分析 7.2.1 样品 提取 移取血液或尿液检材样品 100L两份， 按 7.1.1进行操作。 内标 -工作曲线法：另取等量相似基质的空白样品六份，一份作为空白样品，另外五份添加不同浓 度的标准物质（添加浓度应呈良好的线性关系，且检材样品中目标物的含量应在线性范围内）及内标物 质（ GC-MS/MS的 添加量为 100ng， LC-MS/MS为 50ng），作为添加样品，与检材样品平行操作。 内标 -单点校正法：另取等量相似基质的空白样品两份，一份作为空白样品，另外一份添加标准物 质（检材样品 中目标物含量应为添加样品中

14、目标物含量的 50%）和内标物质（ GC-MS/MS的 添加量为 100ng， LC-MS/MS为 50ng），作为添加样品，与检材样品平行操作。 7.2.2 仪器检测 7.2.2.1 仪器条件 按 7.1.2.1规定的条件分析。 7.2.2.2 进样 分 别吸取检材、 空白 和添加样品提取液 （或衍生液）、内标溶液和 标准 溶液（或衍生液） ，按 7.1.2.1 的分析条件每个样品进样分析 23次。若要报告测量不确定度，每个样品分析次数应不少于 6次 。 7.2.3 计算 GA/T 5 7.2.3.1 计算含量 7.2.3.1.1 内标 -工作曲线法 记录检材样品提取液和添加样品提取液中目标

15、物和内标的保留时间和峰面积值，以添加样品提取液 中目标物与内标的峰面积比的平均值为纵坐标、添加样品提取液中目标物的含量为横坐标进行线性回 归，得到线性方程。根据检材样品提取液中目标物 与 内标的峰面积 比 ，按公式 (1)计算出检材样品中目 标物的含量。 . (1) 式中： W 检材样品中目标物的含量，以质量浓度计，单位为微克每毫升（ g/mL）； Y 检材样品提取液中 EtG 与 EtG-D5 的 峰面积比的平均值； a 线性方程的截距； b 线性方程的斜率。 7.2.3.1.2 内标 -单点校正法 记录检材样品提取液和添加样品提取液中目标物和内标的保留时间和峰面积值， 按公式 (2)计算校

16、 正因子 ， 按公式 (3)计算含量 ： 标内 内标 AM AMf = . (2) 式中： f 校正因子； M 标 添加样品中目标 物添加量，单位为微克 (g)； A 内 添加样品中内标物峰面积平均值； M 内 添加样品中内标物添加量，单位为微克 (g)； A 标 添加样品中目标物峰面积平均值。 样内 内样 MA MAfW = . (3) 式中： W 检材样品中目标物的含量，单位为微克每毫升（ g/mL）； f 校正因子； A 样 检材样品 提取 液中目标物峰面积平均值； M 内 检材样品中 内标物添加量，单位为微克 (g)； A 内 检材样品 提取液 中内标物峰面积平均值； M 样 检材样品

17、的取样量，单位为毫升 (mL)。 7.2.3.2 计算 相对相差 记录 两 份平行操作的 检材样品中目标物的 含量，按公式 （ 4）计算相 对相差： . (4) 式中： RD 相对相差 ，用百分比（ %）表示 ； GA/T 6 W1、 W2 两个检材样品平行定量测定的含量数值； 两个检材样品平行定量测定含量的平均值。 8 结果评价 8.1 定性结果评价 8.1.1 阳性结果评价 在相同条件下进行样品测定时，检材样品中目标物的色谱峰保留时间与标准溶液 （衍生物） 一致 （ GC-MS/MS保留时间 相对误差在 1%之内 ， LC-MS/MS保留时间 相对误差在 2.5%之内）、目标物的 定性离子

18、与标准溶液一致，且离子丰度比与浓度接近的标准溶液相比，相对偏差不超过表 4规定的范围， 空白样品无干扰，则可判断检材样品中检出目标物。 EtG的相关谱图参见附录 A。 表 4 离子丰度比的最大允许相对偏差范围 离子丰度比 50% 20 50 10 20 10% 最大允许相对偏差 20 25 30% 50% 8.1.2 阴 性结果评价 阴性结果评价：检材样品未出现与目标物标准溶液一致的色谱峰，且添加样品中出现与目标物标准 溶液一致的色谱峰，空白样品无干扰，则可判断检材样品中未检出目标物。 方法检出限参见附录 B。 8.2 定量结果评价 如果目标物含量的 RD 20%，定量数据可靠，其含量按 两

19、份检材的平均值计算。如果检材样品中 目标物含量的 RD20%，定量数据不可靠。应按 7.2 重新提取检验 。 EtG 的代谢相关参考资料参见附录 B。 GA/T 7 附 录 A （资料性附录） EtG 的相关谱图 及检出限 A.1 检出限及定量限 本 方法 GC-MS/MS和 LC-MS/MS的检出限均为 0.05g/mL，血液和尿液中 EtG的 GC-MS/MS和 LC-MS/MS的定量下限 分别为 0.40g/mL和 0.10g/mL。 A.2 EtG的相关谱图 EtG和 EtG-D5的 GC-MS/MS和 LC-MS/MS多反应监测谱图见图 A.1、图 A.2。 图 A.1 EtG 和

20、EtG-D5 的 GC-MS/MS 多反应监测谱图 EtG EtG-D5 GA/T 8 图 A.2 EtG 和 EtG-D5 LC-MS/MS 的多反应监测谱图 EtG-D5 EtG GA/T 9 A A 附 录 B （资料性附录） EtG 相关参考资料 EtG 是乙醇的体内代谢物，在血中消除时间较乙醇更长（约 12h）。血液中 EtG 阳性结果对 12h 内 是否饮酒的判断起着重要作用，尤其在体内已不再能测出乙醇时 。此外，血液和尿液中乙基葡萄糖醛酸 苷的测定，在判定乙醇来源、区分是否血液腐败产生乙醇有着重要的意义。 GC-MS/MS 和 LC-MS/MS 的 检出限 均 为 0.05g/mL。 B _