DB61 T 1134-2018 番茄黄化曲叶病毒检验鉴定方法.pdf

《DB61 T 1134-2018 番茄黄化曲叶病毒检验鉴定方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《DB61 T 1134-2018 番茄黄化曲叶病毒检验鉴定方法.pdf（16页珍藏版）》请在麦多课文档分享上搜索。

1、ICS 65.020.01B 16 DB61陕 西 省 地 方 标 准DB 61/T 11342018番 茄 黄 化 曲 叶 病 毒 检 验 鉴 定 方 法 Detection and identification of Tomato yellow leaf curl virus 2018 - 04 - 10 发 布 2018 - 05 - 10 实 施陕 西 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布 DB61/T 1134 2018 I 目 次前 言 .II1 范 围 .12 规 范 性 引 用 文 件 .13 番 茄 黄 化 曲 叶 病 毒 基 本 信 息 .14 方 法 原 理 .15 实

2、 验 用 仪 器 设 备 、 用 具 及 试 剂 .16 取 样 和 样 品 制 备 .27 检 测 方 法 .2 8 结 果 判 定 .29 结 果 记 录 与 样 品 、 资 料 保 存 .210 安 全 .3附 录 A（ 规 范 性 附 录 ） TYLCV 相 关 资 料 .4附 录 B（ 规 范 性 附 录 ） 双 抗 体 夹 心 酶 联 免 疫 吸 附 测 定 方 法 .7附 录 C（ 规 范 性 附 录 ） 普 通 PCR检 测 方 法 . 11附 录 D（ 规 范 性 附 录 ） 实 时 荧 光 PCR检 测 方 法 .14附 录 E（ 规 范 性 附 录 ） 生 物 学 接 种

3、 .16 DB61/T 1134 2018 II 前 言本 标 准 按 照 GB/T 1.1 2009给 出 的 规 则 起 草 。本 标 准 由 陕 西 省 农 业 厅 提 出 并 归 口 。本 标 准 起 草 单 位 ： 陕 西 省 生 物 农 业 研 究 所 、 陕 西 省 园 艺 蚕 桑 技 术 工 作 站 、 陕 西 学 前 师 范 学 院 。本 标 准 主 要 起 草 人 ： 李 英 梅 、 杨 苗 苗 、 王 周 平 、 刘 晨 、 张 伟 兵 、 张 锋 、 洪 波 、 陈 志 杰 、 张 淑 莲 。本 标 准 由 陕 西 省 生 物 农 业 研 究 所 负 责 解 释 。本

4、标 准 首 次 发 布 。联 系 信 息 如 下 ：单 位 ： 陕 西 省 生 物 农 业 研 究 所电 话 ： 029 82291059 地 址 ： 西 安 市 咸 宁 中 路 125号邮 编 ： 710043 DB61/T 1134 2018 1 番 茄 黄 化 曲 叶 病 毒 检 验 鉴 定 方 法1 范 围本 标 准 规 定 了 番 茄 黄 化 曲 叶 病 毒 酶 联 免 疫 吸 附 DAS-ELISA、 普 通 PCR、 实 时 荧 光 定 量 PCR检 测 方 法 。本 标 准 适 用 于 番 茄 种 苗 及 传 毒 介 体 中 携 带 的 番 茄 黄 化 曲 叶 病 毒 的 检

5、测 。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 对 于 本 文 件 的 应 用 是 必 不 可 少 的 。 凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 仅 所 注 日 期 的 版 本 适 用 于 本 文件 。 凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 改 单 ） 适 用 于 本 文 件 。GB 19489-2008 实 验 室 生 物 安 全 通 用 要 求 GB/T 23629-2009 引 进 植 物 病 原 生 物 安 全 控 制 技 术 要 求3 番 茄 黄 化 曲 叶 病 毒 基 本 信 息中 文 名 ： 番 茄 黄 化 曲

6、叶 病 毒英 文 名 ： tomato yellow leaf curl virus英 文 缩 写 ： TYLCV分 类 地 位 ： 双 生 病 毒 科 （ Geminiviridae） 菜 豆 金 色 花 叶 病 毒 属 （ Begomovirus）番 茄 黄 化 曲 叶 病 毒 其 他 信 息 见 附 录 A。4 方 法 原 理通 过 基 于 抗 原 抗 体 反 应 的 双 抗 夹 心 酶 联 免 疫 吸 附 DAS-ELISA、 普 通 PCR、 实 时 荧 光 定 量 PCR进 行 检 测 鉴 定 。5 实 验 用 仪 器 设 备 、 用 具 及 试 剂5.1 仪 器 设 备酶 联 检

7、 测 仪 、 洗 板 机 、 高 速 冷 冻 离 心 机 、 PCR仪 、 荧 光 定 量 PCR仪 、 电 子 天 平 （ 感 量 ， 1/10000g） 、电 泳 仪 、 电 泳 槽 、 紫 外 投 射 仪 、 凝 胶 成 像 系 统 、 恒 温 水 浴 、 低 温 冰 箱 、 液 氮 罐 、 隔 离 温 室 等 。5.2 用 具可 调 式 微 量 移 液 器 （ 0.5 L、 2 L、 10 L、 20 L、 100 L、 200 L、 1000 L） 、 96孔 光 化 学 PCR反 应 板 、 酶 联 板 、 离 心 管 、 PCR管 、 研 钵 等 。5.3 试 剂 酶 联 测 定

8、 试 剂 ， PCR检 测 试 剂 ， 除 有 特 殊 说 明 外 ， 均 为 分 析 纯 或 生 化 试 剂 。 DB61/T 1134 2018 2 6 取 样 和 样 品 制 备6.1 取 样6.1.1 疑 似 被 TYLCV 感 染 的 番 茄 植 株 取 样 方 法 ： 取 疑 似 发 病 植 株 顶 部 叶 片 2片 3 片 ， -20 储 存 备 用 。6.1.2 无 TYLCV 感 染 症 状 番 茄 植 株 取 样 方 法 ： 在 番 茄 田 随 机 选 5 点 ， 每 点 随 机 选 5 株 ， 每 株 取 顶 部 叶片 2片 3 片 ， -20 储 存 备 用 。6.1.

9、3 若 在 取 样 过 程 中 发 现 烟 粉 虱 ， 应 随 机 采 集 烟 粉 虱 ， -20 储 存 备 用 。6.2 实 验 室 样 品 制 备6.2.1 植 物 样 品 ： 将 每 份 10g 待 测 番 茄 叶 片 放 入 研 钵 后 加 入 液 氮 研 磨 ， 取 100mg 按 照 植 物 基 因 组 试 剂盒 抽 提 番 茄 叶 片 总 DNA， -20 保 存 所 提 DNA。6.2.2 烟 粉 虱 样 品 ： 取 单 头 烟 粉 虱 按 照 动 物 基 因 组 提 取 试 剂 盒 抽 提 DNA， -20 保 存 所 提 DNA。 7 检 测 方 法7.1 酶 联 免 疫

10、 吸 附 测 定 方 法 见 附 录 B。7.2 PCR检 测 方 法 见 附 录 C。7.3 实 时 荧 光 定 量 PCR检 测 方 法 见 附 录 D。7.4 生 物 学 测 定 方 法 见 附 录 E。8 结 果 判 定8.1 样 品 经 酶 联 免 疫 吸 附 、 普 通 PCR、 实 时 荧 光 定 量 PCR三 种 方 法 之 一 检 测 为 阴 性 时 ， 判 定 样 品 不 携带 TYLCV。8.2 普 通 PCR、 实 时 荧 光 定 量 PCR中 的 两 种 方 法 检 测 结 果 为 阳 性 ， 应 进 行 序 列 测 定 ， 如 序 列 测 定 结 果证 实 与 所

11、检 测 的 TYLCV一 致 ， 即 可 判 定 检 出 TYLCV。 8.3 酶 联 测 定 为 阳 性 后 ， 普 通 PCR 或 实 时 荧 光 PCR检 测 结 果 为 阳 性 可 判 定 检 出 TYLCV。 必 要 时 可 进 行生 物 学 测 定 ， 并 进 行 复 检 。9 结 果 记 录 与 样 品 、 资 料 保 存9.1 结 果 记 录检 验 结 果 应 形 成 检 验 报 告 ， 内 容 包 括 取 样 品 种 、 时 间 、 地 点 、 人 员 、 样 品 类 型 ， 样 品 保 存 条 件 ； 实验 时 间 、 地 点 、 方 法 、 结 果 ， 检 验 人 员 签

12、 字 等 。9.2 样 品 保 存经 检 验 确 定 携 带 TYLCV的 样 品 保 存 在 -80 冰 箱 ， 标 记 样 品 并 登 记 。9.3 资 料 保 存 酶 联 测 定 需 有 酶 联 极 反 应 的 原 始 数 据 ， 普 通 PCR检 测 需 有 电 泳 结 果 照 片 及 序 列 测 定 报 告 ， 荧 光 定 量PCR检 测 需 有 扩 增 曲 线 图 片 ， 生 物 学 测 定 需 有 鉴 别 寄 主 的 症 状 图 片 。 DB61/T 1134 2018 3 10 安 全实 验 过 程 中 的 生 物 安 全 要 求 应 严 格 按 照 GB 19489-2008

13、的 规 定 进 行 操 作 ， 实 验 废 弃 物 按 照 GB/T23629-2009中 相 关 要 求 进 行 处 理 。 DB61/T 1134 2018 4 AA附 录 A（ 规 范 性 附 录 ）TYLCV相 关 资 料A.1 生 物 学 特 性A.1.1 主 要 寄 主 作 物TYLCV的 自 然 寄 主 有 番 茄 （ Lycopersicum esculentum Mill.） 、 烟 草 （ Nicotiana tabacum） 、 茄子 （ Solanum melongena） 、 南 瓜 （ Cucurbita moschata） 、 木 薯 （ Manihot escu

14、lenta crantz） 、 棉 花 （ Gossypium hirsutum） 、 辣 椒 （ Capsicum annuum L.） 等 。A.1.2 野 生 寄 主野 生 寄 主 有 曼 陀 罗 （ Datura stramonium） 等 。A.1.3 病 毒 侵 染 部 位茎 秆 、 叶 片 、 果 实 。A.2 病 害 症 状A.2.1 番 茄 受 害 症 状 ： 寄 主 植 株 感 染 TYLCV后 ， 初 期 主 要 表 现 生 长 迟 缓 或 停 滞 ， 顶 部 叶 片 常 退 绿 发 黄 ， 变 小变 厚 ， 叶 质 脆 硬 ， 叶 片 有 褶 皱 、 向 上 卷 曲 ，

15、 叶 片 边 缘 至 叶 脉 区 域 黄 化 节 间 变 短 ， 植 株 明 显 矮 化 ， 下 部 老 叶 症 状 不 明 显 （ 见 图 A.1、 图 A.2） ； 番 茄 植 株 具 有 明 显 曲 叶 症 状 外 ， 后 期 表 现 坐 果 少 ， 果 实 变 小 ， 膨 大 速 度慢 ， 成 熟 期 的 果 实 不 能 正 常 转 色 ， 果 实 产 量 和 商 品 价 值 均 大 幅 度 下 降 。A.2.2 烟 草 受 害 症 状 ： 寄 主 植 株 感 染 病 毒 后 ， 株 叶 脉 增 粗 叶 片 脊 面 出 现 耳 突 ， 叶 片 有 卷 曲 、 黄 化 现 象 。A.2.

16、3 辣 椒 受 害 症 状 ： 植 株 受 害 后 ， 叶 片 卷 曲 、 黄 化 。 图 A.1 TYLCV侵 染 后 的 番 茄 叶 片 DB61/T 1134 2018 5 图 A.2 TYLCV侵 染 后 的 番 茄 植 株A.3 分 布 区 域TYLCV主 要 分 布 于 亚 洲 、 非 洲 、 欧 洲 、 美 洲 、 大 洋 洲 。A.4 传 播 方 式烟 粉 虱 （ Bemisia tabaci） 是 唯 一 的 传 播 媒 介 ， 各 种 生 物 型 的 烟 粉 虱 均 可 传 播 。A.5 粒 体 形 态番 茄 黄 化 曲 叶 病 毒 粒 体 呈 孪 生 颗 粒 状 ， 大

17、小 约 30nm 20nm。 A.6 基 因 组为 单 链 环 状 DNA， 大 小 约 为 2.8kb， 基 因 数 6个 ， 基 因 组 含 有 4个 ORFs（ AC1， AC2， AC3， AC4） 。 DB61/T 1134 2018 6 BB附 录 B（ 规 范 性 附 录 ）双 抗 体 夹 心 酶 联 免 疫 吸 附 测 定 方 法B.1 材 料B.1.1 酶 联 板 的 要 求使 用 有 质 量 保 证 厂 商 生 产 的 酶 联 板 。B.1.2 包 被 抗 体 特 异 性 的 TYLCV抗 体 。B.1.3 酶 标 抗 体碱 性 磷 酸 酯 酶 标 记 的 TYLCV抗 体

18、 。B.1.4 底 物对 硝 基 苯 磷 酸 二 钠 （ NPP） 。B.1.5 样 品 抽 提 缓 冲 液 。样 品 抽 提 缓 冲 液 （ pH7.4） 应 符 合 表 B.1。 表 B.1 样 品 抽 提 缓 冲 液试 剂 用 量亚 硫 酸 钠 （ Na2SO3） 1.30g聚 乙 烯 基 吡 咯 烷 酮 （ PVP， MW24000 MW40000） 20.0g叠 氮 化 钠 （ NaN3） 0.20g吐 温 （ Tween-20） 20mL注 ： 溶 于 900mL， 1 PBST中 ， NaOH或 HCl调 节 pH值 至 7.4， 定 容 至 1000mL， 4 储 存 。B.1

19、.6 包 被 缓 冲 液包 被 缓 冲 液 （ pH9.6） 应 符 合 表 B.2。 表 B.2 包 被 缓 冲 液试 剂 用 量碳 酸 钠 （ Na2CO3） 1.59g碳 酸 氢 钠 （ NaHCO3） 2.93g叠 氮 钠 （ NaN3） 0.20g注 ： 加 入 900mL蒸 馏 水 溶 解 ， HCl调 节 pH值 到 9.6。 蒸 馏 水 定 容 至 1000mL， 4 储 存 。B.1.7 PBST缓 冲 液 （ 洗 涤 缓 冲 液 pH7.4） DB61/T 1134 2018 7 PBST缓 冲 液 （ 洗 涤 缓 冲 液 pH7.4） 应 符 合 表 B.3。表 B.3

20、PBST缓 冲 液试 剂 用 量氯 化 钠 （ NaCl） 8.00g磷 酸 氢 二 钠 （ Na 2HPO4） 1.15g磷 酸 二 氢 钾 （ KH2PO4） 1.20g氯 化 钾 （ KCl） 0.20g吐 温 （ Tween-20） 0.50mL注 ： 加 入 900mL蒸 馏 水 溶 解 ， 用 NaOH或 HCl调 节 pH值 至 7.4， 用 蒸 馏 水 定 容 至 1000mL， 4 储 存 。B.1.8 酶 标 抗 体 稀 释 缓 冲 液 （ pH7.4）酶 标 抗 体 稀 释 缓 冲 液 （ pH） 应 符 合 表 B.4。表 B.4 酶 标 抗 体 稀 释 缓 冲 液试

21、剂 用 量 1PBST 缓 冲 液 800mLBSA（ 牛 血 清 白 蛋 白 ） 或 脱 脂 奶 粉 2.0gPVP（ MW24 000 MW40 000） 20.0g叠 氮 钠 （ NaN3） 0.2g注 ： 用 NaOH或 HCl调 节 pH值 到 7.4， 用 无 菌 蒸 馏 水 定 容 至 1000mL， 4 储 存 。B.1.9 底 物 （ pNPP） 缓 冲 液 （ pH9.8）底 物 （ pNPP） 缓 冲 液 （ pH9.8） 应 符 合 表 B.5。表 B.5 底 物 （ pNPP） 缓 冲 液 （ pH9.8）试 剂 用 量 氯 化 镁 （ MgCl2） 0.1g叠 氮

22、钠 （ NaN3） 0.2g二 乙 醇 胺 97mL注 ： 溶 解 于 800mL蒸 馏 水 中 ， 盐 酸 调 pH9.8， 蒸 馏 水 定 容 至 1000mL， 4 储 存 。B.2 程 序B.2.1 包 被 抗 体用 包 被 缓 冲 液 将 抗 体 按 说 明 稀 释 ， 加 入 酶 联 板 的 孔 中 ， 100 L/孔 ， 加 盖 ， 37 孵 育 4h或 4 冰 箱 中孵 育 过 夜 ， 清 空 酶 联 孔 中 溶 液 ， PBST洗 涤 4次 6次 ， 每 次 3min。B.2.2 样 品 制 备 待 测 样 品 按 1:10（ 质 量 ： 体 积 ） 加 入 抽 提 缓 冲

23、液 ， 用 研 钵 研 磨 成 浆 ， 2000r/min， 离 心 10min， 上 清液 即 为 制 备 好 的 检 测 样 品 。 样 品 提 取 缓 冲 液 作 空 白 对 照 ， 阴 性 对 照 作 相 应 的 处 理 或 按 照 说 明 书 进 行 。 DB61/T 1134 2018 8 B.2.3 加 样加 入 制 备 好 的 检 测 样 品 、 阴 性 对 照 ， 100 L/孔 ， 每 一 样 品 设 一 个 重 复 。 加 盖 后 于 4 冰 箱 孵 育 过 夜 ，酶 联 板 用 自 来 水 彻 底 冲 洗 ， 再 用 蒸 馏 水 洗 涤 1次 ， PBST洗 涤 3次

24、， 每 次 3min。B.2.4 加 酶 标 抗 体用 酶 标 抗 体 缓 冲 液 按 说 明 将 酶 标 抗 体 稀 释 至 工 作 浓 度 ， 并 加 入 到 酶 联 板 中 ， 100uL/孔 ， 加 盖 ， 37孵 育 4h， 酶 联 板 用 自 来 水 彻 底 冲 洗 ， 再 用 蒸 馏 水 洗 涤 1次 ， PBST洗 涤 3次 ， 每 次 3min。B.2.5 加 底 物将 底 物 pNPP加 入 到 底 物 缓 冲 液 中 使 终 浓 度 为 1mg/mL（ 现 用 现 配 ） ， 按 100 L/孔 ， 加 入 到 酶 联 板 中 ，室 温 避 光 孵 育 。B.2.6 读

25、数 用 酶 联 检 测 仪 在 30min、 1h和 2h于 405nm处 读 OD值 。 或 用 肉 眼 观 察 显 色 情 况 。B.3 结 果 判 断B.3.1 对 照 孔 的 OD405值 （ 缓 冲 液 孔 、 阴 性 对 照 及 阳 性 对 照 孔 ） ， 应 该 在 质 量 控 制 范 围 内 ， 即 ： 缓 冲 液 孔和 阴 性 对 照 孔 的 OD405值 0.15， 当 阴 性 对 照 孔 的 OD405值 0.05时 ， 按 0.05计 算 。 阳 性 对 照 有 明 显 的 颜 色反 应 ； 阴 性 对 照 OD405值 /阴 性 对 照 OD405值 2； 孔 的 重

26、 复 性 基 本 一 致 。B.3.2 在 满 足 了 B.3.1质 量 要 求 后 ， 结 果 原 则 上 可 判 断 如 下 ：a) 样 品 OD 405值 /阴 性 对 照 OD405值 明 显 2， 判 为 阳 性 ；b) 样 品 OD405值 /阴 性 对 照 OD405值 在 阈 值 附 近 ， 判 为 可 疑 样 品 ， 需 重 新 做 一 次 ， 或 用 其 他 方 法 加 以验 证 ；c) 样 品 OD405值 /阴 性 对 照 OD405值 明 显 2， 判 为 阴 性 。B.3.3 若 满 足 不 了 B.3.1质 量 要 求 ， 则 不 能 进 行 结 果 判 定 。

27、DB61/T 1134 2018 9 CC附 录 C（ 规 范 性 附 录 ）普 通 PCR 检 测 方 法C.1 试 剂C.1.1 电 泳 缓 冲 液 （ TAE） （ 50 ）电 泳 缓 冲 液 （ TAE） （ 50 ） 应 符 合 表 C.1。 表 C.1 电 泳 缓 冲 液 （ 50 TAE）试 剂 用 量三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 （ Tris） 242g冰 乙 酸 57.1mL0.5mol/L乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 （ EDTA， pH8.0） 100mL注 ： 用 时 加 蒸 馏 水 稀 释 至 1 TAE。C.1.2 溴 化 乙 锭 （ EB） 溶 液 （ 10

28、g/ L）溴 化 乙 锭 （ EB） 溶 液 （ 10 g/ L） 应 符 合 表 C.2。表 C.2 溴 化 乙 锭 （ EB） 溶 液 （ 10 g/ L） 试 剂 用 量溴 化 乙 锭 20mg灭 菌 去 离 子 水 20mLC.2 实 验 步 骤C.2.1 植 物 总 DNA提 取按 照 植 物 DNA提 取 试 剂 盒 进 行 操 作 。C.2.2 烟 粉 虱 总 DNA提 取按 照 动 物 DNA提 取 试 剂 盒 进 行 操 作 。 C.2.3 引 物C.2.3.1 TYLCV-F： 5 -TAAATACCATGGCCGCGCAGCGGAATACACGACGTTC-3 。C.2.

29、3.2 TYLCV-R： 5 -TATAATCCATGGAGACCCATAAGTATTGTCATTGAGGGTGA-3 。C.2.3.3 扩 增 片 段 长 度 为 543bp。C.2.4 PCR反 应 DB61/T 1134 2018 10 PCR反 应 体 系 见 表 C.1， 每 个 样 品 设 2个 平 行 处 理 。 反 应 体 系 中 各 试 剂 的 量 可 根 据 具 体 情 况 或 不 同 的反 应 总 体 积 适 当 调 整 。 检 测 时 以 含 TYLCV病 毒 材 料 的 DNA或 含 有 TYLCV目 标 片 段 的 质 粒 作 为 阳 性 对 照 ， 以健 康 植

30、物 材 料 作 为 阴 性 对 照 ， 以 水 代 替 模 板 作 为 空 白 对 照 。 反 应 条 件 ： 95 ， 10min； 95 ， 30s， 62 ，40s； 72 ， 1min， 35个 循 环 ； 72 ， 10min； 10 ， 保 持 。表 C.3 PCR反 应 体 系名 称 上 样 量Premix Taq 25 LDNA模 板 5 L上 游 引 物 （ 0.1 m/L） 2 L下 游 引 物 （ 0.1 m/L） 2 L 无 菌 水 16 L总 体 积 50 LC.2.5 琼 脂 糖 电 泳配 制 1.0%（ 质 量 浓 度 ） 的 琼 脂 糖 凝 胶 。 溴 化 乙

31、铵 可 直 接 加 入 琼 脂 糖 凝 胶 中 （ 浓 度 为 0.5 g/mL） ，也 可 在 电 泳 完 成 后 用 溴 化 乙 锭 染 色 。C.2.6 结 果 判 定C.2.6.1 阳 性 对 照 在 543bp处 有 扩 增 片 段 ， 阴 性 对 照 和 空 白 对 照 无 特 异 扩 增 ， 带 测 样 品 在 543bp无 条 带 ，则 可 判 定 样 品 为 TYLCV阴 性 。C.2.6.2 阳 性 对 照 在 543bp处 有 扩 增 片 段 ， 阴 性 对 照 和 空 白 对 照 无 特 异 性 扩 增 ， 待 测 样 品 出 现 与 阳 性 对照 一 致 的 扩 增

32、条 带 ， 可 通 过 测 序 的 方 式 进 一 步 确 认 。 如 果 PCR产 物 序 列 与 TYLCV的 序 列 同 源 性 达 到 99%及 以 上 ， 则 可 判 定 样 品 为 TYLCV阳 性 ， 未 扩 增 到 543bp的 条 带 ， 则 判 定 为 阴 性 。 DB61/T 1134 2018 11 DD附 录 D（ 规 范 性 附 录 ）实 时 荧 光 PCR检 测 方 法D.1 引 物D.1.1 TYLCV检 测 引 物D.1.1.1 YG-3： 5 -GAGTTCCCCTGTGCGTGAA-3 。D.1.1.2 YG-5： 5 -CTGTTCGCAAGTATCAA

33、TCAAGGT-3 。 D.2 DNA提 取DNA提 取 应 按 本 标 准 C.2.1和 C.2.2的 要 求 进 行 。D.3 实 时 荧 光 RT-PCR检 测PCR反 应 体 系 见 表 D.1， 每 个 样 品 设 2个 平 行 处 理 。 反 应 体 系 中 各 试 剂 的 量 可 根 据 具 体 情 况 或 不 同 的反 应 总 体 积 进 行 适 当 的 调 整 。 检 测 时 以 含 TYLCV材 料 的 DNA或 含 有 TYLCV的 质 作 为 阳 性 对 照 ， 以 健 康 植 物材 料 作 为 阴 性 对 照 ， 以 水 代 替 模 板 作 为 空 白 对 照 。 反

34、 应 参 数 ： 52 ， 2min； 95 ， 1min； 95 ， 5s； 60 ，30s； 72 ， 34s（ 收 集 荧 光 信 号 ） ； 40个 循 环 。 溶 解 曲 线 程 序 ： 95 ， 15s； 60 ， 1min； 95 ， 30s（ 收 集 荧 光 信 号 ） ； 60 ， 15s。 表 D.1 实 时 荧 光 RT-PCR反 应 体 系试 剂 名 称 加 样 量SYBR Premix DimerEraser (2 ) 10 LReference Dye II 0.4 L引 物 YG-3 0.6 L引 物 YG-5 0.6 LddH 2O 7.4 LDNA模 板 1

35、L总 体 积 20 LD.4 结 果 判 定D.4.1 检 测 样 品 的 Ct值 不 小 于 40或 无 Ct值 时 ， 则 判 定 TYLCV阴 性 。D.4.2 检 测 样 品 的 Ct值 不 大 于 35时 ， 则 判 定 TYLCV阳 性 。D.4.3 检 测 样 品 的 Ct值 小 于 40而 大 于 35时 ， 应 重 新 进 行 测 试 ， 如 果 重 新 测 试 的 Ct值 大 于 或 者 等 于 40时 ， 则判 定 TYLCV阴 性 ， 如 果 重 新 测 试 的 Ct值 小 于 40， 则 判 定 TYLCV阳 性 。 DB61/T 1134 2018 12 EE附 录

36、 E（ 规 范 性 附 录 ）生 物 学 接 种E.1 接 种病 叶 加 1： 3（ 质 量 ： 体 积 ） 的 磷 酸 盐 缓 冲 液 （ 0.01mol/L， pH7.2） 于 研 钵 中 充 分 研 碎 ， 在 接 种 植 物叶 片 表 面 均 匀 洒 上 硅 藻 土 ， 用 手 指 蘸 取 研 磨 好 的 汁 液 轻 轻 涂 抹 在 叶 片 表 面 。E.2 寄 主 及 症 状 E.2.1 鉴 别 寄 主E.2.1.1 番 茄 （ Lycopersicon esculentum Mill.） ： 系 统 感 染 。E.2.1.2 烟 草 （ Nicotiana tabacum） ： 系 统 感 染 ； 株 叶 脉 增 粗 叶 片 脊 面 出 现 耳 突 ， 叶 片 有 卷 曲 、 黄 化 。E.2.1.3 辣 椒 （ Capsicum frutescens L.） ： 系 统 感 染 ； 叶 片 卷 曲 、 黄 化 。_