DB34 T 2815-2017 羽绒羽毛中沙门氏菌检测方法 酶联免疫法.pdf

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1、ICS 61.020 Y 76 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 28152017 羽绒羽毛中沙门氏菌检测方法 酶联免疫法 Method for detection of Salmonella in down and feather : Euzymelinked immunosorbent assay（ ELISA） 文稿版次选择 2017 - 03 - 30 发布 2017 - 04 - 30 实施 安徽省质量技术监督局 发布 DB34/T 28152017 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省检验检疫科学技术研究院提出。 本标准由安徽

2、省动植物检验检疫标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位：安徽省检验检疫科学技术研究院。 本标准主要起草人：孙娟娟、陈雪娇、李云飞、宗凯、郑海松、余晓峰。 DB34/T 28152017 1 羽绒羽毛中沙门氏菌检测方法 酶联免疫法 1 范围 本标准规定了羽绒羽毛中沙门氏菌的酶联免疫检测方法。 本标准适用于各种品种、规格的羽绒羽毛及其制品填充料中沙门氏菌的检验。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3

3、 基本信息 沙门氏菌（ salmonella）为革兰氏阴性、两端钝圆的短杆菌，（0.71.5 m） （25 m）散在， 无荚膜和芽孢， （除鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌外）都具有周身鞭毛，能运动，大多数具有菌毛， 能吸附于宿主细胞表面或凝集豚鼠红细胞。沙门氏菌具有复杂的抗原结构，一般沙门氏菌具有菌体(O) 抗原、鞭毛(H)抗原和表面抗原(荚膜或包膜抗原)三种抗原，目前已知有 2000 多种血清型。 4 方法原理 根据沙门氏菌在选择性培养基上形成的菌落特征，或根据酶联免疫筛选的阳性结果挑出可疑菌落， 依据进一步的生化鉴定以及血清学鉴定的结果，对沙门氏菌进行判定。 5 仪器设备 恒温培养箱、冰箱

4、、干热灭菌箱、高压蒸汽灭菌锅、均质器、振荡器、水浴锅、摇床、电子天平、 硝酸纤维素薄膜（0.45 m）、抽滤器、无菌锥形瓶、无菌塑料袋无菌吸管 10 ml(具 0.1 ml 刻度)或 微量移液器及吸头、无菌培养皿、无菌试管、pH 计或 pH 试纸、全自动免疫酶标分析仪、全自动微生 物生化鉴定系统。 6 培养基和试剂 缓冲蛋白胨水（BPW）、四磺酸钠黄绿（TTB）增菌液、亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液、亚硫酸铋（BS） 琼脂、木糖蓝氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂、 沙门氏菌属显色培养基、沙门氏菌 O 和 H 诊断血清、生化 鉴定试剂条、生化鉴定卡。 实验用水应符合 GB/T 6682 的规定。培养基的

5、配制见附录A。 DB34/T 28152017 2 7 检验程序 见图1。 图1 羽绒羽毛中沙门氏菌的检验程序 8 操作步骤 8.1 试样前处理 用无菌镊子和剪刀取出两个各 12 g 样品，称量，精确到 0.1 g，放入烧杯中，每个烧杯加入 1200 ml 0.1蛋白胨生理盐水，室温下，摇床摇匀（160 rpm）或机械（加玻璃珠）搅拌 3 h，无菌纱布过 滤后混合滤液，取 2000 ml 原始滤液，用过滤器经孔径 0.45m 滤膜过滤，滤膜取下，放入装有 100 ml BPW 的均质袋中进行前增菌。36 1培养 1824 h。 8.2 沙门氏菌分离培养 轻轻摇动培养过的样品前增菌混合液，移取

6、1 ml，转种于 10 ml TTB 中，于 42 1培养 18 24 h。同时，另取 1 ml，转种于 10ml SC 中 ，于 361培养 1824 h。 DB34/T 28152017 3 分别用接种环取增菌液 1 环， 划线接种于一个 BS 琼脂平板和一个沙门氏菌属显色培养基平板 （或 XLD 琼脂平板）。于 36 1培养 1824 h（沙门氏菌属显色培养基平板）或 4048 h（BS 琼脂 平板）。 观察各个平板上生长的菌落，各个平板上的菌落特征见表1。 表1 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征 选择性琼脂平板 沙门氏菌 BS 琼脂 菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周

7、围培养基可呈黑色或棕色； 有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。 HE 琼脂 蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色； 有些菌株为黄色，中心黑色或全黑色。 XLD 琼脂 菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部 黑色的菌落； 有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。 沙门氏菌属显色培养基 按照显色培养基的说明进行判定。 用 SC 或 TTB 前增菌的混合液，可 直接用于全自动免疫酶标分析仪进 行初筛，初筛阴性可直接判 定未检出沙门氏菌,初筛阳性须进一步做生化鉴定。 初筛阳性的混合液用接种环划线接种于一个 BS 琼脂平板和一个沙门氏菌属显色培养基平板（

8、或 XLD 琼脂平板）。操作同上。 8.3 生化鉴定 在选择性琼脂平板上分别挑取 2 个以上典型或 可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于 底层穿刺；接种针不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于 361培养 1824 h，必要时可延长至 48 h。 在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表2。 表2 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果 三糖铁琼脂 赖氨酸脱羧酶试验 培养基 初步判断 斜面 底层 产气 硫化氢 K A +() +() + 可疑沙门氏菌属 K A +() +() 可疑沙门氏菌属 A A +() +() + 可

9、疑沙门氏菌属 A A +/ +/ 非沙门氏菌属 K K +/ +/ +/ 非沙门氏菌属 注： K:产碱，A：产酸；+：阳性，：阴性；+()：多数阳性，少数阴性；+/：阳性或阴性。 接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，可直接接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、尿 素琼脂（pH 7.2）、氰化钾（KCN）培 养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板 上挑取可疑菌落接 种于 361培养 1824 h，必要时可延长至 48 h，按表3 判定结果。 将已挑菌落的平板储存于 25或室温至少保留 24 h，以备必要时复查。 DB34/T 28152017 4 表3 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表 反应序

10、号 硫化氢 （H2S） 靛基质 pH 7.2 尿素 氰化钾 （KCN） 赖氨酸脱羧酶 A1 A2 A3 +/ 注： +：阳性，：阴性； +/：阳性或阴性。 反应序号 A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN 和赖氨酸脱羧酶 3 项中有 1 项异常， 按表4 可判定为沙门氏菌。如有 2 项异常为非沙门氏菌。 反应序号 A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门 氏菌靛基质阳性变体两项实验结果均为阳性，但需 要结合血清学鉴定结果进行判定。 反应序号 A3：补做 ONPG。ONPG 阴 性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳 性，甲型副伤寒沙门氏菌 为赖氨酸脱羧酶阴性。 必要时按表5 进行沙门氏菌生化群的鉴

11、别。 表4 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表 pH 7.2 尿素 氰化钾（KCN） 赖氨酸脱羧酶 判定结果 甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果） 沙门氏菌 或 （要求符合本群生化特性） 沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果） 注： + 表示阳性， 表示阴性。 表5 沙门氏菌属各生化群的鉴别 项目 卫矛醇 山梨醇 水杨苷 ONPG 丙二酸盐 KVN 注： + 表示阳性， 表示阴性。 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统， 可从沙门显色培养基或 BS 培养基上挑取可 疑菌落，经营养琼脂平板纯化后，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动 微生物生化鉴定系统进行鉴定。全

12、自动生化鉴定系统可直接鉴定出沙门氏菌菌型。 8.4 血清学分型（选做） 8.4.1 抗原的准备 一般采用 1.21.5琼脂培养物作为玻片凝 集试验用的抗原。O 血清不凝集时，将菌株接种在 琼脂量较高的 （如 23） 培养基上再检查； 如果是由于 Vi 抗原的存在而阻止了 O 凝集反应时， 可挑取菌苔于 1 mL 生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H 抗原发育不良时，将菌 DB34/T 28152017 5 株接种在 0.550.65半固体琼脂平板的中央，菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌 株通过装有 0.30.4半固体琼脂的小玻管 1 次2 次，自远端取菌培养后再检查

13、。 8.4.2 O 抗原的鉴定 在玻片上划出 2 个约 1 cm 2 cm 的区域，挑取 1 环待测菌，各放 1/2 环于玻片上的每一区域 上部，在其中一个区域下部加 1 滴多价菌体（O）抗血清， 在另一区域下部加入 1 滴生理盐水，作为 对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合 1 min，并对 着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。 用 AF 多价 O 血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形菌 株，不能分型。 被 AF 多价 O 血清凝集者，依次用 O4；O3、O10；O7；O8；O9；O2 和 O11 因子

14、血清做凝集试 验。根据试验结果，判定 O 群。被 O3、O10 血清凝集的菌株，再用 O10、O15、O34、O19 单因子血清 做凝集试验，判定 E1、E2、E3、E4 各亚群，每一个 O 抗原成分的最后确定均应根据 O 单因子血清的 检查结果，没有 O 单因子血清的要用两个 O 复合因子血清进行核对。 不被 AF 多价 O 血清凝集者，先用 9 种多价 O 血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种 血清所包括的 O 群血清逐一检查，以确定 O 群。 每种多价 O 血清所包括的 O 因子如下： O 多价 1 A，B，C，D，E，F，群 （并包括 6,14 群） O 多价 2 13，16，17

15、，18，21 群 O 多价 3 28，30，35，38，39 群 O 多价 4 40，41，42，43 群 O 多价 5 44，45，47，48 群 O 多价 6 50，51，52，53 群 O 多价 7 55，56，57，58 群 O 多价 8 59，60，61，62 群 O 多价 9 63，65，66，67 群 8.4.3 H 抗原的鉴定 属于 AF 各 O 群的常见菌型，依次用表6 所述 H 因子血清检查第 1 相和第 2 相的 H 抗原。 表6 AF 群常见菌型 H 抗原表 O 群 第 1 相 第 2 相 A B B C1 C2 D(不产气的) D（产气的） E1 E4 E4 a g,

16、f,s i,b,d k,v,r,c b,d,r d g,m,p,q h,v g,s,t i 无 无 2 5，Z15 2,5 无 无 6，w,x 无 DB34/T 28152017 6 不常见的菌型，先用 8 种多价 H 血清检查，如有其中一种或两种血清凝集，则再用这一种或两种 血清所包括的各种 H 因子血清逐一检查，以第 1 相和第 2 项的 H 抗原。 8 种多价 H 血清所包括的 H 因子如下： H 多价 1 a，b，c，d，i H 多价 2 eh，enx，enz15，fg，gms，gpu，gp，gq，mt，gz51 H 多价 3 k，r，y，z，z10，lv，lw，lz13，lz28，l

17、z40 H 多价 4 1,2；1,5；1,6；1,7；z6 H 多价 5 z4z23，z4z24，z4z32，z29，z35，z36，z38 H 多价 6 z39，z41，z42，z44 H 多价 7 z52，z53，z54，z55 H 多价 8 z56，z57，z60，z61，z62 每一个 H 抗原成分的最后确定均应根据 H 单因子血清的检查结果，没有 H 单因子血清的要用两 个 H 复合因子血清进行核对。检出第 1 相 H 抗原而未检出第 2 相 H 抗原的或检出第 2 相 H 抗原 而未检出第 1 相 H 抗原的,可在琼脂斜面上移种 12 代后再检查。 8.4.4 Vi 抗原的鉴定 用

18、 Vi 因子血清检查。已知具有 Vi 抗原的菌型有：伤寒沙门氏菌，丙型副伤寒沙 门氏菌,都柏林 沙门氏菌。 8.4.5 菌型的判定 根据血清学分型鉴定的结果，按照附录B 或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型。 9 结果与报告 综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告 20 g 样品中检出或未检出沙门氏菌。 DB34/T 28152017 7 A A 附 录 A （资料性附录） 培养基和试剂 A.1 缓冲蛋白胨水（BPW） A.1.1 成分 蛋白胨 10.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸氢二钠（含 12 个结晶水） 9.0 g 磷酸二氢钾 1.5 g 蒸馏水 1000 mL pH 7.20.2 A.1

19、.2 制法 将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约 10 min，煮沸溶解，调节 pH，高压灭菌 121，15 min。 A.2 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液 A.2.1 基础液 蛋白胨 10.0 g 牛肉膏 5.0 g 氯化钠 3.0 g 碳酸钙 45.0 g 蒸馏水 1000 mL pH 7.00.2 除碳酸钙外，将各成分加入蒸馏水中煮沸溶解，再加入碳酸钙，调节 pH，高压灭菌 121，20 min。 A.2.2 硫代硫酸钠溶液 硫代硫酸钠（含5 个结晶水） 50.0 g 蒸馏水 加至 100 mL 高压灭菌 121，20 min。 A.2.3 碘溶液 碘 片 20.0 g 碘化钾 25

20、.0 g 蒸馏水 加至 100 mL 将碘化钾充分溶解于少量的蒸馏水中，再投入碘片，振摇玻瓶至碘片全部溶解为止，然后加蒸馏水 至规定的总量，贮存于棕色瓶内，塞紧瓶盖备用。 DB34/T 28152017 8 A.2.4 0.5煌绿水溶液 煌绿 0.5 g 蒸馏水 100 mL 溶解后，存放暗处，不少于 1 d，使其自然灭菌。 A.2.5 牛胆盐溶液 牛胆盐 10.0 g 蒸馏水 100 mL 加热煮沸至完全溶解，高压灭菌 121，20 min。 A.2.6 制法 基础液 900 mL 硫代硫酸钠溶液 100 mL 碘溶液 20.0 mL 煌绿水溶液 2.0 mL 牛胆盐溶液 50.0 mL 临

21、用前，按上列顺序，以无菌操作依次加入基础液中，每加入一种成分，均应摇匀后再加入另一种 成分。 A.3 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液 A.3.1 成分 蛋白胨 5.0 g 乳糖 4.0 g 磷酸氢二钠 10.0 g 亚硒酸氢钠 4.0 g L-胱氨酸 0.01 g 蒸馏水 1 000 mL pH 7.00.2 A.3.2 制法 除亚硒酸氢钠和 L-胱氨酸外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，冷至 55以下，以无菌操作加 入亚硒酸氢钠和 1 g/L L-胱氨酸溶液 10 mL（称取 0.1 g L-胱氨酸，加 1 mol/L 氢氧化钠溶液 15 mL， 使溶解，再加无菌蒸馏水至 100 mL 即成，

22、如为 DL-胱氨酸，用量应加倍）。摇匀，调节 pH。 A.4 亚硫酸铋（BS）琼脂 A.4.1 成分 蛋白胨 10.0 g 牛肉膏 5.0 g 葡萄糖 5.0 g DB34/T 28152017 9 硫酸亚铁 0.3 g 磷酸氢二钠 4.0 g 煌绿 0.025 g 或 5.0gL 水溶液 5.0 mL 柠檬酸铋铵 2.0 g 亚硫酸钠 6.0 g 琼 脂 18.0 g20 g 蒸馏水 1 000 mL pH 7.50.2 A.4.2 制法 将前三种成分加入 300 mL 蒸馏水（制作基础液），硫酸亚铁和磷酸氢二钠分别加入 20 mL 和 30 mL 蒸馏水中，柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入另一

23、 20 mL 和 30 mL 蒸馏水中，琼脂加入 600 mL 蒸 馏水中。然后分别搅拌均匀，煮沸溶解。冷至 80左右时，先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀，倒入基 础液中，混匀。将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混匀，倒入基础液中，再混匀。调节 pH，随即倾入琼脂液中， 混合均匀，冷至 5055。加入煌绿溶液，充分混匀后立即倾注平皿。 注： 本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处，超过 48 h 会降 低其选择性，本培养基宜于当天制备，第二天使用。 A.5 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂 A.5.1 成分 酵母膏 3.0 g L-赖氨酸 5.0 g 木糖 3.75

24、g 乳糖 7.5 g 蔗糖 7.5 g 去氧胆酸钠 2.5 g 柠檬酸铁铵 0.8 g 硫代硫酸钠 6.8 g 氯化钠 5.0 g 琼脂 15.0 g 酚红 0.08 g 蒸馏水 1000 mL pH 7.40.2 A.5.2 制法 除酚红和琼脂外，将其他成分加入 400 mL 蒸馏水中，煮沸溶解，调节 pH。另将琼脂加入 600 mL 蒸馏水中，煮沸溶解。将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，待冷至 5055倾注平皿。 注： 本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处。本培养基宜于当 天制备，第二天使用。 DB34/T 28152017 10 A.6 三

25、糖铁（TSI）琼脂 A.6.1 成分 蛋白胨 20.0 g 牛肉膏 5.0 g 乳 糖 10.0 g 蔗 糖 10.0 g 葡萄糖 1.0 g 硫酸亚铁铵（含 6 个结晶水） 0.2 g 酚 红 0.025 g 或 5.0 g/L 溶液 5.0 mL 氯化钠 5.0 g 硫代硫酸钠 0.2 g 琼 脂 12.0 g 蒸馏水 1000 mL pH 7.40.2 A.6.2 制法 除酚红和琼脂外，将其他成分加入 400 mL 蒸馏水中，煮沸溶解，调节 pH。另将琼脂加入 600 mL 蒸馏水中，煮沸溶解。将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，混匀，分装试管，每管约 2 mL4 mL， 高压灭菌 1

26、21 10 min 或 115 15 min，灭菌后置成高层斜面，呈桔红色。 A.7 蛋白胨水、靛基质试剂 A.7.1 蛋白胨水 蛋白胨（或胰蛋白胨） 20.0 g 氯化钠 5.0 g 蒸馏水 1000 mL pH 7.40.2 将上述成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，调节 pH，分装小试管,121高压灭菌 15 min。 A.7.2 靛基质试剂 A.7.2.1 柯凡克试剂：将 5 g 对二甲氨基甲醛溶解于 75 m L 戊醇中,然后缓慢加入浓盐酸 25 mL。 A.7.2.2 欧-波试剂：将 1 g 对二甲氨基苯甲醛溶解于 95 mL 95乙醇内。然后缓慢加入浓盐酸 20 mL。 A.7.3 试验

27、方法 挑取小量培养物接种,在 36 1培养 1 d2 d，必要时可培养 4 d5 d。加入柯凡克试剂约 0.5 mL，轻摇试管,阳性者于试剂层呈深红色；或加入欧- 波试剂约 0.5 mL，沿管壁流下，覆盖于培养 液表面,阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。 注： 蛋白胨中应含有丰富的色氯酸。每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。 A.8 尿素琼脂（pH 7.2） DB34/T 28152017 11 A.8.1 成分 蛋白胨 1.0 g 氯化钠 5.0 g 葡萄糖 1.0 g 磷酸二氢钾 2.0 g 0.4酚红 3.0 mL 琼 脂 20.0 g 蒸馏水 1000 mL 20尿素溶液 10

28、0 mL pH7.20.2 A.8.2 制法 除尿素、 琼脂和酚红外， 将其他成分加入 400 mL 蒸馏水中， 煮沸溶解， 调节 pH。 另将琼脂加入 600 mL 蒸馏水中，煮沸溶解。将上述两溶液混合均 匀后，再加入指示剂后分装，121高压灭菌 15 min。 冷至 5055,加入经除菌过滤的尿素溶液。尿素的最终浓度为 2。分装于无菌试管内，放成斜面 备用。 A.8.3 试验方法 挑取琼脂培养物接种,在 36 1培养 24 h，观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为 红色。 A.9 氰化钾 （KCN）培养基 A.9.1 成分 蛋白胨 10.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸二氢钾 0.

29、225 g 磷酸氢二钠 5.64 g 蒸馏水 1000 mL 0.5氰化钾 20.0 mL A.9.2 制法 将除氰化钾以外的成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，分装后 121高压灭菌 15 min。放在冰箱内使 其充分冷却。每 100 mL 培养基加入 0.5氰化钾溶液 2. 0 mL（最后浓度为 1:10 000），分装于无菌 试管内,每管约 4 mL,立刻用无菌橡皮塞塞紧, 放在 4冰箱内,至少可保存两个月。同时，将不加氰化 钾的培养基作为对照培养基,分装试管备用。 A.9.3 试验方法 将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成为稀释菌液，挑取 1 环接种于氰化钾（KCN）培养基。并另挑取 1 环接种于对

30、照培养基。在 36 1培养 1 d2 d，观察结果。如有细菌生长即为阳性（不抑制）， 经 2 d 细菌不生长为阴性（抑制）。 注： 氰化钾是剧毒药,使用时应小心，切勿沾染，以免中毒。夏天分装培养基应在冰箱内进行。试验失败的主要原 DB34/T 28152017 12 因是封口不严,氰化钾逐渐分解，产生氢氰酸气体逸出，以致药物浓度降低，细菌生长，因而造成假阳性反应。 试验时对每一环节都要特别注意。 A.10 赖氨酸脱羧酶试验培养基 A.10.1 成分 蛋白胨 5.0 g 酵母浸膏 3.0 g 葡萄糖 1.0 g 蒸馏水 1000 mL 1.6溴甲酚紫-乙醇溶液 1.0 mL L-赖氨酸或 DL-

31、赖氨酸 0. 5 g/100 mL 或 1.0 g/100 mL pH 6.80.2 A.10.2 制法 除赖氨酸以外的成分加热溶解后,分装每瓶 100 mL，分别加入赖氨酸。L-赖氨酸按 0.5加入，DL- 赖氨酸按 1加入。调节 pH。对照培养基不加赖氨酸。分装于无菌的小试管内，每管 0.5 mL，上面滴 加一层液体石蜡，115高压灭菌 10 min。 A.10.3 试验方法 从琼脂斜面上挑取培养物接种，于 36 1培养 18 h24 h，观察结果。氨基酸脱羧酶阳性者 由于产碱，培养基应呈紫色。阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管应为黄 色。 A.11 糖发酵管 A.

32、11.1 成分 牛肉膏 5.0 g 蛋白胨 10.0 g 氯化钠 3.0 g 磷酸氢二钠（含 12 个结晶水） 2.0 g 0.2溴麝香草酚蓝溶液 12.0 mL 蒸馏水 1000 mL pH 7.40.2 A.11.2 制法 A.11.2.1 葡萄糖发酵管按上述成分配好后，调节 pH。按 0.5加入葡萄糖，分装于有一个倒置小管 的小试管内，121高压灭菌 15 min。 A.11.2.2 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后,分装每瓶 100 mL，121 高压灭菌 15 min。另将各 种糖类分别配好 10溶液，同时高压灭菌。将 5 mL 糖溶液加入于 100 mL 培养基内，以无菌操作分

33、装小试管。 注： 蔗糖不纯,加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。 DB34/T 28152017 13 A.11.3 试验方法 从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于 36 1培养,一般 2 d3 d。迟缓反应需观察 14 d 30 d。 A.12 ONPG 培养基 A.12.1 成分 邻硝基酚 -D 半乳糖苷（ONPG） 60.0 mg （O-Nitrophenyl- -D-galactopyranoside） 0.01 mol/L 磷酸钠缓冲液（pH7.5 ） 10.0 mL 1蛋白胨水（pH7.5） 30.0 mL A.12.2 制法 将 ONPG 溶于缓冲液内，加入蛋白胨水，以过滤法除菌

34、， 分装于无菌的小试管内，每管 0.5 mL， 用橡皮塞塞紧。 A.12.3 试验方法 自琼脂斜面上挑取培养物 1 满环接种于 36 1培养 1 h3 h 和 24 h 观察结果。如果 -半 乳糖苷酶产生，则于 1 h3 h 变黄色，如无此酶则 24 h 不变色。 A.13 半固体琼脂 A.13.1 成分 牛肉膏 0.3 g 蛋白胨 1.0 g 氯化钠 0.5 g 琼脂 0.35 g0.4 g 蒸馏水 100 mL pH 7.40.2 A.13.2 制法 按以上成分配好,煮沸溶解,调节 pH。分装小试管。121高压灭菌 15 min。直立凝固备用。 注： 供动力观察、菌种保存、H 抗原位相变异

35、试验等用。 A.14 丙二酸钠培养基 A.14.1 成分 酵母浸膏 1.0 g 硫酸铵 2.0 g 磷酸氢二钾 0.6 g 磷酸二氢钾 0.4 g DB34/T 28152017 14 氯化钠 2.0 g 丙二酸钠 3.0 g 0.2溴麝香草酚蓝溶液 12.0 mL 蒸馏水 1000 mL pH 6.80.2 A.14.2 制法 除指示剂以外的成分溶解于水，调节 pH，再加入指示剂，分装试管，121高压灭菌 15 min。 A.14.3 试验方法 用新鲜的琼脂培养物接种，于 36 1培养 48 h，观察结果。阳性者由绿色变为蓝色。 DB34/T 28152017 15 B B 附 录 B （资

36、料性附录） 常见沙门氏菌抗原 常见沙门氏菌抗原见表B.1。 表B.1 常见沙门氏菌抗原表 菌名 拉丁菌名 O 抗原 H 抗原 第 1 相 第 2 相 A 群 甲型副伤寒沙门氏菌 S. paratyphi A 1，2，12 a 1,5 B 群 基桑加尼沙门氏菌 S .kisangani 1,4,5,12 a 1,2 阿雷查瓦莱塔沙门氏菌 S. arechavaleta 4,5,12 a 1,7 马流产沙门氏菌 S. abortusequi 4,12 - e,n,x, 乙型副伤寒沙门氏菌 S. paratyphi B 1,4,5,12 b 1,2 利密特沙门氏菌 S. limete ,4,12,2

37、7 b 1,5 阿邦尼沙门氏菌 S. abony 1,4,5,12,27 b e,n,x 维也钠沙门氏菌 S. wien ,4,12,27 b l,w 伯里沙门氏菌 S .bury 4,12,27 c z6 斯坦利沙门氏菌 S. stanley 1,4,5,12,27 d 1,2 圣保罗沙门氏菌 S. saintpaul 1,4,5,12 e,h 1,2 里定沙门氏菌 S .reading ,4,5,12 e,h 1,5 彻斯特沙门氏菌 S. chester 1,4,5,12 e,h e,n,x 德尔卑沙门氏菌 S. derb y ,4,5,12 f,g 1,2 阿贡纳沙门氏菌 S. agon

38、a 1,4,5,12 f,g,s 1,2 埃森沙门氏菌 S. essen 4,12 g,m - 加利福尼亚沙门氏菌 S. california 4,12 g,m,t z67 金斯敦沙门氏菌 S.kingston 1,4,5,12,27 g,s,t 1,2 布达佩斯沙门氏菌 S. budapest 1,4,12,27 g,t - 鼠伤寒沙门氏菌 S.typhimurium 1,4,5,12 i 1,2 布雷登尼沙门氏菌 S.bredeney 1,4,12,27 l,v 1,7 基尔瓦沙门氏菌 S.kilwa 4,12 l,w e,n,x 海德尔堡沙门氏菌 S.heidelberg 1,4,15,

39、12 r 1,2 印地安纳沙门氏菌 S.indiana 1,4,12 z 1,7 斯坦利维尔沙门氏菌 S.stanleyville 1,4,5,12.27 z4,z23 1,2 伊图里沙门氏菌 S.ituri 1,4,12 z10 1,5 C1 群 奥斯陆沙门氏菌 S.oslo 6,7,14 a e,n,x DB34/T 28152017 16 菌名 拉丁菌名 O 抗原 H 抗原 第 1 相 第 2 相 爱丁保沙门氏菌 S.edinburg 6,7,14 b 1,5 布隆方丹沙门氏菌 S.bloemfontein 6,7 b e,n,x：z 42 丙型副伤寒沙门氏菌 S.paratyphi C

40、 6,7,Vi c 1,5 猪霍乱沙门氏菌 S.choleraesuis 6,7 c 1,5 猪伤寒沙门氏菌 S.typhisuis 6,7 c 1,5 罗米他沙门氏菌 S.lomita 6,7 e,h 1,5 布伦登卢普沙门氏菌 S.braenderup 6,7,14 e,h e,n,z15 里森沙门氏菌 S.rissen 6,7,14 f,g - 蒙得维的亚沙门氏菌 S.montevideo 6,7,14 g,m,p,s 1,2,7 里吉尔沙门氏菌 S.riggil 6,7 g,t - 奥雷宁堡沙门氏菌 S.oranieburg 6,7,14 m,t 2,5,7 奥里塔蔓林沙门氏菌 S.o

41、ritamerin 6,7 i 1,5 汤卜逊沙门氏菌 S.thompson 6,7,14 k 1,5 康科德沙门氏菌 S.concord 6,7 l,v 1,2 伊鲁木沙门氏菌 S.irumu 6,7 l,v 1,5 姆卡巴沙门氏菌 S.mkamba 6,7 l,v 1,6 波恩沙门氏菌 S.bonn 6,7 l,v e,n,x 波茨坦沙门氏菌 S.potsdam 6,7,14 l,v e,n,z15 格但斯克沙门氏菌 S.gdansk 6,7,14 l,v z6 维尔肖沙门氏菌 S.virchow 6,7,14 r 1,2 婴儿沙门氏菌 S.infantis 6,7,14 r 1,5 巴布

42、亚沙门氏菌 S.papuana 6,7 y e,n,z15 巴累利沙门氏菌 S.bareilly 6,7,14 y 1,5 哈特福德沙门氏菌 S.hartford 6,7 y e,n,x 三河岛沙门氏菌 S.mikawasima 6,7,14 y e,n,z15 姆班达卡沙门氏菌 S.mbandaka 6,7,14 z10 e,n,z15 田纳西沙门氏菌 S.tennessee 6,7,14 Z29 1,2,7 布伦登卢普沙门氏菌 S.braenderup 6,7,14 e,h e,n,z15 耶路撒冷沙门氏菌 S.jerusalem 6,7,14 z10 l,w C2 群 习志野沙门氏菌 S

43、.narashino 6,8 a e,n,x 名古屋沙门氏菌 S.nagoya 6,8 b 1,5 加瓦尼沙门氏菌 S.gatuni 6,8 b e,n,x 慕尼黑沙门氏菌 S.muenchen 6,8 d 1,2 蔓哈顿沙门氏菌 S.manhattan 6,8 d 1,5 纽波特沙门氏菌 S.newport 6,8,20 e,h 1,2 科特布斯沙门氏菌 S.kottbus 6,8 e,h 1,5 茨昂威沙门氏菌 S.tshiongwe 6,8 e,h e,n,z15 林登堡沙门氏菌 S.lindenburg 6,8 i 1,2 DB34/T 28152017 17 菌名 拉丁菌名 O 抗原

44、 H 抗原 第 1 相 第 2 相 塔科拉迪沙门氏菌 S.takoradi 6,8 i 1,5 波那雷恩沙门氏菌 S.bonariensis 6,8 i e,n,x 利齐菲尔德沙门氏菌 S.litchfield 6,8 l,v 1,2 病牛沙门氏菌 S.bovismorbificans 6,8,20 r,i 1,5 查理沙门氏菌 S.chailey 6,8 Z4, z23 e,n,z15 C3 群 巴尔多沙门氏菌 S.bardo 8 e,h 1,2 依麦克沙门氏菌 S.emek 8,20 g,m,s - 肯塔基沙门氏菌 S.kentucky 8,20 i Z6 D 群 仙台沙门氏菌 S.sendai 1,9,12 a 1,5 伤寒沙门氏菌 S.typhi 9,12,Vi d - 塔西沙门氏菌 S.tarshyne 9,12 d 1,6 伊斯特本沙门氏菌 S.eastbourne 1,9,12 e,h 1,5 以色列沙门氏菌 S.israel 9,12 e,h e,n,z15 肠炎沙门氏菌 S.enteritidis 1,9,12 g,m