WS T 647-2019 溶葡萄球菌酶和溶菌酶消毒剂卫生要求.pdf

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1、ICS 11.080 C 59 WS 中华人民共和国卫生行业标准 WS/T 647 2019 溶 葡萄球菌酶和溶菌酶消毒剂卫生要求 Hygienic requirement for lysostaphin and lysozyme disinfectants 2019-01-30 发布 2019-07-01 实施 中华人民共和国国家卫生健康委员会 发布 I 目 次 前言 1 1 范围 2 2 规范性引用文件 2 3 术语和定义 2 4 原料要求 3 5 技术要求 3 6 应用范围 4 7 使用方法 4 8 运输、贮存和包装 5 9 标签、标志和说明书 5 10 检验方法 5 附录 A（规范性附

2、录）溶葡萄球菌酶酶活性测定 7 附录 B（规范性附录）溶菌酶酶活性测定 9 附录 C（资料性附录）溶葡萄球菌酶色源底物制备 . 11 WS/T 647 2019 1 前 言 本部分按照 GB/T1.1 2009 给出的规则起草。 本 部分起草单位 ： 上海市疾病预防控制中心、中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所、复旦大学 。 本 部分 主要起草人： 田靓、朱仁义、袁政安、沈伟、沈瑾、邱侠、陆婉英、黄青山、李国栋、陆晔、赵晓蔚、黄晋江、吴宏宇。 WS/T 647 2019 2 溶葡萄球菌酶和溶菌酶消毒剂卫生要求 1 范围 本 标准 规定了 溶葡萄球菌酶和溶菌酶 消毒剂的 原料要求、 技术

3、要求、应用范围、使用方法、 运输贮存和包装、标签标志和说明书、检验方法。 本 部分 适用于以溶葡萄球菌酶和 （或） 溶菌酶为主要 杀菌 成分的酶类消毒剂。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 191 包装储 运 图示标志 GB 27950 手消毒剂卫生要求 GB 27951 皮肤消毒剂卫生要求 GB 27954 黏膜消毒剂卫生要求 中华人民共和国药典（ 2015年版） 消毒技术规范（ 2002年版） 卫生部 （ 卫法监发 2002 282号

4、） 消毒产品标签说明书管理规范 卫生部（ 卫监督发 2005 426号 ） 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本 文件 。 3.1 酶类 消毒剂 enzyme disinfectant 以酶为主要 杀菌 成分 的消毒剂 。 3.2 溶葡萄球菌酶 lysostaphin 能水解细菌细胞壁肽聚糖中的甘氨酸肽键，使细菌死亡的酶。 3.3 溶菌酶 lysozyme 能 水解细菌中黏多糖的酶。亦称胞壁质酶、 N-乙酰胞壁质聚糖水解酶。 3.4 酶活 性 单位 enzyme activity unit 酶活 性 的度量单位。 1个酶活 性 单位指在特定条件下，在 单位时间内 转化 单位 底物 （ 或转化

5、底物中单位 有关基团 ） 的酶量。 WS/T 647 2019 3 4 原料要求 4.1 溶葡萄球菌酶 白色或微黄色粉末 ， 无臭 、 易溶 于水； 按干燥品计算， 酶活性单位应 100 U/mg。 4.2 溶菌酶 符合 国家药品标准 中溶菌酶的要求 。 4.3 生产用水 符合中华人民共和国药典（ 2015年版）中纯化水的要求。 4.4 其他原料 为 食品级或化学纯或 符合药典规定的原料 ， 符合 国家有关 规定 ， 不得使用工业级 。 4.5 禁 用物质 不应含有抗生素、抗真菌药物、激素以及国家规定的其他禁用物质。 5 技术要求 5.1 外观 不分层、无沉淀和悬浮物、无异味 。 5.2 理化

6、指标 5.2.1 pH 值 pH值为 5.0 8.0。 5.2.2 有效含量 消毒剂中 溶葡萄球菌酶 的活性范围为 0.5 U/mL 20 U/mL，溶菌酶的活性范围为 10000 U/mL200000 U/mL。 产品有 效成分含量在 设定值或标示中心值的 80% 150%之内。 5.2.3 稳定性 12个月 。 5.3 杀灭微生物指标 作用浓度和时间按产品标签说明书的要求 ，杀 灭微生物指标 应符合表 1要求。 用于手消毒 应 符合 GB 27950的要求；用于皮肤消毒 应 符合 GB 27951的要求；用于黏膜消毒 应 符合GB 27954的要求。 WS/T 647 2019 4 表 1

7、 杀灭微生物指标 项目 杀灭对数值 悬液法 载体法 大肠杆菌（ 8099） 5.00 3.00 金黄色葡萄球菌（ ATCC 6538） 5.00 3.00 铜绿假单胞菌（ ATCC 15442） 5.00 3.00 白色念珠菌（ ATCC 10231） 4.00 3.00 自然菌（现场试验 a） 1.00 a 用于手消毒做手现场试验，用于皮肤或黏膜消毒做皮肤现场试验。 6 应用范围 适用于 手、 皮肤 和 黏膜的消毒。 按产品说明书并有实验依据的产品可增加其他应用范围。 7 使用方法 7.1 手 消毒 7.1.1 卫生手消毒 取适量消毒剂于手心，双手互搓使均匀涂布每个部位，作用时间符合 GB

8、27950的要求。 7.1.2 外科手消毒 外科洗手后，取适量消毒剂均匀涂布于双手、前臂和上臂下 1/3的皮肤， 作用时间 符合 GB 27950的要求。 7.2 皮肤消毒 7.2.1 完整皮肤 取 消毒剂 原液，或将消毒剂原液用符合中华人民共和国药典（ 2015年版）的纯化水或无菌水稀释至说明书规定浓度， 均匀喷雾或用 医用棉拭子擦拭 皮肤表面 ，作用时间应 符合 GB 27951的要求。 7.2.2 破损皮肤 从原包装倒出 后一次性使用。取 消毒剂 原液，或将消毒剂原液用 符合中华人民共和国药典（ 2015年版）的 无菌水稀释至说明书规定浓度，冲洗破损 皮肤表面 ，作用时间应符合 GB 2

9、7951的要求。 7.3 黏膜消毒 7.3.1 口腔黏膜 从原包装倒出 后一次性使用。用消毒剂原液，或将消毒剂原液用 符合中华人民共和国药典（ 2015年版）的纯化水或 无 菌水稀释至说明书规定浓度，均匀喷雾或用医用棉拭子擦拭或含漱，作用时间按照说明书，最长作用时间 5 min。 WS/T 647 2019 5 7.3.2 阴道和外生殖器黏膜 从原包装倒出 后一次性使用。用消毒剂原液，或将消毒剂原液用 符合中华人民共和国药典（ 2015年版）的纯化水或 无菌水稀释至说明书规定浓度，用医用棉拭子擦拭或灌洗或冲洗，作用时间按照说明书，最长作用时间 5 min。 8 运输 、 贮存 和包装 8.1

10、运输 运输产品时 应 避免日晒、雨淋。不 可 与有异味或影响产品质量的物品混装运输。 8.2 贮存 室温 或 阴凉处保存，避光、密闭、干燥 ， 不 可 与有异味或影响产品质量的物品同处贮存。 8.3 包装 产品的包装无毒和清洁，包装材质符合相应材料的化妆品包装要求。产品的包装 密封， 能保证产品的稳定性以及在储存运输、使用过程中的安全性。 包装储运图示标志 应 符合 GBT l91要求 。 9 标识要求 9.1 标签和说明书 符合 消毒产品标签说明书管理规范 9.2 注意事项 说明书至少包括以下内容： 避免接触拮抗物。不能与阴离子表面活性剂 、 Ba2+、 Ca2+、 Mg2+等 同时使用。

11、置于儿童不易触及处。 对蛋白质过敏者慎用。 10 检验方法 10.1 外观 用肉眼观察其色泽、形态，用嗅觉鉴别其气味。 10.2 pH 值测定 按消毒技术规范 （ 2002年版） 规定 方法测定。 10.3 有效含量测定 10.3.1 溶葡萄球菌酶 活性测定 按照 附录 A规定方法 测定 。 10.3.2 溶菌酶 活性测定 WS/T 647 2019 6 按照附录 B规定方法 测定 。 10.4 稳定性测定 按消毒技术规范（ 2002年版）的方法，用微生物法进行稳定性实验。有效 期 24个 月，用自然留样法测定；有效期为 24个月， 根据产品性能，选用 37 存放 90 d的方法 ，或用 自然

12、留样法测定。 在有效期内，有效成分含量不得低于标示量的下限值。 10.5 杀灭微生物试验 按消毒技术规范 （ 2002年版 有关规定 测定。 宜采用悬液法；若选用载体法时，应采用非吸附性材料（ 金属、玻璃、猪皮等 ）做载体。 WS/T 647 2019 7 A A 附 录 A （ 规范性 附录） 溶葡萄球菌酶酶活性测定 A.1 原理 以偶联活性艳蓝染料 KNR的金黄色葡萄球菌细胞壁肽聚糖（ KNR-PG）为色源底物，根据酶作用过程中定量地释放带有 KNR染料基团的小分子可溶性片段产物，在除去未反应的不溶性底物后，对上清液进行比色测定溶葡萄球菌 酶 酶活性。 在 pH 10.0的 1.2 mL反

13、应体系下， 37 温度下， 在波长 595 nm处，每分钟使 KNR-PG溶液吸光度值增加 0.35的酶量为 1个溶葡萄球菌酶酶活性单位。 A.2 试剂 A.2.1 溶葡萄球菌酶 标准 品 溶液：按照溶葡萄球菌酶活性单位定义，对溶葡萄球菌酶冻干粉进行标定。需要时，用 Tris-HCl缓冲液 溶解，配制成 0.9 U/mL的标准品溶液， -20 贮存，每次试验用 1支，避免反复冻融。 A.2.2 甘氨酸 ：分析纯。 A.2.3 氢氧化钠 ：分析纯。 A.2.4 三羟甲基氨基甲烷 （ Tris） ：分析纯。 A.2.5 95%乙醇 ：分析纯。 A.2.6 甘氨酸 -氢氧化钠缓冲液 ： 0.2 mo

14、l/L， pH 10.0。 A.2.7 三羟甲基氨基甲烷 盐酸 缓冲液 （ Tris-HCl缓冲液）： 0.05 mol/L， pH 7.5。 A.2.8 色源底物 KNR-PG溶液：按照附录 C方法制备 色源底物 KNR-PG， 用 甘氨酸 -氢氧化钠缓冲液以 1:5质量体积 比例均匀悬浮。 A.3 试验步骤 A.3.1 标准曲线的制备 取洁净干燥的 微量离心 管 6只，标号，按表 A.1顺序每管中加入对应量的溶葡萄球菌酶 标准品 溶液（ A.2.1） ，再加入不同量的 0.2 mol/L甘氨酸 -氢氧化钠缓冲液 （ A.2.6） 。然后按序号加入色源底物 KNR-PG溶液（ A.2.8）

15、130L，每管加入底物后迅速在旋涡混合仪上混匀。将加好溶液的微量离心管迅速移入 37 的恒温水浴锅中定时反应 20 min。从水浴中取出微量离心管，每管中加入 300 L95%乙醇终止反应， 10000 r/min离心 10 min，离心结束后，取上清液于 595 nm处，以 0号管为空白测定吸光度。根据测得的吸光度值及相对应的 标准 品溶葡萄球菌酶酶活性（ U/mL），求得线性回归曲线： C0=（ A-B） /K（ A.1） 式中： C0 标准 品溶葡萄球菌酶酶活性（ U/mL） ； A 吸光度 ； B 截距 ； K 标准曲线的斜率 。 WS/T 647 2019 8 表 A.1 标准曲线制

16、备 管号 0 1 2 3 4 5 溶 葡萄球菌酶标准品溶液 /L 0 20 40 60 80 100 甘氨酸 -氢氧化钠缓冲液 /L 770 750 730 710 690 670 底物 /L 130 130 130 130 130 130 95%乙醇 /L 300 300 300 300 300 300 溶葡萄球菌酶标准品溶液终浓度 /U/mL 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 A.3.2 样品的测定 待测样品的测定方法同标准曲线， 取 50 L 用于测定。 平行测定 3次，计算平均值。 A.4 结果计算 根据标准曲线，计算未知溶液中 溶葡萄球菌 酶 酶活性 ，见下式： C

17、 = C0V 反 /V样 N（ A.2） 式中： C 样品溶葡萄球菌 酶 酶活性（ U/mL） ； C0 标准 品溶葡萄球菌酶酶活性（ U/mL） ； V反 反应体系体积 ，为 0.9 mL； V样 样品加入体积 ，为 0.05 mL； N 样品稀释倍数 。 WS/T 647 2019 9 附 录 B （ 规范 性附录） 溶菌酶酶活性测定 B.1 原理 溶菌酶通过溶解 革兰阳性 菌细胞壁使细菌溶解，菌液在可见光范围内的吸光度降低，以溶壁微球菌为底物，用分光光度法，以 450 nm波长处菌液单位时间内吸光度降低程度测定溶菌酶 酶 活 性 。 在室温 25 、 pH为 6.2时，在波长 450 n

18、m处，每 分钟 引起吸收度下降 0.001为 1个 溶菌酶 酶 活 性 单位。 B.2 试剂 B.2.1 磷酸盐缓冲液：取磷酸二氢钠 10.4 g与磷酸氢二钠 7.86 g及乙二胺四乙酸二钠 0.37 g，加水溶解至 1000 mL， 调节 pH至 6.2。 B.2.2 溶壁微球菌 Micrococcuslysodeik， CGMCC1.0634。 B.3 试验步骤 B.3.1 样品 溶液制备 量取样品，用磷酸盐缓冲液稀释成约 1000 U/mL的溶液，稀释所用倍数记为 N。 B.3.2 底物悬浮液的制备 临用前配制 。 称取溶壁微球菌 15 mg 20 mg，加磷酸盐缓冲液 0.5 mL 1

19、 mL， 在研钵内研磨 3 min，再加磷酸盐缓冲液适量，使总体积约为 50 mL，悬浮液于 25 0.1 在 450 nm波长处测得的吸收度为0.700.05。 B.3.3 样品测定 量取 25 0.1 的底物悬浮液 3 mL，置比色池中，在 450 nm的波长处测定吸收度，作为 0 s的读数A0，然后量取 25 0.1 的供试品溶液 0.15 mL（ 相当于溶菌酶 7.5 g） ，加到比色池中，迅速混匀，用秒表计时 ， 至 60 s时再测定吸收度 A；同时量取磷酸盐缓冲液 0.15mL，同法操作，做 为空白试验，测得0 s的读数 A0及 60 s的读数 A。 平行测定 3次，计算平均值。

20、B.4 结果计算 计算未知溶液中 溶菌 酶 酶活性 ，见下式： C 0 .1 5 A-A-A-A 00 ）（）（ N103（ B.1） 式中： C 样品溶菌酶酶活性（ U/mL） ； A0 样品 0s时的吸收度 ； A 样品 60s时的吸收度 ； A0 空白 0s时的吸收度 ； A 空白 60s时的吸收度 ； N 稀释倍数 。 WS/T 647 2019 10 附 录 C （ 规范 性附录） 溶葡萄球菌酶色源底物制备 C.1 试剂 C.1.1 三氯乙酸（ TCA） 10%TCA： 取三氯乙酸 10 g，溶解于 100mL纯水中。 5%TCA：取三氯乙酸 5 g，溶解于 100mL纯水中。 C.

21、1.2 0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷 盐酸 缓冲液（ Tris-HCl） 取 三羟甲基氨基甲烷 6.0g，加水 800mL溶解，用盐酸调节 pH至 7.5后，用水稀释至 1000mL。 C.1.3 0.25mol/L 氢氧化钠溶液 取氢氧化钠 10.0g，加水 1000mL溶解。 C.1.4 其他试剂 金黄色葡萄球菌 、生理盐水、 胰蛋白酶 、 艳蓝染料（ KNR染料） 、 叠氮钠 、纯水 。 C.2 制备 方法 C.2.1 按照消毒技术规范（ 2002年版）有关 规定 制备 金黄色葡萄球菌 悬液。 C.2.2 对菌 悬液 121 20min灭菌 后 进行离心，收集菌体。 C.2.3 菌

22、体沉淀用生理盐水离心洗涤 2次。 C.2.4 用 7倍菌体质量的 10%TCA溶液悬浮菌体， 4 放置 72h。 C.2.5 离心，将菌体用生理盐水离心洗涤一次。 C.2.6 用 5倍菌体质量的 5%TCA溶液悬浮菌体， 90 水浴 10min。 C.2.7 离心收集沉淀，生理盐水离心洗涤 3次。 C.2.8 用 5倍菌体质量的 Tris-HCl悬浮菌体，按 0.5mg/mL浓度加入胰蛋白酶，置于 37 水浴 24h。 C.2.9 菌体于 90 水浴 10min，灭活胰蛋白酶。 C.2.10 离心收集沉淀，用纯水离心洗涤 3次。 C.2.11 用少量纯水悬浮菌体，于 4 下对纯水透析 24h。 C.2.12 离心，收集沉淀。 C.2.13 按 7倍菌体质量，配制 0.25N的氢氧化钠溶液适量。 C.2.14 用配制好的 0.25N的氢氧化钠溶液的一半体积悬浮菌体。 C.2.15 按 1/7的菌体质 量称取 KNR染料，用剩余的氢氧化钠溶液进行溶解。 C.2.16 在悬浮的菌液中加入配制好的染料， 37 水浴 24h。 C.2.17 离心，纯水洗涤至上清液无色，用少量纯水悬浮菌体，转移至保存容器内，按 10mg/L浓度加入叠氮钠， 4 保存。 _