WS T 562-2017 克-雅病诊断.pdf

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1、 ICS 11.020 C 59 WS 中华人民共和国 卫生 行业标准 WS/T 562 2017 克 -雅病诊断 Diagnosis for Creutzfeldt-Jakob disease 2017 - 07 - 24 发布 2018 - 02- 01 实施 中国人民共和国国家卫生和计划生育委员会 发布 WS/T 562 2017 I 目次 前言 . II 1 范围 . 1 2 术语和定义 . 1 3 缩略语 . 3 4 诊断原则 . 3 5 诊断依据 . 3 6 鉴别诊断 . 5 附 录 A（规范性附录） 脑脊液 14-3-3 蛋白 Western blot 检测 . 6 附 录 B（

2、规范性附录）脑组织病理学检测 . 7 附 录 C（规范性附录）脑组织 PrPSc的 免疫组织化学检测 . 9 附 录 D（规范性附录）脑组织 PrPSc的 Western blot 检测 . 11 附 录 E（规范性附录） vCJD 患者 扁桃体 PrPSc的 Western blot 检测 . 13 附 录 F（规范性附录） vCJD 患者 扁桃体 PrPSc的 免疫组织化学 检测 . 13 附 录 G（规范性附录） PRNP 基因序列 、 129 位 及 219 位 氨基酸多态性检测 . 15 附 录 H（资料性附录） 遗传或家族型人类朊病毒病 PRNP 基因突变位点 . 19 附 录 I

3、（资料性附录） 克 -雅病的鉴别诊断 . 20 参考文献 . 22 WS/T 562 2017 II 前 言 本标准按照 GB/T1.1 2009 给出的规 则 起草 。 本标准起草单位：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 、北京市友谊医院、广州市中山医院、河南省疾病预防控制中心、北京市疾病预防控制中心 。 本标准主要起草人：董小平、韩俊、陈操、石琦 、 王得新、 高晨 、田婵 、夏胜利、 李洵 桦 、张秀春 。 WS/T 562 2017 1 克 -雅病诊断 1 范围 本标准规定了克 -雅病 和遗传或家族型人类 朊病毒病（包括遗传 或家族 型克 -雅病、 吉斯特曼 -施特劳斯综合征、致死性

4、家族 型 失眠症 ） 的诊断 原则、诊断依据 、 诊断分类 和鉴别诊断 。 本标准适用于 全国 各级各类医疗卫生机构 及其医务人员对 克 -雅病 和遗传或家族型人类 朊病毒病（包括遗传 或家族型克 -雅病、吉斯特曼 -施特劳斯综合征、致死性家族型失眠症 ） 的诊断。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 克- 雅病 Creutzfeldt-Jakob disease 德国科学家 Creutzfeldt H.G.和 Jakob A.M.在 1922 年首先报道 的一 种 罕见的中枢神经系统疾病 ，后被证实为 人类 的 朊病毒病，包括散发型、遗传 或家族型 、 医源型 和变异型 。

5、 其中散发型约占病例总数的 85左右，遗传或家族型约占病例总数的 10 15 左右，医源型约占病例总数的 1 左右 。 2.2 朊病毒病 prion disease 一类由朊病毒引起的人类和动物中枢神经系统的可传播性、退行性疾病 。该 病潜伏期长，病死率为100。 朊 病毒相关疾病、可传播性海绵状脑病也为此类疾病的专有名词。 2.3 朊病毒 prion 朊病毒病的感染因子，又称羊瘙痒因子样或淀粉样朊蛋白（异常朊蛋白）（ scrapie, amyloid-forming isoform of the prion protein， PrPSc）。 目 前认为是一种不含核酸、具有自我复制能力的感染性

6、蛋白粒子，由细胞表面的正常朊蛋白转变而成的异常形式，具有感染性 ，可 抵抗蛋白酶的水解作用 （蛋白酶抗性） ， 也 有 称为朊毒体、朊粒。 2.4 朊蛋白 prion protein 一种正常的细胞蛋白，又称细胞型朊蛋白（ cellular prion protein， PrPC） ，在中枢神经系统 （ 脑和脊髓组织 ） 的神经元细胞以及胶质细胞中表达 ， 在机体其他组织包括外周组织、淋巴组织等 细胞中 也有表达。 WS/T 562 2017 2 2.5 散发型克 -雅病 sporadic Creutzfeldt-Jakob disease 大多数克- 雅病 病例呈散发型，无地理上的聚集性，在

7、病人之间无明显传播现象 ，由于至今没有发现明确的发病原因，故称为散发型克- 雅病 。 此类疾病的发病年龄在 14 岁 92 岁之间，平均 为 65 岁。发病率为 1 2 人 /每百万人 /每年，男女病人的 比例与整个人口的性别比例一致，与社会经济状况无关。 2.6 医源型克- 雅病 iatrogenic Creutzfeldt-Jakob disease 通过朊病毒污染的手术器械、角膜及硬脑膜移植或脑垂体提取物、生长激素及促性腺激素治疗会感染 受体患者，引起医源型克 -雅病 。 2.7 遗传或家族型人类朊病毒病 genetic or familial human prion disease 遗

8、传或家族型人类朊病毒病包括遗传或家族型克 -雅病、吉斯特曼 -斯特劳斯综合征、致死性家族型失眠症 。 发病率约占整个人类朊病毒病病例的 10 15 。 2.8 遗传或家族型克 -雅病 genetic or familialCreutzfeldt-Jakob disease 是一类遗传或家族型人类朊病毒病，为显性特征遗传性疾病。当人类朊蛋白基因出现特定位点的点突变，以及出现特定的八肽重复插入或缺失时，引起此类疾病。此类患者的临床表现与散发型克 -雅病相似，但依据突变位点和类型的不同，其发病年龄、临床病程 、临床辅助检查、实验室检测 和病理变化有所差异 。 2.9 吉斯特曼 -施特劳斯综合征 Ge

9、rstmann-Strussler-Scheinker syndrome 此类患者的朊 蛋白编码基因出现特定的点突变及八肽插入，在临床表现和病理特征上与遗传或家族型克 -雅病明显不同， 临床 表现为渐进性小脑共济失调，神经病理上可见特征性的淀粉样斑块沉积 。 2.10 致死性家族型失眠症 fatal familial insomnia 当人类朊蛋白基因第 129 位密码子为甲硫氨酸纯合子，第 178 位氨基酸由天冬氨酸（ D）突变成天冬酰胺（ N）时，此类 患者 出现严重的睡眠障碍 。 病理上表现为显著的 丘脑神经元丢失和胶质增生，很少或几乎没有海绵状变性 。 2.11 变异型克 -雅病 va

10、riant Creutzfeldt-Jakob disease 1996 年在英国首先发现的克 -雅病新变种，多发生于年轻人，且其临床症状和病理改变均与 散发型克 -雅病 有所不同。 此类病人 的 大脑和小脑出现广泛的空泡样变及 “ 花瓣样 ” 的 异常朊蛋白 斑块沉积。WS/T 562 2017 3 已经证实变异型克 -雅 病与 20 世纪 80 年代中期 在英国和欧洲暴发的牛海绵状脑病相关。 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CJD： 克 -雅病 （ Creutzfeldt-Jakob disease） FFI：致死性家族型失眠症 （ fatal familial insomnia）

11、fCJD：家族型克 -雅病 （ familial CJD） GSS：吉斯特曼 -施特劳斯综合征 （ Gerstmann-Strussler-Scheinker syndrome） gCJD：遗传型克 -雅病 （ genetic CJD） iCJD：医源型克 -雅病 （ iatrogenic CJD） PRNP：朊蛋白基因（ prion protein gene） PrP： 朊蛋白（prion protein ） PrPC： 细胞 型 朊蛋白 （正常朊蛋白） （ cellular prion protein） PrPSc： 羊 瘙痒 因子样 或淀粉样朊蛋白（ 异常朊蛋白 ） （ scrapie,

12、 amyloid-forming isoform of the prion protein） sCJD： 散发型克 -雅病 （ sporadic CJD） TSE：可传播性海绵状脑病（transmissible spongiform encephalopathy ） vCJD： 变异型克 -雅病 （ variant CJD） 4 诊断原则 根据患者的流行病学史、临床症状、临床辅助检 查 、实验室及基因学检测综合判断。诊断结果分为疑似诊断、临床诊断和确诊诊断，其中病例的 确诊诊断依赖于 在患者的 脑组织中检出具有蛋白酶抗性的PrPSc和/ 或出现海绵状变性和 /或具有特定的 PRNP 基因突变。

13、 5 诊断依据 5.1 散发型克 -雅病 5.1.1 病 史 与 流行病学史 病史与流行病学史如下： a) 具有进行性痴呆症状 ； b) 临床病程 2 年 ； c) 常规检测排除 其他疾病 ； d) 无 明确 医源性接触史 。 5.1.2 临床表现 临床表现如下： a) 肌阵挛 ； b) 视觉 障碍 或小脑 共济失调 ； c) 锥体 /锥体外系功能异常 ； d) 无动性缄默 。 WS/T 562 2017 4 5.1.3 临床检 查 特征性的临床检查结果如下： a) 在 病程中脑电图 出现 周期性三相波 ； b) 头颅 MRI 成像可见壳核 /尾状核异常高信号 ，或者弥散加权像显示对称性灰质

14、“ 缎带 (ribbon) 征 ” 。 5.1.4 实验室检测 特征性的实验室检测结果如下： a) 脑脊液 14-3-3 蛋白 检测为 阳性 （见附录 A） ； b) 脑组织 病理学检测 显示 具有典型 /标准的神经病理学改变， 即出现海绵状 变性 （见附录 B） ； c) 脑组织 免疫组织化学 检测存在蛋白酶 抗性 PrPSc的沉积（见附录 C） ； d) 脑组织 Western 印迹法检测存在 蛋白酶 抗性 PrPSc（见附录 D） 。 5.1.5 诊断分类 诊断分类主要包括以下三种： a) 疑似诊断： 符合 5.1.1 加 5.1.2 任意两条； b) 临床诊断：在疑似诊断基础上， 符合

15、 5.1.3 任意一条或 5.1.4 a）； c) 确诊诊断： 在 疑似 诊断基础上， 符合 5.1.4 中 b）、 c）、 d）任意一条。 5.2 医源型克 -雅病 5.2.1 病史 与 主要临床表现 与散发型克- 雅病 相似。 5.2.2 诊断分类 诊断分类仅为 确诊诊断 。 在散发型克 -雅病确诊诊断基础上， 符合以下任意一项： a) 接受由人脑提取的垂体激素治疗的病人出现进行性小脑综合征； b) 确定的暴露危险，例如曾接受过 来自 CJD 病人的硬脑膜移植、角膜移植等手术。 5.3 变异型克 -雅病 5.3.1 病史 与流行病学史 病史与流行病学史如下： a) 进行性神经精神障碍 ；

16、b) 病程 6 个月 ； c) 常规检查不提示存在 有 其 他 疾 病 ； d) 无 明确 医源性接触史 ； e) 排除 遗传 或家族 型 人类朊病毒病 。 5.3.2 临床表现 临床表现如下： a) 早期精神症状（抑郁、焦虑、情感淡漠、退缩、妄想） ； WS/T 562 2017 5 b) 持续性疼痛感（疼痛和 /或感觉异常） ； c) 共济失调 ； d) 肌阵挛、舞蹈症、肌张力障碍 ； e) 痴呆 。 5.3.3 临床检测 特征性的临床检测结果如下： a) 早期 脑电图无典型的三相波 （晚期可能出现三相波）； b) MRI： 弥散加权像 、 液体衰减反转恢复 成像 显示 双侧丘脑枕（后结节

17、） 高信号 。 5.3.4 实验室检测 特征性的实验室检测结果如下： a) 扁桃体 Western 印迹法检测存在蛋白酶抗性 PrPSc（见附录 E） 或 扁桃体免疫组织化学 检测证实具有 PrPSc沉积 （见 附录 F） ； b) 脑组织病理学检测显示， 大脑和小脑广泛的空泡样变（见附录 B） ； c) 脑组织免疫组织化学检测 证实 具有 “ 花瓣样” 的蛋白酶抗性 PrPSc斑块沉积 （见附录 C） ； d) 脑组织 Western 印迹法检测存在蛋白酶抗性 PrPSc（见附录 D） 。 5.3.5 诊断分类 诊断分类包括以下三种： a) 疑似诊断：符合 5.3.1 加 5.3.2 中的任

18、意 4 项加 5.3.3a）； b) 临床诊断：在疑似诊断的基础上符合 5.3.3b） ；或 5.3.1 加 5.3.4 a） ； c) 确诊诊断：在 5.3.1 加 5.3.4 中 b）、 c）、 d）任意一条。 5.4 遗传或家族型 人类朊病毒病 5.4.1 病史 与 流行病学史 在一级亲属中存在遗传或家族型人类朊病毒病确诊病例。 5.4.2 诊断分类 诊断分类包括以下两种： a) 疑似诊断： 在 符合 sCJD 疑似诊断 标准 或 出现进行性神经精神症状 的 基础上，加 5.4.1。 b) 确诊诊断： 在疑似诊断的基础上， 病人 PRNP 基因序列 检测 （见附录 G） 证实 具有特定的

19、 基因突变（ 参 见 附录 H） 。 6 鉴别诊断 克 -雅病的诊断应与 病毒性脑炎、桥本脑病、线粒体脑病、阿尔茨海默病、血管性痴呆、中枢神经系统淋巴瘤及其他脑肿瘤、皮层静脉血栓形成及副肿瘤性亚急性小脑变性 相鉴别（ 参 见附录 I） 。 WS/T 562 2017 6 附 录 A （规范性附录） 脑脊液 14-3-3 蛋白 Western blot 检测 A.1 原理 CJD 病人脑脊液中 14-3-3 蛋白含量往往增高。脑脊液经 SDS-PAGE 电泳、电转后， 14-3-3 蛋白与特异性抗体进行反应，显色后出现 30 KD 左右的蛋白条带。 A.2 实验主要仪器 蛋白电泳和电转装置。 A

20、.3 实验步骤 按如下操作步骤进行： a) 脑脊液中加入 5 上样缓冲液， 100 煮沸 5 min。 b) 常规制备 15分离胶和 5浓缩胶，常规上样，使用浓缩胶 80 V，分离胶 156 V 的电压条件下电泳 2 h。 200 mA 稳流 70 min（湿式）或 60 mA 60 min（半干式）电转移 到硝酸纤维素膜。 c) 转移完毕，膜用 5脱脂奶缓冲液（ 20 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 mmol/L NaCl, 0.05 Tween 20）， 1 1 000 稀释一抗（一抗为 14-3-3 蛋白特异性多克隆抗体），室温振荡孵育 2 h 或 4 孵育过

21、夜。缓冲液洗 3 次，共 30 min。 d) 与辣根过氧化物酶标记的抗兔 IgG 二抗（用缓冲液进行 1 5 000 稀释）37 振荡孵育 1 h。缓冲液洗 3 次，共 30 min。 e) ECL 显色。 A.4 结果判定 阳性对照采用羊脑组织匀浆液，或 14-3-3阳性脑脊液 ；显色后在 30 KD位置出现一条蛋白条带，与阳性对照中蛋白条带泳动位置相同，即可判定为脑脊液中 14-3-3阳性。 WS/T 562 2017 7 附 录 B （规范性附录） 脑组织病理学检测 B.1 中枢神经组织分区采集 中枢神经组织分区采集包括以下五个步骤： a) 除去硬脑膜，称重 。 b) 中枢神经组织经福

22、尔马林固定，固定最佳时间为 10 d 21 d。 c) 脑组织。常规途径及方法切脑、分区取材，分别记录、标记 。 d) 脊髓。切开脊髓硬膜，分别记录、标记颈、胸、腰部脊髓组织块。然后采集脊神经根节 。 e) 标本感染性的清除。 在进一步检测之前，所有的固定组织应在 96 以上的甲酸溶液中浸泡至少 1 h。需要注意的是，由于变性剂相互 作用可产生化学反应，任何事先经过酚处理的组织都不能再进行 96以上甲酸处理，故这些组织仍具有感染性。 B.2 标本脱水、浸蜡 脱水、浸蜡按下列程序进行： 70乙醇 1 h 18 20 80乙醇 1 h 18 20 90乙醇 1 h 18 20 重复两次 无水乙醇

23、2 h 18 20 重复两次 二甲苯 1 h 18 20 重复两次 浸蜡 1 h 58 浸蜡 1.5 h 58 重复两次 B.3 制片 制片主要包括以下四步： a) 组织标本蜡块的修块、切片、制片按常规病理学方法进行； b) 如果组织蜡块未经 96甲酸处理，操作人员应戴金属网状手套防护以免损伤； c) 用于常规病理检测和免疫组织化学检测的脑组织片厚度为 5 m； d) 废弃组织、蜡块、碎片等收集后 134 高压灭菌 1 h 或焚烧。 B.4 HE染色 HE 染色按常规病理学方法进行。 B.5 结果判定 B.5.1 sCJD、 gCJD或 fCJD、 iCJD 在大脑、小脑皮质、皮质下灰质中出现

24、海绵状病变。 WS/T 562 2017 8 B.5.2 vCJD 丘脑后部大量星形胶质细胞增生，神经元丢失，即有大量的 PrPSc沉积的海绵状变性，特别是 在大脑和小脑皮层灰质区 在 淀粉样斑块 周围围绕着一圈海绵状空泡（花瓣样）。 B.5.3 GSS 很少或几乎没有海绵状变性。 B.5.4 FFI 显著的丘脑神经元丢失和胶质增生，很少或几乎没有海绵状变性。 WS/T 562 2017 9 附 录 C （规范性附录） 脑组织 PrPSc的 免疫组织化学检 测 C.1 原理 PrPSc 具有抵抗变性剂、蛋白酶的水解作用，组织切片经高压水解、变性剂或蛋白酶处理破坏 PrPC后，以朊蛋白特异性抗体

25、进行免疫组织化学染色，光学显微镜下观测 PrPSc蛋白沉积。 C.2 主要实验仪器 光学显微镜。 C.3 实验步骤 实验操作按如下顺序进行： a) 组织切片置于 56 烘烤 24 h，常规脱蜡至水； b) 取出后浸入水中 5 min，饱和苦味酸浸泡 15 min，除去福尔马林色素； c) 水洗 3 次，每次 5 min，除去苦味酸； d) 3%过氧化氢 /甲醇封闭 15 min 20 min（阻断内源性过氧化物酶）； e) 水洗 3 次，每次 5 min； f) 高压水解（ 121 ，双蒸水） 10 min，或微波炉（高功率挡，双蒸水） 3 次，每次 5 min； g) 取出后室温冷却； h)

26、 在含量不小于 96%的甲酸中浸泡 5 min 10 min（石蜡包埋前未作甲酸处理的标本）； i) 水洗 3 次（缓慢水滴洗）； j) 4 mol/L 异硫氰酸胍浸泡 2 h（ 4 ）； k) 充分水洗； l) 血清封闭 1 100 稀释的正常羊血清/ 磷酸盐缓冲液（ PBS）封闭 20 min； m) 弃封闭液，加第一抗体（用 1:100 正常羊血清 /PBS 稀释）孵育过夜，朊蛋白特异性单克隆抗体（如 3F4），稀释度为 1:500 1:1 000； n) PBS 洗 3 次，每次 5 min； o) 加第二抗体（用 1:100 正常羊血清 /PBS 稀释）孵育 30 min，辣根过氧化

27、物酶（ HRP）标记的抗兔抗体 1:200 稀释，用于多克隆 抗体检测；或 HRP 标记的抗小鼠抗体 1:200 稀释，用于单克隆抗体检测； p) PBS 洗 3 次，每次 5 min； q) 3,3-二氨基联苯胺（ DAB）显色后，充分水洗； r) 苏木素（轻微）复染； s) 常规脱水、透明、封片。 C.4 结果观察 PrPSc蛋白阳性染色呈褐色，分布可呈散在型、斑块型和混合型，细胞核呈淡蓝色。 WS/T 562 2017 10 C.5 结果判定 C.5.1 sCJD、 iCJD、 gCJD或 fCJD 具有 PrPSc的沉积（斑块型、弥漫性突触型、斑块 /空泡周围型）。 C.5.2 vCJ

28、D 在细胞周围和血管周围 出现 无明确形态的 PrPSc斑块，特别是在小脑。 C.5.3 GSS 可见特征性的淀粉样斑块沉积。 C.5.4 FFI 很少或几乎没有 PrPSc的沉积。 WS/T 562 2017 11 附 录 D （规范性附录） 脑组织 PrPSc的 Western blot检测 D.1 原理 PrPSc蛋白具有抵抗蛋白酶 K 水解且经蛋白酶 K 消化后分子量变小的特点。提取脑组织蛋白，经蛋白酶 K 水解后进行 SDS-PAGE 电泳。蛋白电泳条带电转至硝酸纤维素膜或尼龙膜，与 PrP 特异性单克隆抗体反应。具有蛋白酶抗性的蛋白条带显色后，位置在 17 KD 27 KD。 D.

29、2 主要实验仪器 包括以下几种： a) 组织研磨器； b) 离心机； c) 蛋白电泳/ 电转装置。 D.3 脑组织的提取和处理 脑组织的研磨、提取应在生物安全二级以上实验室中进行。操作人员需穿戴防护工作服、防护口罩、眼睛防护装置、双层手套、防护鞋套等。如果需要振荡器，应使用低功率挡；冰冻脑组织应在生物安全柜内解冻，切取少量组织（100 mg 放入冻存管，称重；具体操作按如下顺序进行 ： a) 按 1 10（ m/V）比例加入适量的提取缓冲液，将组织转移到组织研磨器，制备 10%的脑组织匀浆。研磨器使用后在 2 mol/L NaOH 或 5 NaClO（ 20 000 g/g 游离氯）溶液中浸泡

30、至少 1h。 b) 脑组织匀浆转移到冻存管， 4 ， 2 000 r/min 离心，10 min 。 c) 收集上清液， -20 保存。所有使用的试管、移液器头浸入 2 mol/L NaOH 或 5 NaClO（ 20 000 g/g 游离氯）溶液中浸泡至少 1 h。 D.4 蛋白酶K 水解及电泳、电转 按如下步骤操作： a) 脑组织匀浆中加入终浓度 20 g/mL 的蛋白酶 K， 37 作用 1 h 2 h。 b) 加入等体积的 2 上样缓冲液， 100 煮沸 10 min。 c) 常规制备 15 分离胶和 5 浓缩胶。常规上样，使用浓缩胶 80 V，分离胶 156 V 的电压条件下电泳 2

31、 h。 200 mA 稳流 70 min（湿式）或 60 mA 60 min（半干式）电转移到硝酸纤维素膜。 D.5 蛋白印迹反应 按如下步骤操作： a) 转膜完毕，膜用 5脱脂奶 缓冲液（ 20 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 mmol/L NaCl, 0.05 Tween 20）溶液封闭过夜。 b) 与 1 8 000 稀释的 PrP 特异性单克隆抗体（如 3F4 抗体 ） ，室温振荡孵育 2 h 或 4 孵育过夜。 缓冲液 洗 3 次，共 30 min。 WS/T 562 2017 12 c) 与辣根过氧化物酶标记的抗鼠 IgG 二抗（用 缓冲液进行 1 10

32、 000 稀释）室温振荡孵育 2 h。缓冲液 洗 3 次，共 30 min。 d) 增强型化学发光显色（ ECL）溶液中显色。 D.6 结果判定 阳性对照采用羊瘙痒病毒株 263K 感染仓鼠脑组织提取物，或确诊的 CJD 病人脑组织提取物。阴性对照为正常仓鼠脑组织提取物，或非 CJD 病人脑组织提取物。阳性、阴性对照的处理、蛋白酶 K 水解及蛋白印迹反应按 D.3、 D.4、 D.5 进行。 脑组织提取物经蛋白酶 K 水解后仍在 17 KD 27 KD 位置出现多条（一般为三条）显色蛋白条带，与未经蛋白酶 K 消化的 PrP 蛋白显色条带（一般为三条，电泳迁移位置在 30 KD35 KD 左右

33、）相比，蛋白酶处理的 PrP 显色条带的泳动位置明显 下移。以此可判定脑组织中 PrPSc蛋白呈阳性。 WS/T 562 2017 13 附 录 E （规范性附录） vCJD患者 扁桃体 PrPSc的 Western blot检测 E.1 原理 PrPSc蛋白具有抵抗蛋白酶 K 水解且经蛋白酶 K 消化后分子量变小的特点。提取扁桃体活检组织蛋白，经蛋白酶 K 水解后进行 SDS-PAGE 电泳。蛋白电泳条带电转至硝酸纤维素膜或尼龙膜，与 PrP 特异性单克隆抗体反应。具有蛋白酶抗性的蛋白条带显色后，位置在 17 KD 27 KD。 E.2 主要实验仪器 包括以下几种： a) 组织研磨器； b)

34、 离心机； c) 蛋白电泳/ 电转装置。 E.3 扁桃体活检组织的处理 具体操作按如下顺序进行： a) 按 1 10（ m/V）比例加入适量的提取缓冲液，将扁桃体活检组织转移到组织研磨器，制备 10%的组织匀浆。研磨器使用后在 2 mol/L NaOH 或 5 NaClO（ 20 000 g/g 游离氯）溶液中浸泡至少 1 h。 b) 扁桃体活检组织匀浆转移到冻存管， 4 ， 2 000 r min 离心， 10 min。 c) 收集上清液， -20 保存。所有使用的试管、移液器头浸入 2 mol/L NaOH 或 5 NaClO（ 20 000 g/g 游离氯）溶液中浸泡至少 1 h。 E.

35、4 蛋白酶K 水解及电泳、电转 按如下步骤操作： a) 扁桃体活检组织匀浆中加入终浓度 20 g/mL 的蛋白酶 K， 37 作用 1 h 2 h。 b) 加入等体积的 2 上样缓冲液， 100 煮沸 10 min。 c) 常规制备 15分离胶和 5浓缩胶。常规上样，使用浓缩胶 80 V，分离胶 156 V 的电压条件下电泳 2 h。 200 mA 稳流 70 min（湿式）或 60 mA 60 min（半干式）电转移到硝酸纤维素膜。 E.5 蛋白印迹反应 按如下步骤操作： a) 转膜完毕，硝酸纤维素膜用 5脱脂奶缓冲液 （ 20 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 m

36、mol/L NaCl, 0.05 Tween 20）溶液封闭过夜。 b) 与 1 8 000 稀释的 PrP 特异性单克隆抗体（如 3F4 抗体），室温振荡孵育 2 h 或 4 孵育过夜。缓冲液洗 3 次，共 30 min。 WS/T 562 2017 14 c) 与辣根过氧化物酶标记的抗鼠 IgG 二抗（用缓冲液进行 1 10 000 稀释）室温振荡孵育 2 h。缓冲液洗 3 次，共 30 min。 d) 增强型化学发光显色（ ECL）溶液中显色。 E.6 结果判定 阳性对照采用羊瘙痒病毒株 263K 感染仓鼠脑组织提取物，或确诊的 CJD 病人脑组织提取物。阴性对照为正常仓鼠脑组织提取物，

37、或非 CJD 病人脑组织提 取物。阳性、阴性对照的处理、蛋白酶 K 水解及蛋白印迹反应按 E.3、 E.4、 E.5 进行。 扁桃体活检组织提取物经蛋白酶 K水解后仍在 17 KD 27 KD位置出现多条（一般为三条）显色蛋白条带，与未经蛋白酶 K消化的 PrP蛋白显色条带（一般为三条，电泳迁移位置在 30 KD 35 KD左右）相比，蛋白酶处理的 PrP显色条带的泳动位置明显下移。以此可判定扁桃体活检组织中 PrPSc蛋白呈阳性。 扁桃体活检不 建议 作为常规检查，在脑电图出现典型的三相波形后不应进行。对临床表现与 vCJD相似， 以及 MRI 未出现双侧丘脑枕（后结节）高信号病例的诊断有意

38、义。 WS/T 562 2017 15 附 录 F （规范性附录） vCJD患者扁桃体 PrPSc的 免疫组织化学检测 F.1 原理 PrPSc 具有抵抗变性剂、蛋白酶的水解作用，组织切片经高压水解、变性剂或蛋白酶处理破坏 PrPC后，以朊蛋白特异性抗体进行免疫组织化学染色，光学显微镜下观测 PrPSc蛋白沉积。 F.2 主要实验仪器 光学显微镜。 F.3 实验步骤 实验操作按如下顺序进行： a) 扁桃体 组织切片置于 56 烘烤 24 h，常规脱蜡至水； b) 取出后浸入水中 5 min，饱和苦味酸浸泡 15 min，除去福尔马林色素； c) 水洗 3 次，每次 5 min，除去苦味酸； d

39、) 3%过氧化氢 /甲醇封闭 15 min 20 min（阻断内源性过氧化物酶）； e) 水洗 3 次，每次 5 min； f) 高压水解（ 121 ，双蒸水） 10 min，或微波炉（高功率挡，双蒸水） 3 次，每次 5 min； g) 取出后室温冷却； h) 在含量不小于 96%的甲酸中浸泡 5 min 10 min（石蜡包埋前未作甲酸处理的标本）； i) 水洗 3 次（缓慢水滴洗）； j) 4 mol/L 异硫氰酸胍浸泡 2 h（ 4 ）； k) 充分水洗； l) 血清封闭 1 100 稀释的正常羊血清/ 磷酸盐缓冲液（ PBS）封闭 20 min； m) 弃封闭液，加第一抗体（用 1

40、100 正常羊血清 /PBS 稀释）孵育过夜，朊蛋白特异性单克隆抗体（如 3F4），稀释度为 1 500 1 1 000； n) PBS 洗 3 次，每次 5 min； o) 加第二抗体（用 1 100 正常羊血清 /PBS 稀释）孵育 30 min，辣根过氧化物酶（ HRP）标记的抗兔抗体 1 200 稀释，用于多克隆抗体检测；或 HRP 标记的抗小鼠抗体 1 200 稀释，用于单克隆抗体检测； p) PBS 洗 3 次，每次 5 min； q) 3,3-二氨基联苯胺（ DAB）显色后，充分水洗； r) 苏木素（轻微）复染； s) 常规脱水、透明、封片。 F.4 结果观察 及判定 光镜观察扁

41、桃体活检切片中 PrPSc蛋白阳性染色呈褐色，分布可呈散在型、斑块型和混合型，细胞核呈淡蓝色。 WS/T 562 2017 16 扁桃体活检不建议作为常规检查，在脑电图出现典型的三相波形后不应进行。对临床表现与 vCJD相似，以及 MRI 未出现双侧丘脑枕（后结节）高信号病例的诊断有意义。 WS/T 562 2017 17 附 录 G （规范性附录） PRNP基因序列 、 129位 及 219位氨基酸多态性检测 G.1 血液样品采集 血液样品采集注意事项如下： a) PRNP 基因扩增可以使用全血或白细胞。常用抗凝剂为柠檬酸，也可用其他抗凝剂如 EDTA，肝素会对 PCR 反应起抑制作用。 b

42、) 血液样品储存应为 -70 ，在此条件下 DNA 样品可长期保存。 c) PCR 扩增、血液样品的处理和储存应在不同的实验室（空间）中进行。 G.2 DNA的提取 使用商品化 DNA 提取试剂盒或其他方法提取血液样品 DNA。在整个提取过程中都应注意防止 DNA 污染；同时测定提取 DNA 的浓度。 G.3 PCR G.3.1 PCR反应前注意事项 在整个PCR扩增过程应防止 DNA污染，如试管、加样吸头、手套等。 PCR反应的操作应严格按照四区划分的原则进行试剂分装、核酸提取、PCR扩增和核酸电泳（必要时）。 G.3.2 PCR引物 PRNP基因 PCR上下游引物如下： 上游引物： 5 -

43、GGCAAACCTTGGATGCTGG-3 下游引物： 5 -CCCACTATCAGGAAGATGAGG-3 标准PCR各种成分（ 50L 体积） DNA模板 3 L PCR 底物 25 L PrP 1-253上游引物 1 L PrP 1-253下游引物 1 L 双蒸水 20 L 总体积 50 L G.3.3 标准 PCR循环条件 PRNP基因 PCR扩增条件： 94 5 min （预变性） 94 55 s （变性） 55 55 s （退火） 72 55 s （延伸） 循环次数： 30个。 WS/T 562 2017 18 G.3.4 结果判定 PCR产物长度： 759 bp。 G.4 常规基

44、因序列测定 按常规方法进行基因序列测定。 WS/T 562 2017 19 附 录 H （资料性附录） 遗传 或家族 型 人类 朊病毒病 PRNP基因突变位点 H.1 gCJD或 fCJD D178N-129V、 V180I、 V180I+M232R、 T183A、 T188A、 T188K、 E196K、 E200K、V203I 、 R208H、 V210I、 E211Q、 M232R、 R148H、 4个额外八肽插入、 5个额外八肽插入、 6个额外八肽插入、 7个额外八肽插入及 2个八肽重复缺失。 H.2 GSS P102L、 P105L、 A117V、 G131V、 F198S、 D202N、 Q212P、 Q217R、 M232T及 8个额外八肽插入。 H.3 FFI D178N-129MM。 H.4 未分类的遗传 或家族 型 人类 朊病毒病 密码子点突变： H187R， 216 八肽重复区（ 9个额外八肽）插入。 WS/T 562 20