SN T 2425-2010 进出口食品中霍乱弧菌快速及鉴定监测方法 实时荧光PCR方法 .pdf

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1、书 书 书 中 华 人 民 共 和 国 出 入 境 检 验 检 疫 行 业 标 准 犛 犖 犜 进 出 口 食 品 中 霍 乱 弧 菌 快 速 及 鉴 定 检 测 方 法实 时 荧 光 犘 犆 犚 方 法 犚 犪 狆 犻 犱 犱 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀 狅 犳 犞 犻 犫 狉 犻 狅 犮 犺 狅 犾 犲 狉 犪 犲 犻 狀 犳 狅 狅 犱 狊 犳 狅 狉 犻 犿 狆 狅 狉 狋 犪 狀 犱 犲 狓 狆 狅 狉 狋 犚 犲 犪 犾 狋 犻 犿 犲 狇 狌 犪 狀 狋 犻 狋 犪 狋 犻 狏 犲 犘 犆 犚 犿 犲 狋 犺 狅 犱 发 布 实 施 中 华 人 民 共 和 国 国 家 质 量

2、 监 督 检 验 检 疫 总 局 发 布书 书 书 前言 本 标 准 的 附 录 、 附 录 均 为 规 范 性 附 录 。 本 标 准 由 国 家 认 证 认 可 监 督 管 理 委 员 会 提 出 并 归 口 。 本 标 准 起 草 单 位 ： 中 华 人 民 共 和 国 广 东 出 入 境 检 验 检 疫 局 、 中 山 大 学 达 安 基 因 有 限 公 司 。 本 标 准 主 要 起 草 人 ： 焦 红 、 翁 文 川 、 刘 超 、 易 敏 英 、 许 龙 岩 、 胡 科 锋 、 程 钢 、 王 方 金 。 本 标 准 系 首 次 发 布 的 出 入 境 检 验 检 疫 行 业 标

3、 准 。 犛 犖 犜 进 出 口 食 品 中 霍 乱 弧 菌 快 速 及 鉴 定 检 测 方 法实 时 荧 光 犘 犆 犚 方 法 范 围 本 标 准 规 定 了 进 出 口 食 品 中 霍 乱 弧 菌 的 实 时 荧 光 快 速 检 验 及 鉴 定 方 法 。 本 标 准 适 用 于 进 出 口 食 品 中 霍 乱 弧 菌 群 、 群 、 非 非 群 的 快 速 检 验 ， 以 及 群 、 群 的 快 速 鉴 定 。 规 范 性 引 用 文 件 下 列 文 件 中 的 条 款 通 过 本 标 准 的 引 用 而 成 为 本 标 准 的 条 款 。 凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件 ，

4、其 随 后 所 有 的 修 改 单 （ 不 包 括 勘 误 的 内 容 ） 或 修 订 版 均 不 适 用 于 本 标 准 ， 然 而 ， 鼓 励 根 据 本 标 准 达 成 协 议 的 各 方 研 究 是 否 可 使 用 这 些 文 件 的 最 新 版 本 。 凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 适 用 于 本 标 准 。 霍 乱 诊 断 标 准 及 处 理 原 则 出 口 食 品 中 霍 乱 弧 菌 检 验 方 法 基 因 检 验 实 验 室 技 术 要 求 缩 略 语 下 列 缩 略 语 适 用 于 本 标 准 。 犘 犆 犚 狆 狅 犾 狔 犿 犲 狉

5、犪 狊 犲 犮 犺 犪 犻 狀 狉 犲 犪 犮 狋 犻 狅 狀 聚 合 酶 链 式 反 应 ， 简 称 。 实 时 荧 光 犘 犆 犚 实 时 荧 光 聚 合 酶 链 式 反 应 。 犇 犖 犃 犱 犲 狅 狓 狔 狉 犻 犫 狅 狀 狌 犮 犾 犲 犻 犮 犪 犮 犻 犱 简 称 脱 氧 核 糖 核 酸 。 犱 犖 犜 犘 犱 犲 狅 狓 狔 狉 犻 犫 狅 狀 狌 犮 犾 犲 狅 狊 犻 犱 犲 狋 狉 犻 狆 犺 狅 狊 狆 犺 犪 狋 犲 脱 氧 核 苷 酸 三 磷 酸 。 犱 犃 犜 犘 犱 犲 狅 狓 狔 犪 犱 犲 狀 狅 狊 犻 狀 犲 狋 狉 犻 狆 犺 狅 狊 狆 犺 犪

6、狋 犲 脱 氧 腺 苷 三 磷 酸 。 犱 犆 犜 犘 犱 犲 狅 狓 狔 犮 狔 狋 犻 犱 犻 狀 犲 狋 狉 犻 狆 犺 狅 狊 狆 犺 犪 狋 犲 脱 氧 胞 苷 三 磷 酸 。 犱 犌 犜 犘 犱 犲 狅 狓 狔 犵 狌 犪 狀 狅 狊 犻 狀 犲 狋 狉 犻 狆 犺 狅 狊 犺 狆 犪 狋 犲 脱 氧 鸟 苷 三 磷 酸 。 犛 犖 犜 犱 犜 犜 犘 犱 犲 狅 狓 狔 狋 犺 狔 犿 犻 犱 犻 狀 犲 狋 狉 犻 狆 犺 狅 狊 狆 犺 犪 狋 犲 脱 氧 胸 苷 三 磷 酸 。 犱 犝 犜 犘 犱 犲 狅 狓 狔 狌 狉 犻 犱 犻 狀 犲 狋 狉 犻 狆 犺 狅 狊 狆

7、犺 犪 狋 犲 脱 氧 鸟 苷 三 磷 酸 。 犝 犖 犌 狌 狉 犪 犮 犻 犾 犖 犵 犾 狔 犮 狅 狊 狔 犾 犪 狊 犲 尿 嘧 啶 犖 糖 基 化 酶 。 犜 狉 犻 狊 狋 狉 犻 狊 （ 犺 狔 犱 狉 狅 狓 狔 犿 犲 狋 犺 狔 犾 ） 犪 犿 犻 狀 狅 犿 犲 狋 犺 犪 狀 犲 三 （ 羟 甲 基 ） 氨 基 甲 烷 。 犆 狋 值 每 个 反 应 管 内 的 荧 光 信 号 达 到 设 定 的 阈 值 时 所 经 历 的 循 环 数 。 犜 犪 狇 酶 犜 犪 狇 聚 合 酶 。 测 定 方 法 方 法 提 要 采 用 犜 犪 狇 方 法 ， 在 比 对 霍 乱

8、弧 菌 溶 血 素 基 因 、 编 码 抗 原 的 基 因 的 基 础 上 ， 分 别 设 计 三 对 各 自 仅 在 霍 乱 弧 菌 的 溶 血 素 基 因 、 基 因 间 保 守 的 特 异 性 引 物 和 三 条 特 异 性 的 荧 光 双 标 记 探 针 。 探 针 的 结 合 部 位 均 位 于 目 的 扩 增 片 段 内 部 。 其 中 端 标 记 了 荧 光 素 为 报 告 荧 光 基 团 （ 用 表 示 ） ， 端 标 记 了 荧 光 素 为 淬 灭 荧 光 基 团 （ 用 表 示 ） ， 它 在 近 距 离 内 能 吸 收 端 荧 光 基 团 发 出 的 荧 光 信 号 。

9、反 应 进 入 退 火 阶 段 时 ， 引 物 和 探 针 同 时 与 目 的 基 因 片 段 结 合 ， 此 时 探 针 上 基 团 发 出 的 荧 光 信 号 被 基 团 所 吸 收 ， 仪 器 检 测 不 到 荧 光 信 号 ； 而 反 应 进 行 到 延 伸 阶 段 时 ， 犜 犪 狇 聚 合 酶 发 挥 其 外 切 核 酸 酶 功 能 ， 将 探 针 降 解 。 这 样 探 针 上 的 基 团 游 离 出 来 ， 所 发 出 的 荧 光 不 再 为 所 吸 收 而 被 检 测 所 接 收 。 随 着 反 应 的 循 环 往 复 ， 产 物 呈 指 数 形 式 增 长 ， 荧 光 信

10、号 也 相 应 增 长 ， 实 现 了 荧 光 信 号 的 累 积 与 产 物 形 成 完 全 同 步 。 培 养 基 和 试 剂 碱 性 蛋 白 胨 水 增 菌 液 （ 见 附 录 ） 。 灭 菌 双 蒸 水 。 离 心 管 ： 、 、 。 吸 管 ： 、 ， 分 刻 度 。 成 套 试 剂 盒 配 置 引 物 （ 已 配 成 成 品 ） ， 有 三 种 ， 分 别 为 ： 霍 乱 弧 菌 通 用 型 ， 引 物 上 游 ： 下 游 ： 霍 乱 弧 菌 群 ， 引 物 上 游 ： 下 游 ： 霍 乱 弧 菌 群 ， 引 物 上 游 ： 下 游 ： 犛 犖 犜 探 针 （ 已 配 成 成 品

11、） ， 有 三 种 ， 分 别 为 ： 霍 乱 弧 菌 通 用 型 ， 霍 乱 弧 菌 群 ， 霍 乱 弧 菌 群 ， 探 针 端 由 标 记 ， 端 由 标 记 。 犜 犪 狇 酶 。 ： 、 、 、 。 提 取 试 剂 。 缓 冲 液 ： 盐 酸 （ ） ， 氯 化 钾 ， 氯 化 镁 。 仪 器 和 设 备 全 自 动 荧 光 定 量 仪 （ 或 者 普 通 仪 和 荧 光 检 测 仪 ） 。 离 心 机 ： 。 制 冰 机 。 恒 温 培 养 箱 。 低 温 冰 箱 ； 。 恒 温 水 浴 箱 。 天 平 ： 量 程 ， 感 量 。 均 质 器 。 样 品 稀 释 瓶 ： 、 。 灭

12、菌 样 品 处 理 器 具 ： 取 样 勺 、 剪 刀 、 镊 子 。 可 调 移 液 器 ： 、 、 、 。 步 骤 样 品 的 收 集 和 处 理 称 取 检 样 ， 加 入 装 有 碱 性 蛋 白 胨 水 增 菌 液 （ ） 的 广 口 瓶 内 。 固 体 样 品 应 以 均 质 器 打 碎 ， 或 以 剪 刀 充 分 剪 碎 ， 培 养 和 。 准 备 进 行 模 板 的 提 取 。 若 为 牡 蛎 样 品 ， 应 同 样 制 备 另 一 检 样 ， 置 于 中 ， 培 养 和 。 无 需 增 菌 培 养 ， 直 接 检 测 样 品 处 理 与 上 述 增 菌 培 养 过 程 一 致

13、， 但 无 需 进 行 增 菌 培 养 ， 样 品 与 稀 释 液 混 合 均 匀 后 ， 即 可 进 行 模 板 的 提 取 。 荧 光 定 量 犘 犆 犚 测 定 模 板 犇 犖 犃 的 提 取 从 样 品 增 菌 液 的 表 层 （ 或 样 品 稀 释 液 管 中 ） 取 培 养 液 加 入 到 无 菌 离 心 管 中 ， 离 心 ， 尽 量 弃 去 上 清 液 ， 加 入 灭 菌 的 双 蒸 水 清 洗 次 后 离 心 ， 同 样 尽 量 弃 去 上 清 液 。 加 入 提 取 液 充 分 混 匀 ， 室 温 放 置 后 ， 进 行 沸 水 浴 ， 离 心 ， 将 上 清 液 转 移

14、至 新 管 备 用 （ 不 能 及 时 检 验 ， 则 放 置 于 保 存 ） 。 和 的 样 品 增 菌 液 分 别 提 取 进 行 检 测 。 荧 光 定 量 犘 犆 犚 检 验 检 验 准 备 根 据 需 要 选 择 使 用 ： 霍 乱 弧 菌 通 用 型 、 霍 乱 弧 菌 群 及 霍 乱 弧 菌 群 鉴 定 试 剂 盒 。 扩 增 反 应 总 体 积 为 ： 模 板 ， 引 物 上 、 下 游 各 ， 荧 光 探 针 ， 缓 冲 液 ， ， 犜 犪 狇 聚 合 酶 （ ） ， 用 纯 水 补 足 至 。 检 犛 犖 犜 验 过 程 中 分 别 设 置 阳 性 、 阴 性 对 照 及

15、空 白 对 照 。 以 含 有 扩 增 片 断 的 质 粒 为 阳 性 对 照 ， 以 灭 菌 双 蒸 水 为 阴 性 对 照 （ 均 由 试 剂 盒 配 套 供 给 ） 。 全 自 动 荧 光 定 量 犘 犆 犚 仪 的 使 用 在 荧 光 定 量 仪 上 的 设 定 扩 增 条 件 为 ： ， 预 变 性 ； ， 变 性 ； ， 退 火 及 延 伸 ， 个 循 环 ， 保 存 。 普 通 犘 犆 犚 仪 和 荧 光 检 测 器 的 使 用 使 用 普 通 仪 合 并 荧 光 检 测 器 测 试 分 两 步 进 行 ， 第 一 步 ： 仪 扩 增 反 应 条 件 设 为 ， 预 变 性 ；

16、， 变 性 ； ， 退 火 及 延 伸 ， 个 循 环 ， 暂 停 ， ， 迅 速 逐 个 将 反 应 管 放 入 荧 光 检 测 仪 ， 读 取 并 记 录 读 数 犃 。 第 二 步 ： 仪 扩 增 反 应 条 件 设 为 ， 预 变 性 ； ， 变 性 ； ， 退 火 及 延 伸 ， 个 循 环 ， 暂 停 ， ， 同 样 迅 速 逐 个 将 扩 增 后 的 反 应 管 放 入 荧 光 检 测 仪 ， 读 取 并 记 录 读 数 犃 。 荧 光 激 发 波 长 为 ， 检 测 波 长 为 。 结 果 及 判 断 全 自 动 荧 光 定 量 犘 犆 犚 仪 阈 值 设 定 读 取 检 测

17、结 果 。 阈 值 设 定 原 则 以 阈 值 线 刚 好 超 过 正 常 阴 性 对 照 品 扩 增 曲 线 的 最 高 点 ， 结 果 显 示 阴 性 为 准 。 或 可 根 据 仪 器 噪 音 情 况 进 行 调 整 。 质 控 标 准 阴 性 质 控 品 ： 增 长 的 曲 线 不 呈 型 曲 线 或 值 。 阳 性 质 控 品 ： 增 长 曲 线 呈 型 曲 线 ， 且 强 阳 性 质 控 品 定 量 参 考 值 在 基 因 拷 贝 基 因 拷 贝 范 围 ， 临 界 阳 性 质 控 品 定 量 参 考 值 在 基 因 拷 贝 基 因 拷 贝 范 围 。 阳 性 定 量 参 考 品

18、： 增 长 曲 线 呈 型 曲 线 ， 值 小 于 。 以 上 要 求 需 在 同 一 次 实 验 中 同 时 满 足 ， 否 则 ， 本 次 实 验 无 效 ， 需 重 新 进 行 。 结 果 描 述 及 判 定 阴 性 增 长 的 曲 线 不 呈 型 曲 线 或 值 等 于 ， 表 示 样 品 中 无 霍 乱 弧 菌 。 阳 性 增 长 曲 线 呈 型 曲 线 且 值 小 于 ， 表 示 样 本 中 存 在 有 霍 乱 弧 菌 。 实 验 灰 度 区 若 值 ， 实 验 需 要 重 新 进 行 。 若 重 做 结 果 的 值 小 于 ， 且 增 长 曲 线 呈 型 曲 线 ， 则 判 为

19、阳 性 ； 否 则 增 菌 后 复 检 。 普 通 犘 犆 犚 仪 和 荧 光 检 测 器 计 算 每 个 样 品 荧 光 检 测 器 两 步 结 果 的 差 ： 犃 狓 犃 犃 。 将 阴 性 质 控 品 管 的 犃 狓 称 为 犖 ， 临 界 阳 性 标 准 品 的 犃 狓 值 称 为 犘 ， 强 阳 性 标 准 品 的 犃 狓 称 为 犘 。 实 验 要 求 满 足 ： 阴 性 质 控 品 ， 全 部 阴 性 ； 阳 性 标 准 品 ， 全 部 阳 性 ； 同 时 ， 犘 、 犘 、 犖 应 满 足 犘 犘 犖 ， 则 本 次 实 验 有 效 ； 否 则 ， 实 验 无 效 ， 应 检

20、查 试 剂 、 仪 器 、 反 应 条 件 等 方 面 的 误 差 。 在 实 验 有 效 的 前 提 下 ， 样 品 犃 狓 犖 （ 犘 犖 ） 判 为 阳 性 ； 如 果 犖 （ 犘 犖 ） 犃 狓 犖 （ 犘 犖 ） 则 属 于 实 验 灰 度 区 ， 需 重 复 实 验 一 次 ， 若 重 复 实 验 结 果 犃 狓 值 犖 （ 犘 犖 ） 判 为 阳 性 ， 否 则 判 为 阴 性 ； 如 果 犃 狓 值 犖 （ 犘 犖 ） 判 为 阴 性 。 实 时 荧 光 犘 犆 犚 方 法 检 验 霍 乱 弧 菌 的 灵 敏 度 经 培 养 增 菌 ， 样 品 的 检 测 低 限 为 ： 霍

21、乱 弧 菌 群 荧 光 试 剂 、 霍 乱 弧 菌 群 荧 光 犛 犖 犜 试 剂 、 霍 乱 弧 菌 通 用 型 荧 光 试 剂 均 为 ； 若 不 经 过 增 菌 ， 上 述 三 种 试 剂 的 检 测 低 限 为 。 确 证 检 验 筛 选 出 阳 性 的 样 本 ， 按 和 进 行 确 证 。 结 果 报 告 如 果 霍 乱 弧 菌 通 用 型 检 测 结 果 阳 性 ， 判 断 可 能 为 、 群 、 非 群 、 非 群 中 任 一 种 阳 性 。 继 续 则 进 行 霍 乱 弧 菌 群 、 霍 乱 弧 菌 群 检 测 。 阳 性 结 果 ， 则 可 报 告 霍 乱 弧 菌 群 （

22、或 群 ） 筛 选 结 果 阳 性 ， 如 果 两 个 结 果 均 为 阴 性 ， 则 可 报 告 霍 乱 弧 菌 非 非 群 结 果 阳 性 。 本 标 准 的 检 验 程 序 见 附 录 。 防 止 污 染 和 废 弃 物 处 理 的 措 施 检 验 过 程 中 防 止 交 叉 污 染 的 措 施 按 照 的 规 定 执 行 。 检 验 过 程 中 的 废 弃 物 ， 收 集 后 在 焚 烧 炉 中 焚 烧 处 理 。 犛 犖 犜 附录犃 （ 规 范 性 附 录 ） 培 养 基 和 试 剂碱 性 蛋 白 胨 水 （ ） 蛋 白 胨 氯 化 钠 蒸 馏 水 混 匀 后 ， 调 节 值 至 （

23、 ） ， 分 装 于 广 口 瓶 中 ， 高 压 灭 菌 。 犛 犖 犜 附录犅 （ 规 范 性 附 录 ） 荧 光 犘 犆 犚 检 验 方 法 程 序 犛 犖 犜 书 书 书 犜 犖 犛 中 华 人 民 共 和 国 出 入 境 检 验 检 疫 行业标准 进 出 口 食 品 中 霍 乱 弧 菌 快 速 及 鉴 定 检 测 方 法实 时 荧 光 犘 犆 犚 方 法 中 国 标 准 出 版 社 出 版 北 京 复 兴 门 外 三 里 河 北 街 号 邮 政 编 码 ： 网 址 电 话 ： 中 国 标 准 出 版 社 秦 皇 岛 印 刷 厂 印 刷 开 本 印 张 字 数 千 字 年 月 第 一 版 年 月 第 一 次 印 刷 印 数 书 号 ： 定 价 元