SN T 2424-2010 进出口食品中副溶血性弧菌快速及鉴定检测方法 实时荧光PCR方法 .pdf

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1、书 书 书 中 华 人 民 共 和 国 出 入 境 检 验 检 疫 行 业 标 准 犛 犖 犜 进 出 口 食 品 中 副 溶 血 性 弧 菌 快 速 及 鉴 定 检 测 方 法实 时 荧 光 犘 犆 犚 方 法 犚 犪 狆 犻 犱 犱 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀 狅 犳 犞 犻 犫 狉 犻 狅 犘 犪 狉 犪 犺 犪 犲 犿 狅 犾 狔 狋 犻 犮 狌 狊 犻 狀 犳 狅 狅 犱 狊 犳 狅 狉 犻 犿 狆 狅 狉 狋 犪 狀 犱 犲 狓 狆 狅 狉 狋 犚 犲 犪 犾 狋 犻 犿 犲 狇 狌 犪 狀 狋 犻 狋 犪 狋 犻 狏 犲 犘 犆 犚 犿 犲 狋 犺 狅 犱 发 布 实 施 中

2、 华 人 民 共 和 国 国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局 发 布书 书 书 中 华 人 民 共 和 国 出 入 境 检 验 检 疫 行业标准 进 出 口 食 品 中 副 溶 血 性 弧 菌 快 速 及 鉴 定 检 测 方 法实 时 荧 光 犘 犆 犚 方 法 中 国 标 准 出 版 社 出 版 北 京 复 兴 门 外 三 里 河 北 街 号 邮 政 编 码 ： 网 址 电 话 ： 中 国 标 准 出 版 社 秦 皇 岛 印 刷 厂 印 刷 开 本 印 张 字 数 千 字 年 月 第 一 版 年 月 第 一 次 印 刷 印 数 书 号 ： 定 价 元书 书 书 前言 本 标 准

3、的 附 录 和 附 录 均 为 规 范 性 附 录 。 本 标 准 由 国 家 认 证 认 可 监 督 管 理 委 员 会 提 出 并 归 口 。 本 标 准 起 草 单 位 ： 中 华 人 民 共 和 国 广 东 出 入 境 检 验 检 疫 局 、 中 山 大 学 达 安 基 因 股 份 有 限 公 司 。 本 标 准 主 要 起 草 人 ： 翁 文 川 、 刘 超 、 许 龙 岩 、 易 敏 英 、 胡 科 锋 、 焦 红 、 王 方 金 、 程 钢 。 本 标 准 系 首 次 发 布 的 出 入 境 检 验 检 疫 行 业 标 准 。 犛 犖 犜 进 出 口 食 品 中 副 溶 血 性

4、弧 菌 快 速 及 鉴 定 检 测 方 法实 时 荧 光 犘 犆 犚 方 法 范 围 本 标 准 规 定 了 进 出 口 食 品 中 副 溶 血 性 弧 菌 的 实 时 荧 光 快 速 检 验 方 法 。 本 标 准 适 用 于 进 出 口 食 品 中 副 溶 血 性 弧 菌 的 快 速 检 验 。 规 范 性 引 用 文 件 下 列 文 件 中 的 条 款 通 过 本 标 准 的 引 用 而 成 为 本 标 准 的 条 款 。 凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 随 后 所 有 的 修 改 单 （ 不 包 括 勘 误 的 内 容 ） 或 修 订 版 均 不 适 用 于 本 标 准

5、 ， 然 而 ， 鼓 励 根 据 本 标 准 达 成 协 议 的 各 方 研 究 是 否 可 使 用 这 些 文 件 的 最 新 版 本 。 凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 适 用 于 本 标 准 。 食 品 卫 生 微 生 物 学 检 验总 则 食 品 卫 生 微 生 物 学 检 验副 溶 血 性 弧 菌 检 验 出 口 食 品 副 溶 血 性 弧 菌 检 验 方 法 基 因 检 验 实 验 室 技 术 要 求 缩 略 语 下 列 缩 略 语 适 用 于 本 标 准 。 实 时 荧 光 定 量 犘 犆 犚 实 时 荧 光 聚 合 酶 链 式 反 应 。 犆

6、 狋 值 每 个 反 应 管 内 的 荧 光 信 号 达 到 设 定 的 阈 值 时 所 经 历 的 循 环 数 。 犇 犖 犃 犱 犲 狅 狓 狔 狉 犻 犫 狅 狀 狌 犮 犾 犲 犻 犮 犪 犮 犻 犱 简 称 脱 氧 核 糖 核 酸 。 犱 犖 犜 犘 犱 犲 狅 狓 狔 狉 犻 犫 狅 狀 狌 犮 犾 犲 狅 狊 犻 犱 犲 狋 狉 犻 狆 犺 狅 狊 狆 犺 犪 狋 犲 脱 氧 核 苷 三 磷 酸 。 犱 犃 犜 犘 犱 犲 狅 狓 狔 犪 犱 犲 狀 狅 狊 犻 狀 犲 狋 狉 犻 狆 犺 狅 狊 狆 犺 犪 狋 犲 脱 氧 腺 苷 三 磷 酸 。 犱 犆 犜 犘 犱 犲 狅 狓

7、 狔 犮 狔 狋 犻 犱 犻 狀 犲 狋 狉 犻 狆 犺 狅 狊 狆 犺 犪 狋 犲 脱 氧 胞 苷 三 磷 酸 。 犱 犌 犜 犘 犱 犲 狅 狓 狔 犵 狌 犪 狀 狅 狊 犻 狀 犲 狋 狉 犻 狆 犺 狅 狊 犺 狆 犪 狋 犲 脱 氧 鸟 苷 三 磷 酸 。 犛 犖 犜 犱 犜 犜 犘 犱 犲 狅 狓 狔 狋 犺 狔 犿 犻 犱 犻 狀 犲 狋 狉 犻 狆 犺 狅 狊 狆 犺 犪 狋 犲 脱 氧 胸 苷 三 磷 酸 。 犱 犝 犜 犘 犱 犲 狅 狓 狔 狌 狉 犻 犱 犻 狀 犲 狋 狉 犻 狆 犺 狅 狊 狆 犺 犪 狋 犲 脱 氧 尿 苷 三 磷 酸 。 犘 犆 犚 狆 狅 犾

8、 狔 犿 犲 狉 犪 狊 犲 犮 犺 犪 犻 狀 狉 犲 犪 犮 狋 犻 狅 狀 聚 合 酶 链 式 反 应 ， 简 称 。 犜 狉 犻 狊 狋 狉 犻 狊 犺 狔 犱 狉 狅 狓 狔 犿 犲 狋 犺 狔 犾 犪 犿 犻 狀 狅 犿 犲 狋 犺 犪 狀 犲 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 。 犝 犖 犌 狌 狉 犪 犮 犻 犾 犖 犵 犾 狔 犮 狅 狊 狔 犾 犪 狊 犲 尿 嘧 啶 犖 糖 基 化 酶 。 犜 犪 狇 酶 犜 犪 狇 聚 合 酶 。 犘 犅 犛 磷 酸 盐 缓 冲 生 理 盐 水 。 测 试 方 法 方 法 原 理 采 用 犜 犪 狇 方 法 ， 在 比 对 副 溶 血 性

9、 弧 菌 基 因 的 基 础 上 ， 设 计 针 对 该 基 因 的 特 异 性 引 物 和 特 异 性 的 荧 光 双 标 记 探 针 进 行 配 对 。 探 针 端 标 记 了 荧 光 素 为 报 告 荧 光 基 团 （ 用 表 示 ） ， 端 标 记 了 荧 光 素 为 淬 灭 荧 光 基 团 （ 用 表 示 ） ， 它 在 近 距 离 内 能 吸 收 端 荧 光 基 团 发 出 的 荧 光 信 号 。 反 应 进 入 退 火 阶 段 时 ， 引 物 和 探 针 同 时 与 目 的 基 因 片 段 结 合 ， 此 时 探 针 上 基 团 发 出 的 荧 光 信 号 被 基 团 所 吸 收

10、 ， 仪 器 检 测 不 到 荧 光 信 号 ； 而 反 应 进 行 到 延 伸 阶 段 时 ， 犜 犪 狇 聚 合 酶 发 挥 其 外 切 核 酸 酶 功 能 ， 将 探 针 降 解 。 这 样 探 针 上 的 基 团 游 离 出 来 ， 所 发 出 的 荧 光 不 再 为 所 吸 收 而 被 检 测 所 接 收 。 随 着 反 应 的 循 环 进 行 ， 产 物 与 荧 光 信 号 的 增 长 呈 现 对 应 关 系 。 培 养 基 和 试 剂 氯 化 钠 稀 释 液 （ 见 附 录 ） 。 氯 化 钠 蛋 白 胨 液 （ 见 附 录 ） 。 单 料 氯 化 钠 多 粘 菌 素 肉 汤 （

11、 见 附 录 ） 。 灭 菌 双 蒸 水 。 离 心 管 ： 、 、 、 。 吸 管 ： 、 ， 分 刻 度 。 成 套 试 剂 盒 配 置 试 剂 盒 引 物 ： 上 游 ： 下 游 ： 犛 犖 犜 试 剂 盒 探 针 ： 犜 犪 狇 探 针 ： 探 针 端 由 标 记 ， 端 由 标 记 。 提 取 试 剂 （ 已 配 成 成 品 ） 。 缓 冲 液 ： 盐 酸 （ ） ， 氯 化 钾 ， 氯 化 镁 。 仪 器 和 设 备 全 自 动 荧 光 定 量 仪 。 普 通 仪 。 微 量 荧 光 检 测 仪 ： 上 海 棱 光 （ 或 同 类 型 产 品 ） 。 离 心 机 ： 最 大 转 速

12、 以 上 。 恒 温 培 养 箱 ： 。 天 平 ： 量 程 ， 感 量 。 低 温 冰 箱 ： 。 均 质 器 。 制 冰 机 。 恒 温 水 浴 箱 ： 。 灭 菌 样 品 处 理 器 具 ： 取 样 勺 、 剪 刀 、 镊 子 。 样 品 稀 释 瓶 ： 、 。 可 调 移 液 器 ： 、 、 、 。 操 作 步 骤 样 品 的 收 集 和 处 理 取 样 样 品 按 方 法 收 样 ， 无 菌 操 作 均 匀 取 样 。 如 为 冷 冻 样 品 ， 应 于 解 冻 ， 且 不 超 过 ； 若 不 能 及 时 检 验 ， 应 置 于 保 存 。 非 冷 冻 的 易 腐 样 品 应 尽 可

13、 能 及 时 检 验 ， 若 不 能 及 时 检 验 ， 应 置 于 冰 箱 保 存 ， 在 内 检 验 。 无 菌 操 作 称 取 检 样 放 于 均 质 杯 内 ， 以 灭 菌 剪 刀 充 分 剪 碎 。 增 菌 检 测 样 品 处 理 新 鲜 样 品 ： 上 述 均 质 杯 内 加 入 氯 化 钠 稀 释 液 ， 均 质 混 匀 ； 取 样 品 稀 释 液 接 种 到 单 料 氯 化 钠 多 粘 菌 素 肉 汤 ， 进 行 选 择 性 增 菌 培 养 。 经 加 热 、 辐 射 处 理 或 冷 藏 、 冻 结 的 样 品 ： 在 均 质 杯 内 加 入 氯 化 钠 蛋 白 胨 液 ， 均

14、 质 混 匀 ； 于 增 菌 培 养 。 无 需 增 菌 直 接 检 测 样 品 处 理 在 均 质 杯 内 加 入 氯 化 钠 稀 释 液 ， 混 合 均 匀 后 ， 直 接 进 行 模 板 的 提 取 。 模 板 犇 犖 犃 的 提 取 从 样 品 增 菌 液 的 表 层 （ 或 样 品 稀 释 液 管 中 ） 取 培 养 液 加 入 到 无 菌 离 心 管 中 ， 离 心 ， 尽 量 弃 去 上 清 液 ， 加 入 灭 菌 的 双 蒸 水 清 洗 次 后 离 心 ， 同 样 尽 量 弃 去 上 清 液 。 加 入 提 取 液 充 分 混 匀 ， 室 温 放 置 后 ， 进 行 沸 水 浴

15、 ， 离 心 ， 将 上 清 液 转 移 至 新 管 备 用 （ 提 取 的 应 在 内 进 行 扩 增 或 放 置 于 冰 箱 ） 。 荧 光 定 量 犘 犆 犚 检 验 检 验 准 备 从 试 剂 盒 中 取 出 反 应 管 ， 加 入 提 取 好 的 模 板 。 每 次 检 验 分 别 设 置 含 有 扩 增 片 断 的 质 粒 为 阳 性 对 照 ， 灭 菌 双 蒸 水 为 阴 性 对 照 ， 以 及 临 界 阳 性 对 照 。 犛 犖 犜 全 自 动 荧 光 定 量 犘 犆 犚 仪 测 试 全 自 动 荧 光 定 量 仪 扩 增 反 应 参 数 设 置 ： 第 一 阶 段 ， 预 变

16、 性 ， ； 第 二 阶 段 ， ， ， 个 循 环 ； 第 三 阶 段 ， ， ， 个 循 环 ， 荧 光 收 集 设 置 在 第 三 阶 段 每 次 循 环 的 退 火 延 伸 时 进 行 。 荧 光 通 道 选 择 。 普 通 犘 犆 犚 仪 合 并 微 量 荧 光 检 测 器 测 试 第 一 步 ： 仪 扩 增 反 应 条 件 设 为 预 变 性 ； 变 性 ； 退 火 及 延 伸 ， 个 循 环 ； 暂 停 ， 保 温 ， 迅 速 逐 个 将 反 应 管 放 入 荧 光 检 测 仪 ， 读 取 并 记 录 读 数 犃 （ 初 始 荧 光 值 ） 。 第 二 步 ： 仪 扩 增 反 应

17、 条 件 设 为 预 变 性 ； 变 性 ； 退 火 及 延 伸 ， 个 循 环 ； 暂 停 ， 保 温 ， 同 样 迅 速 逐 个 将 扩 增 后 的 反 应 管 放 入 荧 光 检 测 仪 ， 读 取 并 记 录 读 数 犃 （ 终 止 荧 光 值 ） 。 荧 光 检 测 器 设 定 ： 荧 光 激 发 波 长 为 ， 检 测 波 长 为 。 结 果 及 判 断 全 自 动 荧 光 定 量 犘 犆 犚 仪 结 果 判 断 阈 值 设 定 直 接 读 取 检 测 结 果 。 阈 值 设 定 原 则 根 据 仪 器 噪 音 情 况 进 行 调 整 ， 以 阈 值 线 刚 好 超 过 正 常 阴

18、 性 样 品 扩 增 曲 线 的 最 高 点 为 准 。 质 控 标 准 阴 性 质 控 品 ： 扩 增 曲 线 不 呈 型 曲 线 或 者 值 。 阳 性 质 控 品 ： 扩 增 曲 线 呈 型 曲 线 ， 强 阳 性 质 控 品 定 量 参 考 值 在 基 因 拷 贝 基 因 拷 贝 范 围 ； 临 界 阳 性 质 控 品 定 量 参 考 值 在 基 因 拷 贝 基 因 拷 贝 范 围 。 以 上 要 求 需 在 同 一 次 实 验 中 同 时 满 足 ， 否 则 ， 本 次 实 验 无 效 ， 需 重 新 进 行 。 结 果 描 述 及 判 定 阴 性 扩 增 曲 线 不 呈 型 曲 线

19、 或 值 等 于 ， 表 示 样 品 中 无 副 溶 血 性 弧 菌 ， 或 者 样 品 中 副 溶 血 性 弧 菌 低 于 检 测 低 限 。 阳 性 扩 增 曲 线 呈 型 曲 线 且 值 小 于 等 于 ， 表 示 样 品 中 存 在 副 溶 血 性 弧 菌 。 实 验 灰 度 区 若 值 ， 实 验 需 要 重 新 进 行 。 若 重 做 结 果 的 值 小 于 ， 且 扩 增 曲 线 呈 型 曲 线 ， 则 判 为 阳 性 ； 否 则 增 菌 后 复 检 。 普 通 犘 犆 犚 仪 和 荧 光 检 测 器 结 果 判 断 计 算 每 个 样 品 荧 光 检 测 器 两 步 结 果 的

20、 差 ： 犃 狓 犃 犃 。 将 阴 性 质 控 品 管 的 犃 狓 称 为 犖 ， 临 界 阳 性 标 准 品 的 犃 狓 值 称 为 犘 ， 强 阳 性 标 准 品 的 犃 狓 称 为 犘 。 如 ： 阴 性 质 控 品 为 阴 性 ； 阳 性 标 准 品 为 阳 性 ； 同 时 犘 、 犘 、 犖 应 满 足 犘 犘 犖 时 ， 本 次 实 验 有 效 ； 否 则 ， 实 验 无 效 ， 应 检 查 试 剂 、 仪 器 、 反 应 条 件 等 方 面 的 误 差 。 实 验 有 效 的 前 提 下 ， 样 品 犃 狓 犖 （ 犘 犖 ） 判 为 阳 性 ； 如 果 犖 （ 犘 犖 ） 犃

21、 狓 犖 （ 犘 犖 ） 则 属 于 实 验 灰 度 区 ， 需 重 复 实 验 一 次 ， 若 重 复 实 验 结 果 犃 狓 值 犖 （ 犘 犖 ） 判 为 阳 性 ， 否 则 判 为 阴 性 ； 如 果 犃 狓 值 犖 （ 犘 犖 ） 判 为 阴 性 。 犛 犖 犜 确 证 检 验 筛 选 出 阳 性 的 样 本 ， 按 和 进 行 确 证 。 计 数 副 溶 性 弧 菌 的 计 数 按 进 行 。 方 法 灵 敏 度 经 培 养 增 菌 ， 样 品 的 检 测 限 为 ； 若 不 经 过 增 菌 ， 样 品 的 检 测 限 是 。 检 验 程 序 见 附 录 。 防 止 污 染 和 废

22、 弃 物 处 理 的 措 施 检 验 过 程 中 防 止 交 叉 污 染 的 措 施 按 照 的 规 定 执 行 。 检 验 过 程 中 的 废 弃 物 ， 收 集 后 在 焚 烧 炉 中 焚 烧 处 理 。 犛 犖 犜 附录犃 （ 规 范 性 附 录 ） 培 养 基 和 试 剂 犃 犵 犔 氯 化 钠 稀 释 液 氯 化 钠 蒸 馏 水 加 热 溶 解 ， 调 至 ， 高 压 灭 菌 ， 以 无 菌 操 作 分 装 于 广 口 瓶 或 三 角 瓶 ， 每 瓶 。 犃 犵 犔 氯 化 钠 蛋 白 胨 水 （ 犘 犠 ） 蛋 白 胨 氯 化 钠 蒸 馏 水 将 各 成 分 加 热 溶 解 ， 调

23、 至 ， 无 菌 操 作 分 装 于 广 口 瓶 或 三 角 瓶 ， 每 瓶 。 犃 氯 化 钠 多 粘 菌 素 犅 肉 汤 （ 犛 犘 犅 ） 酵 母 浸 膏 蛋 白 胨 氯 化 钠 多 粘 菌 素 单 位 培 养 基 蒸 馏 水 将 各 成 分 （ 除 多 粘 菌 素 外 ） 加 热 溶 解 ， 校 正 ， 于 高 压 灭 菌 ， 待 冷 至 时 加 入 多 粘 菌 素 （ 配 成 水 溶 液 ） 混 匀 ， 分 装 于 灭 菌 的 试 管 ， 每 管 。 犃 试 剂 盒 组 成 试 剂 盒 组 成 见 表 。 表 犃 试 剂 盒 组 成 组分名称 规格 数量 提 取 液 管 反 应 管

24、（ 或 用 于 的 反 应 盖 ） 人 份 管 临 界 阳 性 质 控 品 管 强 阳 性 质 控 品 管 阳 性 定 量 参 考 品 （ 基 因 拷 贝 ） 管 阳 性 定 量 参 考 品 （ 基 因 拷 贝 ） 管 阳 性 定 量 参 考 品 （ 基 因 拷 贝 ） 管 阳 性 定 量 参 考 品 （ 基 因 拷 贝 ） 管 阴 性 质 控 品 管 犛 犖 犜 说 明 ： 犇 犖 犃 提 取 液 的 主 要 成 分 为 异 硫 氰 酸 胍 和 氢 氧 化 钠 ， 于 保 存 。 犘 犆 犚 反 应 管 中 含 有 特 异 性 引 物 、 探 针 及 各 种 离 子 。 使 用 时 的 注 意 事 项 ： 由 于 阳 性 样 品 中 模 板 浓 度 相 对 较 高 ， 检 测 过 程 中 不 得 交 叉 污 染 。 反 应 液 分 装 时 应 尽 量 避 免 产 生 气 泡 ， 上 机 前 注 意 检 查 各 反 应 管 是 否 盖 紧 ， 以 免 荧 光 物 质 泄 露 污 染 仪 器 。 除 提 取 液 外 ， 其 他 试 剂 保 存 。 有 效 期 为 个 月 。 犛 犖 犜 书 书 书 犛 犖 犜 附录犅 （ 规 范 性 附 录 ） 荧 光 犘 犆 犚 检 验 方 法 程 序 图 犅 荧 光 犘 犆 犚 检 验 方 法 程 序 犜 犖 犛 书 号 ： 定 价 ： 元