SN T 2416-2010 进出口食品中金黄色葡萄球菌肠毒素A检测方法 电泳和免疫印迹法 .pdf

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1、书 书 书 中 华 人 民 共 和 国 出 入 境 检 验 检 疫 行 业 标 准 犛 犖 犜 进 出 口 食 品 中 金 黄 色 葡 萄 球 菌 肠 毒 素 犃 检 测 方 法电 泳 和 免 疫 印 迹 法 犇 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀 犿 犲 狋 犺 狅 犱 狅 犳 狊 狋 犪 狆 犺 狔 犾 狅 犮 狅 犮 犮 犪 犾 犲 狀 狋 犲 狉 狅 狋 狅 狓 犻 狀 犃 犻 狀 犳 狅 狅 犱 犈 犾 犲 犮 狋 狉 狅 狆 犺 狅 狉 犲 狋 犻 犮 犪 狀 犱 犻 犿 犿 狌 狀 狅 犫 犾 狅 狋 犿 犲 狋 犺 狅 犱 发 布 实 施 中 华 人 民 共 和 国 国 家 质 量

2、 监 督 检 验 检 疫 总 局 发 布书 书 书 前言 本 标 准 参 考 了 美 国 第 章 食 品 中 金 黄 色 葡 萄 球 菌 肠 毒 素 电 泳 和 免 疫 印 迹 方 法 （ ： ） 。 本 标 准 的 附 录 为 规 范 性 附 录 。 本 标 准 由 国 家 认 证 认 可 监 督 管 理 委 员 会 提 出 并 归 口 。 本 标 准 起 草 单 位 ： 中 华 人 民 共 和 国 珠 海 出 入 境 检 验 检 疫 局 、 中 华 人 民 共 和 国 福 建 出 入 境 检 验 检 疫 局 、 中 华 人 民 共 和 国 广 东 出 入 境 检 验 检 疫 局 。 本 标

3、 准 主 要 起 草 人 ： 冯 家 望 、 李 丹 琳 、 王 小 玉 、 唐 食 明 、 郑 晶 、 伍 朝 辉 、 游 淑 珠 、 陈 彬 。 本 标 准 系 首 次 发 布 的 出 入 境 检 验 检 疫 行 业 标 准 。 犛 犖 犜 进 出 口 食 品 中 金 黄 色 葡 萄 球 菌 肠 毒 素 犃 检 测 方 法电 泳 和 免 疫 印 迹 法 范 围 本 标 准 规 定 了 进 出 口 食 品 中 金 黄 色 葡 萄 球 菌 肠 毒 素 的 电 泳 和 免 疫 印 迹 检 测 方 法 。 本 标 准 适 用 于 进 出 口 食 品 中 金 黄 色 葡 萄 球 菌 肠 毒 素 的

4、检 测 。 规 范 性 引 用 文 件 下 列 文 件 中 的 条 款 通 过 本 标 准 的 引 用 而 成 为 本 标 准 的 条 款 。 凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 随 后 所 有 的 修 改 单 （ 不 包 括 勘 误 的 内 容 ） 或 修 订 版 均 不 适 用 于 本 标 准 ， 然 而 ， 鼓 励 根 据 本 标 准 达 成 协 议 的 各 方 研 究 是 否 可 使 用 这 些 文 件 的 最 新 版 本 。 凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 适 用 于 本 标 准 。 食 品 卫 生 微 生 物 学 检 验金 黄 色 葡

5、 萄 球 菌 检 验 实 验 室生 物 安 全 通 用 要 求 术 语 和 定 义 下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 标 准 。 金 黄 色 葡 萄 球 菌 肠 毒 素 犃 狊 狋 犪 狆 犺 狔 犾 狅 犮 狅 犮 犮 犪 犾 犲 狀 狋 犲 狉 狅 狋 狅 狓 犻 狀 犃 ； 犛 犈 犃 由 金 黄 色 葡 萄 球 菌 产 生 的 蛋 白 质 外 毒 素 ， 是 其 中 一 种 主 要 血 清 型 。 免 疫 印 迹 法犻 犿 犿 狌 狀 狅 犫 犾 狅 狋 将 蛋 白 质 转 移 到 固 相 载 体 上 ， 利 用 抗 体 与 附 着 于 固 相 载 体 的 靶 蛋 白 所 呈

6、 现 的 抗 原 表 位 发 生 特 异 性 反 应 进 行 检 测 。 原 理 （ 十 二 烷 基 磺 酸 钠 ） 与 蛋 白 质 分 子 结 合 形 成 带 负 电 荷 的 蛋 白 质 复 合 物 。 在 电 场 的 作 用 下 ， 蛋 白 质 复 合 物 向 带 有 异 相 电 荷 的 电 极 移 动 。 根 据 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 分 子 筛 效 应 ， 复 合 物 迁 移 的 速 度 与 其 分 子 量 成 负 相 关 。 将 电 泳 分 离 的 组 分 转 移 并 固 定 在 化 学 合 成 膜 等 固 相 载 体 后 ， 以 特 定 的 免 疫 反 应 以 及 显 色 系

7、 统 分 析 印 迹 。 实 验 室 生 物 安 全 要 求 实 验 室 应 按 照 对 生 物 安 全 级 （ ） 实 验 室 的 生 物 安 全 要 求 执 行 。 当 进 行 可 能 产 生 气 溶 胶 或 液 体 溅 出 的 操 作 时 ， 或 者 可 能 产 生 大 量 毒 素 的 实 验 时 ， 除 外 ， 应 同 时 按 照 对 安 全 设 备 和 个 体 防 护 的 要 求 执 行 。 使 用 过 的 实 验 用 品 应 按 照 对 废 弃 物 进 行 无 害 化 处 理 。 设 备 和 材 料 垂 直 凝 胶 系 统 。 犛 犖 犜 转 移 系 统 。 电 泳 仪 ： 恒 压

8、 不 低 于 ， 恒 流 不 低 于 。 推 荐 使 用 带 有 计 时 器 的 电 源 。 离 心 机 ： 适 用 离 心 管 ， 转 速 不 低 于 。 均 质 器 。 硝 酸 纤 维 膜 。 涡 旋 振 荡 器 。 扫 描 仪 ： 推 荐 辨 析 率 不 低 于 。 离 心 管 ： 。 试 剂 标 准 物 质 （ ） ） 。 ） 标 准 物 质 是 适 合 的 市 售 产 品 的 实 例 ， 给 出 这 一 信 息 是 为 了 方 便 本 标 准 的 使 用 者 ， 并 不 表 示 对 该 产 品 的 认 可 ， 如 果 其 他 等 效 产 品 具 有 相 同 的 效 果 ， 则 可 使

9、 用 这 些 等 效 产 品 。 ）抗 血 清 是 适 合 的 市 售 产 品 的 实 例 ， 给 出 这 一 信 息 是 为 了 方 便 本 标 准 的 使 用 者 ， 并 不 表 示 对 该 产 品 的 认 可 ， 如 果 其 他 等 效 产 品 具 有 相 同 的 效 果 ， 则 可 使 用 这 些 等 效 产 品 。 ）抗 血 清 碱 性 磷 酸 酶 是 适 合 的 市 售 产 品 的 实 例 ， 给 出 这 一 信 息 是 为 了 方 便 本 标 准 的 使 用 者 ， 并 不 表 示 对 该 产 品 的 认 可 ， 如 果 其 他 等 效 产 品 具 有 相 同 的 效 果 ， 则

10、 可 使 用 这 些 等 效 产 品 。 抗 血 清 （ ） ） 。 抗 血 清 碱 性 磷 酸 酶 （ ） ） 。 ： 。 对 甲 苯 胺 蓝 氯 化 硝 基 四 氮 唑 蓝 。 四 甲 基 二 乙 胺 。 甲 醇 ： 分 析 纯 。 异 丁 醇 ： 分 析 纯 。 吐 温 。 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 贮 液 （ 见 附 录 第 章 ） 。 （ 质 量 浓 度 ） 过 硫 酸 铵 ： 铝 膜 覆 盖 放 置 周 后 使 用 。 （ 质 量 浓 度 ） 十 二 烷 基 磺 酸 钠 。 缓 冲 液 （ 见 附 录 第 章 ） 。 缓 冲 液 （ 见 附 录 第 章 ） 。 电 泳 缓 冲 液

11、 （ 见 附 录 第 章 ） 。 点 样 缓 冲 液 （ 见 附 录 第 章 ） 。 转 移 缓 冲 液 （ 见 附 录 第 章 ） 。 转 移 缓 冲 液 （ 见 附 录 第 章 ） 。 封 闭 缓 冲 液 （ 见 附 录 第 章 ） 。 （ 见 附 录 第 章 ） 。 （ 见 附 录 第 章 ） 。 分 离 胶 （ 见 附 录 第 章 ） 。 浓 缩 胶 （ 见 附 录 第 章 ） 。 检 验 程 序 金 黄 色 葡 萄 球 菌 肠 毒 素 检 验 程 序 见 图 。 犛 犖 犜 图 金 黄 色 葡 萄 球 菌 肠 毒 素 犃 检 验 程 序 示 意 图 检 验 步 骤 样 品 制 备 和

12、 对 照 设 置 检 样 以 无 菌 操 作 取 液 体 检 样 ， 加 入 等 体 积 点 样 缓 冲 液 ， 加 热 ， 离 心 。 以 无 菌 操 作 取 固 体 检 样 进 行 均 质 ， 加 入 生 理 盐 水 再 均 质 。 吸 取 均 质 液 ， 粘 稠 样 品 则 可 称 取 ， 加 入 等 体 积 点 样 缓 冲 液 成 为 样 品 制 备 液 ， 加 热 ， 离 心 。 阳 性 对 照 将 标 准 物 质 用 蒸 馏 水 溶 解 制 成 贮 藏 液 。 取 贮 藏 液 ， 用 蒸 馏 水 稀 释 至 ， 使 终 浓 度 为 ， 加 入 等 体 积 点 样 缓 冲 液 。 加

13、 热 ， 离 心 。 犛 犖 犜 空 白 对 照 取 蒸 馏 水 加 入 等 体 积 点 样 缓 冲 液 ， 加 热 ， 离 心 。 制 胶 安 装 制 胶 配 件 。 快 速 向 配 件 内 灌 注 分 离 胶 溶 液 至 三 分 之 二 处 ， 立 即 用 蒸 馏 水 覆 盖 分 离 胶 液 面 至 配 件 顶 端 。 静 置 大 约 ， 待 凝 胶 凝 固 后 与 蒸 馏 水 之 间 形 成 清 晰 的 界 线 ， 吸 干 蒸 馏 水 。 向 配 件 内 凝 固 的 分 离 胶 上 灌 注 浓 缩 胶 溶 液 至 配 件 顶 端 ， 插 入 样 梳 。 凝 固 后 小 心 地 移 除 样

14、 梳 ， 用 水 冲 洗 齿 孔 并 快 速 排 干 。 注 ： 一 些 厂 商 提 供 与 其 仪 器 相 匹 配 的 预 制 胶 。 电 泳 组 装 电 泳 槽 ， 向 电 泳 槽 内 注 入 电 泳 缓 冲 液 。 分 别 取 样 品 制 备 液 、 阳 性 对 照 和 空 白 对 照 ， 点 样 。 每 个 样 品 之 间 以 及 与 阳 性 对 照 之 间 尽 量 分 开 以 减 少 交 叉 污 染 。 在 阳 性 对 照 邻 近 的 齿 孔 加 入 。 选 择 合 适 的 电 压 （ ） 进 行 电 泳 ， 电 泳 时 间 为 或 电 泳 至 溴 酚 蓝 到 达 分 离 胶 底 部

15、 。 印 迹 组 装 转 移 设 备 。 将 硝 酸 纤 维 膜 置 于 转 移 缓 冲 液 中 预 处 理 不 少 于 。 将 电 泳 凝 胶 和 硝 酸 纤 维 膜 组 装 于 转 移 槽 。 组 装 应 在 转 移 缓 冲 液 中 操 作 ， 以 免 产 生 气 泡 。 向 冷 却 槽 加 入 冰 块 ， 检 查 电 极 方 向 并 连 接 电 线 。 恒 流 转 移 ， 转 移 时 间 为 。 确 认 转 移 成 功 后 弃 去 凝 胶 。 免 疫 反 应 封 闭 将 纤 维 膜 置 于 封 闭 缓 冲 液 中 轻 轻 摇 动 孵 育 。 第 一 抗 体 将 抗 血 清 与 封 闭 缓

16、 冲 液 按 照 比 例 混 合 。 将 纤 维 膜 置 于 该 混 合 液 中 轻 轻 摇 动 孵 育 。 洗 涤 将 纤 维 膜 置 于 封 闭 缓 冲 液 轻 轻 摇 动 洗 涤 。 第 二 抗 体 将 抗 血 清 碱 性 磷 酸 酶 与 封 闭 缓 冲 液 按 照 比 例 混 合 。 将 纤 维 膜 置 于 该 混 合 液 中 轻 轻 摇 动 孵 育 。 洗 涤 和 显 色 将 纤 维 膜 置 于 封 闭 缓 冲 液 轻 轻 摇 动 洗 涤 ， 重 复 洗 涤 次 。 加 入 显 色 剂 ， 显 色 时 间 为 左 右 ， 也 可 视 具 体 情 况 而 定 。 干 燥 纤 维 膜 ，

17、 扫 描 并 保 存 图 片 。 结 果 判 断 及 表 述 阳 性 对 照 出 现 预 期 条 带 ， 空 白 对 照 未 出 现 条 带 ， 待 测 样 品 未 出 现 相 应 大 小 的 条 带 ， 则 报 告 阴 性 结 果 。 阳 性 对 照 出 现 预 期 条 带 ， 空 白 对 照 未 出 现 条 带 ， 待 测 样 品 出 现 相 应 大 小 的 条 带 ， 则 需 要 按 对 的 检 验 要 求 进 行 确 认 试 验 。 确 认 试 验 结 果 是 最 终 报 告 结 果 的 依 据 。 本 试 验 检 验 灵 敏 度 为 。 犛 犖 犜 附录犃 （ 规 范 性 附 录 ）

18、 试 剂 配 制 犃 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 贮 液 犃 成 分 丙 烯 酰 胺 甲 叉 双 丙 烯 酰 胺 蒸 馏 水 犃 制 备 将 各 成 分 溶 解 于 蒸 馏 水 ， 过 滤 后 置 棕 色 瓶 中 。 可 贮 存 。 犃 缓 冲 液 将 溶 解 于 蒸 馏 水 。 加 入 盐 酸 ， 加 水 定 容 至 。 犃 缓 冲 液 将 溶 解 于 蒸 馏 水 。 加 入 盐 酸 ， 加 水 定 容 至 。 犃 电 泳 缓 冲 液 将 和 甘 氨 酸 溶 解 于 蒸 馏 水 。 搅 拌 至 完 全 溶 解 。 加 入 十 二 烷 基 磺 酸 钠 。 犃 点 样 缓 冲 液 将 、 甘 油

19、 和 巯 基 乙 醇 。 加 水 定 容 至 。 再 加 入 十 二 烷 基 磺 酸 钠 和 溴 酚 蓝 。 犃 转 移 缓 冲 液 将 和 甘 氨 酸 溶 解 于 蒸 馏 水 。 搅 拌 至 完 全 溶 解 。 犃 转 移 缓 冲 液 将 转 移 缓 冲 液 和 蒸 馏 水 混 合 ， 再 加 入 甲 醇 。 犃 封 闭 缓 冲 液 将 氯 化 钠 和 蒸 馏 水 混 合 。 再 加 入 搅 拌 至 完 全 溶 解 。 加 入 吐 温 轻 轻 的 搅 拌 ， 加 水 定 容 至 。 犃 犿 狅 犾 犔 犜 狉 犻 狊 狆 犎 将 溶 解 于 蒸 馏 水 。 用 盐 酸 调 至 值 至 （ 约

20、 ） ， 加 水 定 容 至 。 犃 犿 狅 犾 犔 犜 狉 犻 狊 狆 犎 将 溶 解 于 蒸 馏 水 。 用 盐 酸 调 至 值 至 （ 约 ） ， 加 水 犛 犖 犜 定 容 至 。 犃 分 离 胶 犃 成 分 缓 冲 液 蒸 馏 水 （ 质 量 浓 度 ） 十 二 烷 基 磺 酸 钠 （ 质 量 浓 度 ） 过 硫 酸 铵 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 贮 液 犃 制 备 将 各 成 分 均 匀 混 合 ， 最 后 加 入 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 贮 液 。 分 离 胶 溶 液 中 过 硫 酸 铵 和 的 比 例 越 低 ， 凝 固 时 间 越 长 。 其 使 用 量 可 根 据 实

21、 际 需 要 调 整 。 犃 浓 缩 胶 犃 成 分 缓 冲 液 蒸 馏 水 （ 质 量 浓 度 ） 十 二 烷 基 磺 酸 钠 （ 质 量 浓 度 ） 过 硫 酸 铵 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 贮 液 犃 制 备 将 各 成 分 均 匀 混 合 ， 最 后 加 入 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 贮 液 。 犛 犖 犜 书 书 书 犜 犖 犛 中 华 人 民 共 和 国 出 入 境 检 验 检 疫 行业标准 进 出 口 食 品 中 金 黄 色 葡 萄 球 菌 肠 毒 素 犃 检 测 方 法电 泳 和 免 疫 印 迹 法 中 国 标 准 出 版 社 出 版 北 京 复 兴 门 外 三 里 河 北 街 号 邮 政 编 码 ： 网 址 电 话 ： 中 国 标 准 出 版 社 秦 皇 岛 印 刷 厂 印 刷 开 本 印 张 字 数 千 字 年 月 第 一 版 年 月 第 一 次 印 刷 印 数 书 号 ： 定 价 元